基于Miseq法納豆凍干粉對小鼠腸道菌群影響的研究

黃占旺 王素貞 吳高峰 吳少福 黃永平 陳佳妮

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院；江西省天然產(chǎn)物與功能食品重點實驗室，南昌 330045)

基于Miseq法納豆凍干粉對小鼠腸道菌群影響的研究

黃占旺 王素貞 吳高峰 吳少福 黃永平 陳佳妮

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院；江西省天然產(chǎn)物與功能食品重點實驗室，南昌 330045)

抗生素近年來被濫用，它抑制或殺死微生物使得機體菌群失調(diào)。因此找出一種抗生素的安全有效替代物非常有必要，而益生菌是一種有效的替代物。本研究以納豆凍干粉為原料，正常小鼠和腸道菌群失衡小鼠為動物試驗?zāi)Ｐ?，采用體內(nèi)灌胃試驗和Miseq方法研究納豆凍干粉對小鼠腸道菌群的影響并進行生物信息分析。分析多樣本間的腸道菌群多樣性和單樣本屬水平上的分類情況；分析納豆芽孢桿菌及益生菌、致病菌的菌數(shù)變化情況。預(yù)期的研究結(jié)果為揭示納豆芽孢桿菌的腸道菌群調(diào)節(jié)機理提供科學(xué)依據(jù)，對人類健康和傳統(tǒng)發(fā)酵食品微生物的開發(fā)具有十分重要的意義。

納豆凍干粉 腸道菌群 Miseq法 多樣性

抗生素近年來被廣泛濫用[1]，正常腸道菌群被殺滅，導(dǎo)致有害菌繁殖并引起菌群失調(diào)，激起機體免疫反應(yīng)[2]?？股卦跉⑺兰?xì)菌的同時會篩選耐藥細(xì)菌，使得抗生素失去治療效果。因此尋找一種安全并且對機體腸道有益的抗生素替代物非常有必要。

納豆是由納豆芽孢桿菌發(fā)酵大豆制成的，不僅保有大豆的營養(yǎng)價值，而且還富含維生素K2等活性成分[3-4]，能有效提高蛋白質(zhì)的消化吸收率[5]，具有溶解體內(nèi)纖維蛋白[6]、防治“三高”、溶血栓、醒酒等功能[7]。近年來，研究者對于納豆芽孢桿菌的研究越來越多，包括納豆菌的選育以及納豆菌與其他功能成分復(fù)合研究、納豆激酶的研究及產(chǎn)品開發(fā)等。然而，納豆的研究還存在不足，納豆中的一些功能性物質(zhì)未探究清楚，納豆凍干粉對腸道菌群的影響缺乏全面分析。高通量測序方法(Miseq方法)是最近10年新興發(fā)展起來的免培養(yǎng)分子生物學(xué)技術(shù)，又稱新一代測序技術(shù)。目前，高通量測序技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于動物腸道、食品、土壤、根際、植物內(nèi)部、水體等多種微生態(tài)的研究中[8]，有助于全面了解食品中微生物群落動態(tài)和生理活性，以便提高食品質(zhì)量和控制其微生物安全[9]。因此，本研究以納豆凍干粉為原料，正常小鼠和抗生素建立腸道菌群失衡小鼠為動物模型，采用體內(nèi)試驗和Miseq方法研究納豆凍干粉對小鼠腸道菌群的影響并進行生物信息分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

納豆凍干粉(NLP)：實驗室自制；KM小鼠：雌性SPF級，湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司，動物質(zhì)量合格證號:SCXK(湘)2011-0003，飼料質(zhì)量合格證號:SCXK(湘)2014-0002；鹽酸林可霉素(批號：20130902)、氨芐青霉素(批號：104D038)：Solarbio公司；頭孢唑啉鈉：梯希愛TCI(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司；FastDNA Soil Kit：美國MP Biomedicals公司。

1.2 主要儀器設(shè)備

TDL-5-A低速離心機：上海安亭科學(xué)儀器廠；凝膠電泳成像系統(tǒng)：美國Kodak公司；PCR反應(yīng)儀：美國BioRad公司；高通量測序儀：中國Illumina公司；生物分析儀：美國Agilent technologies公司；NanoDrop?ND～1000：美國NanoDrop Technologies公司。

