茶油多酚的碳納米管富集提取方法研究

許 偉 羅 凡 仲山民 費學謙 戚雨婷

(中國林業(yè)科學研究院亞熱帶林業(yè)研究所1，富陽 311400) (浙江農林大學農業(yè)與食品科學學院2，臨安 311300) (漳州城市職業(yè)學院食品工程系3，漳州 363000)

茶油多酚的碳納米管富集提取方法研究

許 偉1,2羅 凡1仲山民2,3費學謙1戚雨婷1,2

(中國林業(yè)科學研究院亞熱帶林業(yè)研究所1，富陽 311400) (浙江農林大學農業(yè)與食品科學學院2，臨安 311300) (漳州城市職業(yè)學院食品工程系3，漳州 363000)

本研究建立了一種利用碳納米管(Carbon Nanotubes，CNTs)富集茶油中多酚新型前處理方法。在考察CNTs物化性質、吸附介質、解吸溶液等對多酚吸附、解吸規(guī)律的基礎上，采用經純化的管徑在20～30 nm、攜帶-COOH的CNTs為吸附劑，1∶10的料液比，以100 r/min、10 ℃恒溫振蕩2 h為吸附條件，以丙酮為解吸液進行超聲輔助解吸，結果發(fā)現(xiàn)：采用CNTs富集茶油中的多酚，用于補償不完全吸附和解吸的補償因子為2.032。當茶油中的多酚質量濃度在4.4～93.0 μg/g，富集后的解吸液的吸光度與茶油多酚濃度呈線性關系，相關系數(shù)(r2)為0.935 1，方法最低檢出限為3.24 μg/g，加標回收率為87.99%～110.95%，相對標準偏差(RSD，n=6)為8.38%～10.74%，校正后的檢測結果與固相萃取法的結果無顯著性差異(P>0.05)。研究結果表明采用CNTs為吸附劑富集、分析茶油中的多酚成分具有穩(wěn)定性好、準確度高等優(yōu)點，為茶油多酚的檢測提供了一條新途徑。

茶油 多酚 碳納米管

茶油，即油茶籽油，是從山茶科山茶屬植物油茶(CamelliaoleiferaAbel)種子中提取的食用植物油。茶油中含有多種功能性活性成分，具有較高的營養(yǎng)價值以及獨特保健功能[1-2]，有著“東方橄欖油”的美稱[3]。茶油的保健功效與茶油中含有的天然性抗氧化成分是密不可分的，油茶多酚作為其中最重要的一種，近些年來受到普遍關注[4-5]。

目前茶油多酚的常用提取方法包括有機溶劑萃取法[6-13]、微波輔助提取法[14]、超臨界流體萃取法[15]、亞臨界流體萃取[16]和固相萃取(Solid-phase Extraction，SPE)法[17-19]等[20-23]。溶劑提取法是最先發(fā)展的提取技術，但它存在著有機溶劑消耗大、回收困難的問題，大量的有毒有害溶劑成為試驗開展中的安全隱患；微波輔助提取法是在溶劑提取法基礎上建立的，也有著有機溶劑消耗大的問題，此外，微波產生的高溫也會使多酚分解，影響最終的提取率。新興的流體萃取法因其高技術、高成本的特點而很難在實驗室以外的地方實現(xiàn)。SPE法有效地減少了有機溶劑的消耗，其過柱速度的可控性提高了結果的準確性。但它同時也存在SPE小柱無法加熱或重復使用、樣品潔凈度要求高等缺陷。

碳納米管(Carbon Nanotubes，CNTs)作為一種新型一維納米材料，由于其巨大比表面積、石墨間的層隙和特殊管狀等結構，而具有機械強度高、耐酸、耐堿和化學性質穩(wěn)定的特點，已經被廣泛應用于分離科學領域[24-25]。在生物質富集領域也有了CNTs的身影，已有研究將其用于雙酚A[26]、4-叔辛基苯酚、苯酚、安息香酸、羥基醌、愈創(chuàng)木酚、3，5-二羥基苯甲酸[27]和鄰苯二甲酸類等極性或非極性物質的富集，試驗結果說明將CNTs用于多酚物質富集是可行的。茶油中多酚的提取由于提取方法的不同缺陷，始終存在提取難、提取率低等問題，本研究用CNTs富集茶油中的多酚，旨在建立高效、安全的多酚提取方法，為進一步分析研究油茶多酚提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與樣品

本試驗所用9種CNTs購自中國科學院成都有機化學有限公司，分別編號為A1、A2、A3、B1、B2、B3、C1、C2、C3，其中A組CNTs內徑小于8 nm，A2、A3分別攜帶有-OH、-COOH；B組CNTs內徑在10～20 nm，B2、B3分別攜帶有-OH、-COOH；C組CNTs內徑在20～30 nm，C2、C3分別攜帶有-OH、-COOH。部分材料純化后使用，純化方法：將CNTs加入1 mol/L的HCl中，在超聲條件下酸化2 h，隨后用去離子水洗至中性，60 ℃條件烘干，備用。

試驗中所用不同品牌市售精煉茶油均為市售，編號為1、2、3、4、5，經測定1號茶油中總酚含量，為26.084 mg/kg，相對標準偏差(RSD，n=4)為11.02%。

1.2 儀器與試劑

SK1200H超聲清洗器：上?？茖С晝x器有限公司；DZG-6030真空干燥箱：上海森信實驗儀器有限公司；THZ-C-1臺式冷凍恒溫振蕩器：太倉市實驗設備廠；Avanti J-E貝克曼高速冷凍離心機：美國貝克曼庫爾特有限公司；UV-2550紫外/可見光分光光度計：日本島津公司；Q-101平行蒸發(fā)儀：瑞士BUCHI公司。

多酚標準品14種(純度)：阿魏酸(99%)、沒食子酸(≥97.5%)、羥基酪醇(98%)、鄰香豆酸(97%)、鄰香草醛(≥99%)、對香豆酸(98%)、綠原酸(≥95%)、高香草酸(≥97%)、苯甲酸(≥99.5%)、表兒茶素(90%)、單寧酸(99%)：美國Sigma-Aldrich公司；原兒茶酸(99%)、兒茶素(99%)、反式肉桂酸(99%)：東京化成工業(yè)株式會社。稱取多酚標品(0.020±0.001)g于25 mL容量瓶中，以少量甲醇(1～2滴)溶解，加入甲醇(或乙腈、乙醚、丙酮)定容并搖勻，配制單標溶液；分別取多酚單標溶液各3 mL于棕色帶蓋玻璃瓶混勻，配制多酚混標溶液，4 ℃保存，試驗中，再根據(jù)要求稀釋后使用。

福林酚試劑：國藥集團化學試劑有限公司；碳酸鈉、氫氧化鈉、乙酸銨、氯化鈉、乙腈、正己烷、甲醇、乙酸、乙醚、丙酮、鹽酸等其他試劑均為分析純。

1.3 試驗方法

1.3.1 茶油中總酚含量的測定

參考羅凡等[4]的SPE法。用10 mL甲醇和10 mL正己烷活化二醇基SPE小柱，稱取2.0 g茶油溶于6.0 mL正己烷中，以1 mL/min速率過柱。隨后依次用10 mL正己烷和10 mL甲醇淋洗，收集甲醇洗脫液，45 ℃濃縮至1 mL。用甲醇水溶液(1∶1)定容至10 mL，離心過濾后對濾液進行總酚含量測定?？偡雍康臏y定參照茶葉及其他蔬果、干果中多酚的測量方法[28-30]，在反復試驗的基礎上確定：樣品用量1 mL，10%福林酚試劑5 mL，7.5%碳酸鈉溶液4 mL，常溫反應1 h，測定波長765 nm。

1.3.2 CNTs富集多酚方法

利用CNTs富集茶油多酚的方法如圖1所示。

圖1 CNTs富集茶油中多酚的流程圖

1.3.3 吸附率、解吸率和補償因子的計算

在用CNTs吸附溶劑中多酚的過程中，記錄母液和吸附殘留液的體積Vm、Vl，用福林酚法分別測出母液和吸附殘留液的多酚濃度cm和cl，用公式(1)即可計算吸附率：

(1)

吸附結束后的CNTs進行干燥，進行解吸后記錄解吸液體積為Vd，用福林酚法測出其多酚濃度cd，用公式(2)計算解吸率：

(2)