1.3 方法

1.3.1 納豆凍干粉的制備：

取300 g左右大豆，洗凈浸泡20 h并不斷換水，在121 ℃下蒸煮30 min，用手捏碎即可，在溫度降到不燙手時，加入10%的納豆芽孢桿菌菌液于大豆表面，充分?jǐn)嚢杈鶆?，?7 ℃生化培養(yǎng)箱中固態(tài)發(fā)酵24 h，然后等其降到室溫時放入4 ℃冰箱中后熟12 h，加入15%脫脂奶粉，真空冷凍干燥后，用高速粉碎機粉碎，即制成納豆凍干粉。

1.3.2 樣品采集

KM雌性小鼠128只，18～22 g，在SPF小鼠生長環(huán)境下飼養(yǎng)。小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d，隨機分為8個組，每組16只，組間體重差異不大于0.5 g。把NLP配制成10、100、400 mg/mL的溶液。選取1組為空白對照組A，灌胃生理鹽水；其余組灌胃抗生素混合溶液(鹽酸林可霉素、頭孢唑林鈉、氨芐青霉素，濃度均為100 mg/mL)建模3 d后，隨機選取4組作為調(diào)節(jié)組，B組灌胃生理鹽水，F(xiàn)～H灌胃3個劑量的NLP；L組作為模型組，灌胃抗生素溶液。試驗期為30 d，灌胃量均為0.5 mL/只。每天16點無菌收集小鼠糞便，置于標(biāo)記好的EP管中，-80 ℃下保存。取0、3、18、33、48 d 5時間點(5個時間點之間的時間段分別稱為Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ期)的小鼠糞便樣品進行后續(xù)DNA提取。

1.3.3 DNA提取

每個樣品分別稱取約500 mg后利用FastDNA Soil Kit提取各樣品的總DNA，使用NanoDrop?ND～1000對提取的總DNA樣品進行濃度和純度檢測。

1.3.4 PCR擴增及純化

參照文獻[10]方法進行操作。

1.3.5 建庫及Miseq測序

參照文獻[11]方法進行操作。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

參照Pala-Ozkok等[12]的方法，進行序列篩選，數(shù)據(jù)降噪分析，獲得樣品中微生物群落結(jié)構(gòu)信息。

1.3.7 生物信息分析(DNA STAR)

進行序列分析，得出物種分類；分析多樣本間的多樣性；另外對單樣本屬水平上的分類情況進行分析；對納豆芽孢桿菌、益生菌、致病菌菌數(shù)的變化進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR結(jié)果分析

經(jīng)過PCR，樣品濃度均大于20 mg/mL，A260/A280均在1.80～2.00之間，說明DNA提取的質(zhì)量高，可用于后續(xù)試驗。

2.2 序列信息和多樣性指數(shù)

由表1可見，操作分類單元系數(shù)AL、BL、HL差異極顯著；菌種豐富度系數(shù)AL、BL差異極顯著，HL差異顯著；香農(nóng)系數(shù)除了BG、BL、FH、GL差異不顯著，其余各組間均差異極顯著；辛普森系數(shù)AF、AH、BF、BH、FG、FH、FL、GH、HL差異極顯著，其余各組差異不顯著；測序深度系數(shù)AB、AF、AG、AH、AL差異極顯著，BF差異顯著。本試驗研究表明，在建模前群落中物種以乳酸桿菌最多，達(dá)到63.08%，其次是擬桿菌屬為12.89%，革蘭氏陽性菌較革蘭氏陰性菌多，益生菌多于致病菌，說明建模前腸道處于一種健康的狀態(tài)。建模后，腸道菌群大量死亡。灌胃期，通過灌服NLP，腸道菌數(shù)顯著增加。