在富集茶油多酚的過程中，CNTs無法實現(xiàn)對多酚的完全吸附和解吸，這就造成茶油實際總酚含量與解吸液中的總酚含量不相等。因此，特地引入補償因子(Compensate Factor，CF)，以補償吸附和解吸過程中損失的多酚，從而通過解吸液總酚含量來準確計算出茶油中的實際總酚含量。補償因子CF按照公式(3)進行計算：

(3)

1.3.4 加標回收率試驗

加標工作液的配制：稱取(0.200 0±0.000 1)g沒食子酸標品于100 mL容量瓶中，以少量甲醇(1～2滴)溶解，用丙酮定容并搖勻，為標準液。吸取1 mL標準液于100 mL容量瓶中，用丙酮定容并搖勻，即為工作液，質量濃度是20 μg/mL。以相似方法獲得質量濃度為30、40、60、80、120 μg/mL的工作液。

在2.5 g的1號茶油中添加1 mL質量濃度為30、60、120 μg/mL的加標工作液，在3.5 g茶油中添加1 mL質量濃度為20、40、80 μg/mL的加標工作液，同時設置未加標的茶油空白對照。測定的總酚含量經過校正后得出加標回收率。

1.3.5 盲樣驗證試驗

以2、3、4、5號茶油為樣品，用SPE法和CNTs富集法分別測定總酚含量，來比較其差異性，其中CNTs富集法的結果采用校正后的實際值。

2 結果與討論

2.1 CNTs吸附效率研究

2.1.1 CNTs對甲醇中混合多酚標品的吸附

茶油中含有單寧酸、沒食子酸、兒茶素及肉桂酸等多種多酚成分[31]。在考察CNTs對多種酚類成分的吸附率及不同CNTs的選擇性時發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)CNTs在乙腈、乙醚、丙酮、甲醇中的吸附率在78.43%～95.77%，選擇將甲醇作為沒食子酸、羥基洛醇等14種多酚標品混合的溶劑，來配制多酚混合標品。圖2分別顯示了9種CNTs對混合多酚的吸附效率。

從圖2可以看出，除A1和C2的吸附率略低，分別為84.99%和79.03%，其余7種CNTs的吸附率均高于88.0%，其中A2的吸附率最高，為98.79%。

圖2 CNTs對甲醇中混合多酚標品的吸附率

2.1.2 最佳料液比的確定和CNTs選擇

為進一步確定最優(yōu)的吸附條件，分別將0.05、0.1、0.2、0.5、1 g CNTs加入5 mL多酚的甲醇混合樣標中，9種CNTs對多酚的吸附率如圖3所示。

圖3 不同料液比下CNTs的吸附率

由圖3可知，隨著CNTs用量的增加，CNTs對多酚的吸附也隨之增加，但是當CNTs用量達到0.5g后，吸附率不再隨CNTs用量的增加而增加，這說明0.5 gCNTs達到最大吸附值，此時CNTs的吸附率在83.42%～95.93%之間。綜合考慮吸附率與材料使用率，確定最佳料液比為1∶10(g∶mL)。在此條件下，A2的吸附率為95.93%，C3的吸附率為83.63%。但考慮C3后續(xù)優(yōu)良的解吸率，而將其作為解吸試驗材料。

2.2 多酚從CNTs中解吸的研究

2.2.1 吸附液與解吸液的搭配

多酚從CNTs中解吸的關鍵是解吸液的選擇，本研究考察了吸附液與解吸液的不同搭配方式，分別以乙腈、乙醚、丙酮、甲醇為吸附液，以甲醇、乙酸銨甲醇混合液(0.3 mol/L乙酸銨水溶液∶甲醇=3∶7)、乙腈、丙酮為解吸液。解吸結果如圖4所示。

圖4 溶劑搭配后的解吸率

由圖4可知，當以甲醇和乙酸銨甲醇混合液對CNTs進行解吸時，前6組的解吸率在1.82%～7.98%。而當以甲醇作為吸附液，乙腈和丙酮作為解吸液時，解吸率分別為5.66%和14.03%。特別是以丙酮解吸時，解吸效果是其他的2～7倍。因此，選擇以甲醇作為吸附液，以丙酮為解吸液。