2.3 屬水平上的分類情況

圖1可見，Ⅰ期共檢測出160個科、409個屬，主要由乳酸桿菌屬、擬桿菌屬、副擬桿菌屬、別樣桿菌屬、理研桿菌屬、雙歧桿菌屬、小螺菌屬、臭氣桿菌屬、生物分類地位未定的TM7屬等組成，分別占到總菌屬的63.08%、12.89%、4.71%、3.89%、2.16%、1.54%、1.31%、1.26%、1.16%、0.55%。Ⅱ期共檢測出150個科、365個屬，主要由擬桿菌屬、乳酸桿菌屬、腸桿菌屬、副擬桿菌屬、十八號梭菌屬、假單胞菌屬以及克雷伯氏菌屬構(gòu)成，它們分別占到總菌屬的34.03%、33.31%、17.24%、9.36%、0.50%、0.45%、0.40%。乳酸桿菌屬、螺旋菌屬、雙歧桿菌屬較建模前極顯著降低，而擬桿菌屬、副擬桿菌屬、腸桿菌屬的占比都極顯著增加，副薩特氏菌、克雷伯氏菌屬、腸球菌屬、埃希氏菌屬/志賀氏菌，糞桿菌屬等的比例都顯著升高。模型組中腸桿菌屬占到總菌屬的92.86%，而乳酸桿菌屬只占2.80%，說明抗生素的攝入會改變腸道菌群結(jié)構(gòu)，益生菌如乳酸桿菌屬、雙歧桿菌屬的數(shù)量減少而致病菌如埃希氏菌屬、志賀菌屬、糞桿菌屬等菌屬的比例升高。Ⅲ期主要檢測出143科、341屬，主要由乳酸桿菌、擬桿菌屬、腸桿菌屬、副擬桿菌屬、十四號a梭菌屬、螺旋桿菌、十八號梭菌屬、別樣桿菌屬、布勞特氏菌屬、克雷伯氏菌屬等構(gòu)成，它們分別占總菌屬的39.16%、25.64%、12.79%、7.82%、5.39%、0.89%、0.81%、0.79%、0.76%、0.62%。該期與灌胃前期相比，乳酸桿菌屬、別樣桿菌屬的比例極顯著升高，而擬桿菌屬、腸桿菌屬、副擬桿菌屬的比例顯著降低，乳球菌屬、腸桿狀菌屬、雙歧桿菌屬等占比有所提高，并且在這個時期出現(xiàn)了灌胃后期未檢測到的中村氏菌屬、布勞特氏菌屬、動膠菌屬、羅賓遜氏菌屬等。模型組主要由腸桿菌屬及十四號a梭菌屬和布勞特氏菌屬組成，三者占到總菌屬的88.75%，而乳酸桿菌屬僅占到2.21%，說明隨著抗生素的持續(xù)使用，會造成菌群嚴(yán)重不平衡，從而影響腸道的正常生理功能。Ⅳ期共檢測出132科、280屬，主要由乳酸桿菌屬、擬桿菌屬、副擬桿菌屬、螺旋桿菌屬、別樣桿菌屬、糞桿菌屬、十八號梭菌屬、生物分類地位未定的丹毒絲菌屬、副薩特氏菌屬以及腸桿菌屬等，分別占總菌屬的50.05%、24.46%、11.59%、2.86%、1.46%、1.27%、1.17%、1.10%、0.55%、0.47%。該期乳酸桿菌屬、糞桿菌屬、螺旋桿菌屬、別樣桿菌屬的比例顯著增加，腸桿菌屬、克雷伯氏菌屬極顯著降低，生物分類地位未定的丹毒絲菌屬、解黃酮菌屬極顯著增加。由上可知，抗生素會造成腸道菌群的嚴(yán)重失衡，而NLP能夠有效調(diào)控腸道菌群的比例，從而維持腸道的正常生理功能。

表1 NLP對各組腸道菌群多樣性指數(shù)的影響結(jié)果

圖1 NLP對小鼠腸道菌群的屬水平上的分類情況影響注：圖從左往右分別為Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ期

2.4 聚類分析

2.4.1 基于OTU的聚類分析(97%相似度)