2.2.2 超聲輔助對解吸的影響

以丙酮為解吸液，40 ℃下超聲輔助解吸30 min，150 W，對比恒溫搖床解吸的解吸率提高2.39%，達到12.69%。因此，后續(xù)試驗中采用超聲輔助解吸。

2.2.3 解吸液用量的影響

2.2.3.1 解吸次數(shù)的優(yōu)化

本試驗考察了解吸次數(shù)對解吸效率的影響，結果如圖5所示。

圖5 解吸次數(shù)優(yōu)化

由圖5可知，隨著解吸次數(shù)的增加，多酚從CNTs的解吸也逐漸增加，說明增加解吸次數(shù)對增加解吸的效果明顯。在解吸次數(shù)達到3次時，解吸率為23.11%。但在這之后，解吸率的增加速度減緩，為控制方法的時間，提高解吸率，本試驗將丙酮解吸的次數(shù)確定為3次。

2.2.3.2 單次解吸量的優(yōu)化

為了考察解吸液用量對解吸效率的影響，本試驗分別選擇了10、20、30 mL作為解吸液用量，并分別解吸3次考察解吸效率，其結果如表1所示。

表1 解吸量優(yōu)化圖

由表1可知，當解吸液用量為每管20 mL時，解吸效率平均達28.45%，是3組中效率最高的。因此，確定最佳解吸條件為：20 mL丙酮作為解吸液，每個樣品解吸3次。

2.2.4 CNTs純化的影響

Niu等[27]用1 mol/L的HCl對CNTs純化并將其作為SPE填充物，結果證實純化有效地促進了吸附。為此，本次試驗分別考察了純化對9種CNTs解吸效率的影響，結果如圖6所示。

圖6 CNTs純化的影響

由圖6可知，A、B、C 3類CNTs中，A的平均解吸率為13.49%，B為17.20%，C為22.78%，說明CNTs管徑越大，多酚越容易從中解吸出來；對于攜帶不同官能團的CNTs來說，攜帶有—COOH的A3、B3、C3解吸率較高，平均在20.90%～40.78%，說明—COOH對多酚從CNTs上解吸有促進作用，尤其在純化后，解吸效率分別提高6.42%、0.11%和12.82%；對于A1、B1、C1等未攜帶官能團的CNTs，在經純化處理后解吸率均有所提高，說明了純化有助于提高無官能團CNTs的解吸率；對于攜帶—OH的CNTs如A2、B2、C2，純化前的解吸率反而更加高，說明純化不利于攜帶—OH的CNTs的解吸。

從C類CNTs中，C1、C2、C3的平均解吸率為11.48%、22.51%和34.37%，攜帶有—COOH的C3解吸率較高，尤其經過純化后其解吸率達到了40.78%。因此，選用攜帶有—COOH官能團的CNTs(C3)純化處理后作為吸附材料。

2.3 CNTs富集茶油中多酚的補償因子

以C3為吸附劑，按照優(yōu)化后的吸附參數(shù)富集提取1號茶油中的多酚，經過計算得到吸附率為80.54%，相對標準偏差(RSD，n=8)是9.96%。解吸率為61.13%，相對標準偏差(RSD，n=7)為14.52%。所以，依據(jù)CNTs對茶油中多酚的吸附率和油茶多酚從CNTs中的解吸率，得出補償因子為2.032，在此基礎上建立該方法茶油中總酚含量的校正公式：

TA=2.032·TD

式中：TA為茶油總酚含量的實際值；TD為茶油總酚含量的測定值。

2.4 CNTs富集茶油中多酚方法的驗證

依據(jù)2.3的研究結果， CNTs富集茶油中多酚方法初步建立，吸附劑為純化的C3號CNTs，吸附條件為：恒溫振蕩2 h、100 r/min、溫度10 ℃，解吸條件為：超聲波輔助、20 mL丙酮解吸3次，計算出結果并經校正后得到茶油中總酚含量。