由圖2可見，在Ⅰ期，模型組與其他各組之間的OTU為1時，它們的相似度小于0.33，當(dāng)OTU為2時，相似水平小于0.51，OTU為3時，相似水平小于0.52，OTU大于12時，樣本之間的相似性達(dá)到80%以上，且模型組的相似水平最高為0.79。在Ⅱ期，由于抗生素建模，導(dǎo)致腸道中菌群數(shù)量及比例發(fā)生變化，模型組與其他各組的相似性僅為0.07，較建模前極顯著下降。各個組之間的相似性都有所提高，OTU為1時，相似性僅為0.07，OTU為2時相似性為0.52，OTU大于10，各組的相似性超過80%，模型組的相似性達(dá)到0.96，高于建模前的水平。灌胃后期當(dāng)OTU為1時，模型組與其他組間相似性為0.09，較灌胃前期有所增加，各組之間的相似性繼續(xù)提高，而模型組之間的相似性有所下降為0.87，當(dāng)OTU為2時，模型組與其余組之間的相似性小于0.59，當(dāng)OTU大于10時，樣本間的相似性超過80%。停灌期模型組與其余各組間的相似性繼續(xù)增加，達(dá)0.2，且各個組之間的OTU相似度都顯著升高，與建模前差異不顯著，當(dāng)OTU大于6時，各組間的相似性大于80%。

圖2 NLP對小鼠腸道菌群基于OUT水平上的聚類分析結(jié)果

2.4.2 基于屬水平的聚類分析

由圖3可見，建模前期主要屬為乳酸桿菌屬、擬桿菌屬、別樣桿菌屬、副擬桿菌屬、螺旋桿菌屬、雙歧桿菌屬、厭氧棍狀菌屬、厭氧貪食菌屬、臭氣桿菌屬和理研菌屬等。各組之間的屬水平相似度大于0.58，F(xiàn)組屬水平相似度最高為0.91，BGH與A、L之間在屬水平差異不顯著，各組的相似度均在60%以上。灌胃前期與建模前相比種屬比例發(fā)生變化，除模型組與其他各組間的差異極顯著增大，其相似性僅為0.07，而其他各組間的相似度都在80%以上，F(xiàn)G兩組的相似度最高達(dá)到0.9，與建模前相比，ABFGH各組間的相似度較建模前顯著升高，而根據(jù)2.3節(jié)的結(jié)果顯示各組間相似度高的主要菌群為乳酸桿菌屬、擬桿菌屬、副擬桿菌屬、假單胞菌屬，十四號梭菌屬、雙歧桿菌屬、糞桿菌屬、副薩特氏菌屬和螺旋桿菌屬等，平均的相似度達(dá)到0.82。并且與A、B兩組相比，F(xiàn)GH三組的相似度較建模前都顯著增加，說明中劑量的NLP對小鼠的腸道菌群的調(diào)控作用更強，更有利于腸道菌群的恢復(fù)。由結(jié)果可知，灌胃后期AB組的屬水平相似度保持不變，BF相似度有所提高，與模型組相比，各組相似度略微增加，而其余各組相似度都較灌胃前期有所下降，可見灌胃后期NLP對腸道菌群的調(diào)控作用更強。停灌期模型組與其余各組的相似度極顯著增加達(dá)到0.23，停灌后AB組的相似度較灌胃后期顯著增加達(dá)到0.92，AF的相似度最高為0.94，BF的相似度較灌胃后期也繼續(xù)增加達(dá)到0.92，說明低劑量的NLP能夠在停止灌胃后，繼續(xù)作用腸道，調(diào)控腸道菌群的組成和比例，使其恢復(fù)到腸道正常水平組成。

圖3 NLP對小鼠腸道菌群基于屬水平上的聚類分析結(jié)果

2.5 Unifrac.Weighted分析

表2表明，在不同的組之間存在差異，AH、HL、BL、FL、GL、AL與AA、AB、AF、BB、BF、FF、FG、GG、HH、LL，HL、BL、FL、GL、AL與AG、BG，GH與AL、BL、FL、GL，F(xiàn)H與BL、FL、GL，BL與BH，BH與AA、FF、GG、LL，F(xiàn)H、GH與AA、FF、LL，LL與AG、BG差異極顯著；BL與AH，F(xiàn)L、GL與AH、BH，AL與FH，HL與FH、GH，BH與AB、AF、BB、BF、FG、HH，AG、BG與AA、FF，LL與AB、AF、BB、FG、HH差異顯著。在幾個不同的時間點上，各樣品的微生物群落結(jié)構(gòu)的差異性與灌胃時間和取樣時間無相關(guān)聯(lián)系。在其分組的組數(shù)中，由于對各組進行了不同劑量的納豆凍干粉制劑的灌胃使得腸道中的微生物發(fā)生改變，從而導(dǎo)致樣本之間的差異性與試驗之前不同，產(chǎn)生了差異。

2.6 納豆菌、益生菌、致病菌的變化情況

圖4顯示，納豆菌的比例在建模前為0.03%，在建模后，納豆菌的比例逐漸增加，在灌胃前期納豆菌的比例為0.23%，灌胃后期納豆菌的比例達(dá)到0.25%，在停止灌胃后，納豆菌的比例為0.16%。納豆菌在各期腸道菌群中的比例不同，在灌胃前期排第10位，建模后期12位，停灌后14位，說明納豆菌的定植能力極強，能夠有效的抵抗抗生素的作用。結(jié)果表明：建模前益生菌的比例為43.08%，致病菌的比例為0.81%，益生菌和致病菌的比值(簡稱益致比)為53.19；建模后灌胃NLP，益生菌的比例顯著降低至28.87%，致病菌的比例極顯著增加至15.53%，益致比極顯著降至1.86；灌胃后期益生菌的比例有所增加，達(dá)到30.99%，而致病菌的比例下降至11.20%，益致比增至2.71；停止灌胃后，腸道菌群自由恢復(fù)，由于沒有抗生素的介導(dǎo)，NLP對腸道菌群的調(diào)控作用繼續(xù)增加，益生菌的比例繼續(xù)增加，達(dá)到39.20%，而致病菌的比例極顯著降低至1.28%，益致比極顯著增至30.63%，這與建模前的水平差異不顯著。益生菌和益致比的水平在建模前最高，而建模后極顯著降低，在灌胃NLP后逐漸恢復(fù)，停灌后基本達(dá)到建模前的水平，呈現(xiàn)“V”型曲線，而致病菌的變化正好相反。

注：圖b是圖a中3個變量相互間對應(yīng)灌胃時期的比例。圖4 納豆菌、益生菌、致病菌及其三者比例變化情況

表2 Unifrac.Weighted分析結(jié)果

AAABAFAGAHALBB(1)00895±00094efHI0145±00976deFGHI01437±00472deFGHI02019±00692cdEFGH02854±01494bcABCDE03546±01555abABC01402±00481deFGHIBFBGBHBLFFFGFH0138±00357defFGHI01997±00714cdEFGH02662±01508bcBCDE03986±01774aA00894±00188efHI01588±00517deFGHI02336±01571cdCDEFGFLGGGHGLHHHLLL03872±01759aAB01352±0032defGHI02282±01052cdDEFG03891±01746aAB01443±00269deFGHI03305±01649abABCD00437±00229fI(2)ⅠⅡⅢⅣ02823±01646aA02753±01596aA02823±0163aA02769±01578aA