2.4.1 線性范圍

依據(jù)CNTs富集茶油中多酚方法，對不同濃度的茶油溶液中的多酚進行富集，茶油吸附液多酚濃度為自變量，吸光度為應變量，結果如圖7所示。

圖7 解吸液吸光度與茶油多酚濃度關系圖

在4.4～93.0 μg/g的范圍內，茶油解吸液吸光度與其中的多酚濃度有較強的正相關性。

2.4.2 加標回收率和精密度

在茶油中加入加標工作液進行加標回收率的測定，每組重復6次，結果如表2所示。

表2 加標回收率和精密度試驗結果

由表2可知，該方法對茶油中多酚的加標回收率為87.99%～110.95%，RSD(n=6)為8.38%～10.74%，此方法的準確度能夠滿足一般分析要求。

2.4.3 最低檢出限

最低檢出限為20次以上空白測量值的標準差的3倍所對應的濃度，測定結果表明：在90%的置信水平，最低檢出限為3.24 μg/g。

2.4.4 茶油樣品測定

以盲樣來比較CNTs富集法與SPE法的差異，結果如表3所示。在95%的置信水平上，P雙尾=0.355>0.05，兩者無顯著性差異。

表3 盲樣驗證試驗結果

3 結論

本研究建立茶油多酚的CNTs富集檢測方法，采用經純化的管徑在20～30 nm、攜帶—COOH的CNTs為吸附劑，當吸附條件為恒溫震蕩2 h、100 r/min、溫度10 ℃，解吸條件為超聲波輔助、20 mL丙酮解吸3次時，CNTs對茶油中多酚的吸附率和解吸率分別為80.54%和61.13%，用于補償不完全吸附和解吸的補償因子為2.032。當茶油中多酚濃度在4.4～93.0 μg/g內，解吸液的吸光度與茶油多酚濃度呈線性關系，相關系數(shù)(r2)為0.935 1，方法最低檢出限為3.24 μg/g，加標回收率為87.99%～110.95%，RSD(n=6)在8.38%～10.74%，校準的檢測結果與SPE法無顯著性差異(P>0.05)。

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Analysis on Polyphenol Extraction in Oil-TeaCamelliaSeed Oil by Accumulation of CNTs

Xu Wei1,2Luo Fan1Zhong Shanmin2,3Fei Xueqian1Qi Yuting1,2

(Research Institute of Subtropical Forestry, Chinese Academy of Forestry1, Fuyang 311400) (School of Agricultural and Food Science, Zhejiang A&F University2, Lin'an 311300) (Department of Food Engineering, Zhangzhou City College3, Zhangzhou 363000)

This study developed a new pre-treatment method of polyphenol in oil-teacamelliaseed oil through the accumulation of CNTs. On the basis of investigating the physico-chemical property of CNTs, adsorption medium, desorption solution on the adsorption and desorption of polyphenol standard product, we took purified CNTs as adsorbent, which were 20～30 nm in diameter and carried much-COOH, 1∶10 as material/liquid ratio. and the adsorption conditions were as follows: shaking table at constant temperature of 10 ℃ by 2 h, the velocity was 100r/min. After that CNTs were desorpted by 20 mL actone added with ultrasonic, which repeated 3 times. Finally we found that the compensate factor of the method which was used to compensate for incomplete adsorption and desorption was 2.032. When the concentration of polyphenol in oil-teacamelliaseed oil was between 4.4 and 93.0 μg/g, the absorbance of desorption solution presented a good linear relationship with the concentration of polyphenol in oil-teacamelliaseed oil, the correlation coefficient (r2) was 0.935 1. The minimum determination limit of the method was 3.24 μg/g and the recoveries were between 87.99% and 110.95% with relative standard deviation (RSD,n=6) between 8.38% and 10.74%. There’s no significant difference between the results of this method and those of Dio-SPE(P>0.05). The results showed that the method which taken CNTs as adsorbent to analysis the polyphenol in oil-teacamelliaseed oil had the advantage of high stability and accuracy, which provided a new mode of polyphenol determination in oil-teacamelliaseed oil.

oil-teacamelliaseed oil, polyphenol, carbon nanotubes

TS229

A

1003-0174(2017)11-0076-07

中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務費專項資金(CAFYBB2014QA007)

2016-11-09

許偉，男，1990年出生，碩士，食品加工與安全

羅凡，女，1980年出生，博士，經濟林產品加工利用