注：(1)為不同組之間的Unifrac weighted的值。(2)為不同時間點上的組間差異。

3 討論與結(jié)論

納豆菌能產(chǎn)生大量芽孢，耐熱性強，耐酸性強，因此能夠順利到達(dá)腸道并且發(fā)揮作用。益生菌是一種對宿主有益的活性微生物[13]，是定植于人體腸道、生殖系統(tǒng)內(nèi)[14]，能產(chǎn)生確切健康功效從而改善宿主微生態(tài)平衡、發(fā)揮有益作用的活性有益微生物的總稱。人體、動物體內(nèi)有益的細(xì)菌或真菌主要有：酪酸桿菌、乳酸菌，雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、放線菌、酵母菌等[15]。本試驗檢測到的益生菌主要有乳酸菌、雙歧桿菌、放線菌、嗜酸乳桿菌等；致病菌主要有腸桿菌科，包括大腸桿菌，腸球菌，變形桿菌，大腸埃希氏菌，沙門氏菌，志賀氏菌等。致病菌在腸道中能夠大量繁殖，釋放毒素，侵襲腸道黏膜上皮細(xì)胞，引起細(xì)胞死亡造成潰爛[16]。本試驗中致病菌在建模前數(shù)量很大，但是經(jīng)過建模期，致病菌的數(shù)量減少，而在灌胃期致病菌的數(shù)量顯著減少，說明納豆菌能夠抑制致病菌的生長繁殖，減少致病菌的定植。陳兵等[17]發(fā)現(xiàn)納豆芽孢桿菌增加了腸道厭氧菌群中的乳酸菌、雙歧桿菌、梭菌、擬合桿菌等的數(shù)量，部分需氧菌數(shù)量下降。黃俊才等[18]發(fā)現(xiàn)納豆芽孢桿菌顯著性的增加了仔豬結(jié)腸內(nèi)容物中乳酸菌、雙歧桿菌的數(shù)量，與甘露聚糖聯(lián)用時顯著的降低了大腸桿菌數(shù)量。吳德華等[19]研究發(fā)現(xiàn)不同濃度的納豆芽孢桿菌能夠顯著增加乳酸菌數(shù)量而降低大腸桿菌量，不含有納豆芽孢桿菌時大腸桿菌數(shù)量顯著上升。祁紅兵等[20]研究納豆菌的米糠發(fā)酵物對小鼠腸道菌群的調(diào)節(jié)，發(fā)現(xiàn)納豆芽孢桿菌及其米糠發(fā)酵成分均對小鼠的腸道正常菌群具有調(diào)節(jié)作用，兩者復(fù)合效果更佳；尹惠霖[21]發(fā)現(xiàn)飼料中添加納豆芽孢桿菌能夠顯著改善腸道微生態(tài)環(huán)境，能有效促進乳酸菌的生長，且對致病菌具有顯著的抑制作用；熊峰[22]發(fā)現(xiàn)納豆芽孢桿菌制劑對肉雞腸道的大腸桿菌、沙門氏菌具有抑制作用，對乳酸菌具有顯著的增殖作用。

PCR分析結(jié)果可用于后續(xù)的試驗；多樣性指數(shù)隨著NLP的劑量的增加，菌種豐富度指數(shù)逐漸增大，香農(nóng)系數(shù)先增大后減小，辛普森系數(shù)和測序深度系數(shù)先減小后增大，發(fā)現(xiàn)中劑量NLP調(diào)節(jié)組的多樣性水平更高；從屬水平上看，乳酸桿菌屬在建模后，灌胃前期極顯著降低，灌胃后期顯著升高，停灌后繼續(xù)升高，最后接近正常水平，而擬桿菌屬和腸桿菌屬正好相反，模型組主要以腸桿菌屬為主，停灌后主要以擬桿菌屬和副擬桿菌屬為主；從屬水平的聚類分析結(jié)果表明，建模前各處理間的相似度大于0.58，建模后腸道菌群顯著變化，灌胃前期的相似度僅為0.07，灌胃后期略微上升，在停灌后的相似度達(dá)到0.23；在建模后灌胃NLP，灌胃前期納豆菌的比例為0.27%，灌胃后期達(dá)到0.32%，停灌后納豆菌的比例為0.21%；益生菌和益致比的水平在建模前最高，而建模后極顯著降低，在灌胃NLP后逐漸恢復(fù)，停灌后基本達(dá)到建模前的水平，呈現(xiàn)“V”型曲線，而致病菌的變化正好相反；結(jié)果表明，NLP能夠有效調(diào)節(jié)抗生素介導(dǎo)的小鼠腸道菌群水平。本試驗研究結(jié)果為揭示納豆芽孢桿菌的腸道菌群調(diào)節(jié)機理提供科學(xué)依據(jù)，對人類健康和傳統(tǒng)發(fā)酵食品微生物的開發(fā)具有十分重要的意義。

[1]劉玉軍,張曉峰.抗生素濫用的危害及防范[J].中外醫(yī)療,2012,973(1):188-189

Liu Y P，Zhang X F.The harm and prevention of abuse of antibiotics[J].Chinese and Foreign Medical，2012,973(1)：188-189

[2]Carles Ubeda,Eric G.Pamer.Antibiotics,microbiota,and immune Defense[J].Trends in Immunology,2012,33(9):459-466

[3]陶湘林,歐陽晶,黃璇,等.一種日本納豆粉的成分分析[J].農(nóng)產(chǎn)品加工(學(xué)刊),2012(8):33-35

Tao X L，Ouyang J，Huang X，et al.The composite analysis of one of Japanese natto powder[J].Academic Periodical of Farm Products Processing,2012(8):33-35

[4]齊鳳蘭,奚銳華,陳有容.納豆中營養(yǎng)與活性成分的分析研究[J].中國食物與營養(yǎng),2004(2):33-35

Qi F L，Xi R H，Chen Y R.The study on nutrition and active components in natto[J].Chinese Journal of Food and Nutrition,2004(2):33-35

[5]安曉瓊,李夢琴.納豆的生理功能[J].食品與藥品,2006,8(01A):68-71

An X Q，Li M Q。The physiological functions of natto[J].Food and Drug,2006,8(01A):68-71

[6]須見洋行.納豆キナーゼと線溶系[J].化學(xué)と生物,1991,29(2):119-123

Hiroyuki S.Natto kinase and soluble system[J].Chemistry and Creatures,1991,29(2):119-123

[7]沈柱英,黃占旺,曹靖文.納豆菌糖肽對免疫功能低下小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用[J].營養(yǎng)學(xué)報,2014(4):381-385

Shen Z Y，Huang Z W，Cao J W.The immunoregulating effect of bacillus natto glycopeptides in immno-supperssed mice[J].Journal of Nutrition,2014(4):381-385

[8]Ercolini D.High-throughput sequencing and metagenomics:moving forward in the culture-independent analysis of food microbial ecology[J].Applied and Environmental Microbiology,2013,79(10):3148-3155.DOI:10.1128/AEM.00256-13

[9]米其利,李雪梅,管瑩,等.高通量測序在食品微生物生態(tài)學(xué)研究中的應(yīng)用[J].食品科學(xué),2016(23):302-308

Mi Q L，Li X M，Guan Y，et al.Application of high-throughput sequencing in food microbial ecology:a review[J].Food Science，2016，37(23):302-308

[10]張帥.2,4-二硝基苯甲醚的零價鐵強化生物還原技術(shù)研究[D].南京:南京理工大學(xué),2015:24-25

Zhang S.Study on enhanced biological reduction treatment technology of 2,4-dinitroanisole by zero-valent iron[D].Nanjing:Nanjing University of Science & Technology,2015:24-25

[11]陳燕.缺氧狀態(tài)下吡啶的生物強化降解技術(shù)研究[D].南京:南京理工大學(xué),2015:55-56

Chen Y.The bioaugmentation technology of prydine under anoxic conditions[D].Nanjing:Nanjing University of Science & Technology,2015:55-56

[12]Pala-Ozkok I,Rehman A,Yagci N,et al.Characteristics of mixed microbial culture at different sludge ages:Effect on variable kinetics for substrate utilization[J].Bioresource Technology,2012,126(6):274-282.

[13]Scharek L,Guth J,Reiter K,et al.Influence of a probioticEnterococcusfaeciumstrain on development of the immune system of sows and piglets[J].Veterinary Immunology and Immunopathology,2005,105(1,2):151-161.

[14]郭彤,胥保華,馬玉龍,等.嗜酸乳桿菌和兩歧雙歧桿菌體外粘附Caco-2細(xì)胞及其對病原菌粘附性能的影響[J].中國獸醫(yī)學(xué)報,2008,28(5):527-531

Guo T，Xu BH，Ma YL，et al.In vitro properties of adhered to caco-2 cells of lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium bifidum and their antagonistic activity against pathogen and discuss their mechanisms[J].Chinese Journal of Veterinary Science,2008,28(5):527-531

[15]蔡凱凱,黃占旺,葉德文,等.益生菌調(diào)節(jié)腸道菌群及免疫調(diào)節(jié)作用機理[J].中國飼料,2011(18):34-37

Cai K K，Huang Z W，Ye D W，et al.The mechanism of probiotics which regulate intestinal flora and immunomodulatory effects[J].Chinese Feed,2011(18):34-37

[16]張英春,韓雪,單毓娟，等，益生菌抑制致病菌作用的機制研究進展[J].微生物學(xué)通報,2012(9):1306-1313

Zhang Y C，Han X，Shan Y J，et al.Recent advances in mechanism on probiotic bacteria inhibition of pathogens[J].Bulletin of Microbiology,2012(9):1306-1313

[17]陳兵,朱鳳香,陳巧云,等.納豆芽孢桿菌分離純化及對大白鼠腸道微生態(tài)系統(tǒng)的影響[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報,2003,15(4):223-227

Chen B，Zhu F X，Chen Q Y，et al.Isolation and purification of bacillus natto sawamura and its effect on the intestinal microecology systems[J].Journal of Zhejiang Agricultural sciences,2003,15(4):223-227

[18]黃俊才,林映才,馮定遠(yuǎn),等.納豆菌、甘露寡糖對仔豬腸道pH、微生物區(qū)系及腸黏膜形態(tài)的影響[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報,2005,36(10):1021-1027

Huang J W，Lin Y C，F(xiàn)eng D Y，et al.Effect of natto and intestinal pH,colonic microflora population and intestinal membrane shape of early weaning piglet[J].Journal of Animal Science and Veterinary Medicine,2005,36(10):1021-1027

[19]吳德華,杜莉,徐漢坤,等.納豆芽孢桿菌對仔犬日增重和腸道菌群的影響[J].家畜生態(tài)學(xué)報,2009,30(3):64-67

Wu D F，Du L，Xu H K，et al.Effect of bacillus natto on the growth and intestinal microbiota in weaning canines[J]. Journal of Animal Science and Veterinary Medicine,2009,30(3):64-67

[20]祁紅兵,陳玉棟,陳鈞.納豆菌的米糠發(fā)酵物對小鼠腸道菌群的調(diào)節(jié)[J].中國糧油學(xué)報,2010(4):61-64

Qi H B，Chen Y D，Chen J.Regulation ofbacillusnatto subtilis fermented on intestinal microflora in mice[J].Journal of the Chinese Cereals and Oils Association，2010(4):61-64

[21]尹惠霖,納豆芽孢桿菌對草魚幼魚生理生化指標(biāo)和腸道功能的影響[D].長沙：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué),2014

Yin H L.Effect ofbacillusnatto on physiological indexes,biochemical indexes and intestinal function of juvenile grass carp[D].Changsha: Hunan Agricultural University,2014

[22]熊峰.大豆低聚糖和納豆芽孢桿菌制劑及其組合對肉雞生產(chǎn)性能、腸道消化酶及菌群平衡的影響[D].烏魯木齊：新疆農(nóng)業(yè)大學(xué),2008

Xiong F.Effect of soybean-oligosaccharides,bacillusnatto preparation and their combination on production capability,intestinal digestiye enzyme and microflora in broilers[D].Wulumuqi:Xinjiang Agricultural Univesity,2008.

Effect of Natto Lyophilized Powder on Intestinal Flora of Mice Based on Miseq Method

Huang Zhanwang Wang Suzhen Wu Gaofeng Wu Shaofu Huang Yongping Chen Jiani

(College of Food Science and Engineering,Jiangxi Agricultural University;Jiangxi Key Laboratory of Natural Products and Functional Food,Nanchang 330045)

Antibiotics was abused in recent years,and it inhibits or kills microbes,which made the body dysbacteriosis.Therefore,it is very necessary to look for a safe and effective antibiotic replacement,and probiotics is an effective alternate.Natto lyophilized powder was the raw material and the normal mice and low intestinal flora in mice was used as animal testing model.In vivo gavage experiment and Miseq method were used to study the effect of natto lyophilized powder on mice intestinal flora.Further the biological information of mice was analyzed.The diversity of intestinal flora among multiple samples and the classification of the single sample’s level were analyzed.Ultimately,the changes in the number of bacteria in Bacillus natto and probiotics and pathogens were analyzed. The expected results provided the scientific basis of revealing the regulating mechanism of bacillus natto on the intestinal flora,and had a very vital significance for human health and the development of the traditional fermented food microorganism.

natto lyophilized powder,intestinal flora,miseq method,diversity

R151

A

1003-0174(2017)11-0026-08

國家自然科學(xué)基金(31160337)

2016-10-18

黃占旺，男，1964年出生，教授，食品微生物與發(fā)酵代謝產(chǎn)物