離子色譜法快速測定白酒中多種有機(jī)酸和陰離子

宋衛(wèi)得,李兆杰,楊立明,王 凱,高堯華,李林杰,姜維珍

(1.日照出入境檢驗(yàn)檢疫局,山東 日照 276826;2.威海出入境檢驗(yàn)檢疫局,山東 威海 264200)

離子色譜法快速測定白酒中多種有機(jī)酸和陰離子

宋衛(wèi)得1,李兆杰2,楊立明1,王 凱1,高堯華1,李林杰1,姜維珍1

(1.日照出入境檢驗(yàn)檢疫局,山東 日照 276826;2.威海出入境檢驗(yàn)檢疫局,山東 威海 264200)

建立了梯度淋洗離子色譜法測定白酒中26種有機(jī)酸和陰離子的方法,研究了色譜柱、流速、pH值、淋洗液濃度等實(shí)驗(yàn)影響因素,確定了適于26種組分測定的多級梯度淋洗條件。結(jié)果表明,當(dāng)流速為1.00 mL/min,pH值為5.2～6.5時(shí),26種組分在0.02～2.00 mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系(R值均＞0.99)。除了苯甲酸外,25種組分檢出限(S/N=3)在0.000 11～0.072 80 mg/L;在0.50 mg/L、1.00 mg/L、2.00 mg/L三個(gè)添加濃度水平下,回收率為73.50%～115.13%,精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為3.38%～4.97%。

白酒;離子色譜;測定;有機(jī)酸;陰離子

白酒是承載著悠久的歷史和文化的重要飲品。近年來,隨著‘酒精勾兌”、“塑化劑”、“添加劑”等質(zhì)量安全事件的出現(xiàn),我國白酒釀造質(zhì)量引起了社會的高度關(guān)注[1]。有機(jī)酸和無機(jī)陰離子是關(guān)乎白酒質(zhì)量的重要組分,主要引入途徑有原料選用、釀造發(fā)酵、人為添加等。白酒中有機(jī)酸主要有乳酸、乙酸、戊酸、丁酸、甲酸、丙酸、己酸等[2-3],有機(jī)酸的種類和含量影響著白酒的品質(zhì)、口感、穩(wěn)定性;酒中有毒有害陰離子超標(biāo)時(shí),亦會危害人體健康。因此,建立白酒中多種有機(jī)酸和陰離子同時(shí)檢測的方法,具有重要的現(xiàn)實(shí)意義和應(yīng)用價(jià)值。

目前,有機(jī)酸的檢測方法有分光光度法[4]、毛細(xì)管電泳法[5]、氣相色譜法[6]、高效液相色譜法[7-8]、離子色譜法[9-10]等。其中離子色譜法具有簡便、快速、靈敏、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)[11-14],在有機(jī)酸和陰離子同時(shí)測定方面具有明顯的技術(shù)優(yōu)勢。成霈等[15]建立了酒中5種常見有機(jī)酸的離子色譜檢測方法,方法快捷靈敏,但測定組分較少且需要42 min方可全部出峰;吳飛燕等[16]建立了電導(dǎo)抑制離子色譜法測定酒中16種有機(jī)酸和陰離子的方法,該方法靈敏度高,但測定組分較少、檢測時(shí)長需要52 min。當(dāng)前,離子色譜法測定酒中多種有機(jī)酸和陰離子的方法研究較少,且存在組分?jǐn)?shù)量分析少、影響因素考察不全、檢測時(shí)間較長等不足。本研究通過優(yōu)化色譜條件和分析多種影響因素,建立了白酒中18種有機(jī)酸和8種陰離子同時(shí)測定的方法,實(shí)現(xiàn)了在32 min內(nèi)快速測定26種組分的目標(biāo),從而為我國白酒釀造業(yè)提供一種快捷、靈敏、準(zhǔn)確的檢測技術(shù),切實(shí)降低白酒多組分聯(lián)合檢測成本,促進(jìn)白酒釀造質(zhì)量控制和產(chǎn)品檢測技術(shù)的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白酒:市售;8種陰離子(F-、Cl-、NO3-、NO2-、ClO2-、BrO3-、PO43-、CrO42-)標(biāo)準(zhǔn)溶液(質(zhì)量濃度為1 000 mg/L):國家有色金屬分析測試中心;18種有機(jī)酸(D-奎尼酸、乳酸、丙酸、甲酸、丁酸、丙酮酸、戊酸、乙酸、琥珀酸、酒石酸、檸檬酸、戊二酸、馬來酸、富馬酸、苯甲酸、草酸、順烏頭酸、反烏頭酸):德國默克公司;超純水(電阻率18.2MΩ·cm):實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2 儀器與設(shè)備

ICS2100離子色譜儀(配備電導(dǎo)檢測器和自動再生抑制器):美國Thermo Fisher公司;Milli-Q超純水儀:美國Millipore公司;Rotina380R高速離心機(jī):德國Hettich公司;ML802/02電子天平:梅特勒儀器(上海)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 離子色譜條件

AS11-HC陰離子分離柱(4 mm×250 mm),AG11-HC保護(hù)柱(4 mm×50 mm);淋洗液:KOH溶液;淋洗方式:多級梯度淋洗;電導(dǎo)檢測器檢測;流速1.00 mL/min;柱溫30℃;進(jìn)樣量50 μL。

1.3.2 樣品前處理

使用2.0 mol/L KOH溶液,調(diào)節(jié)樣品pH值至5.2～6.5,取10.0 mL樣品放入50 mL離心管中,在10 000 r/min條件下離心15 min,取上清液0.50 mL至100 mL容量瓶中,超純水定容至刻度,搖勻并靜置10min,取10.0mL溶液,過0.22 μm水相過濾膜,棄去前面3 mL,收集后面清液,上機(jī)檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 色譜柱的選擇

依次進(jìn)行了AS11、AS11-HC、AS19三種色譜柱分離對比實(shí)驗(yàn)。AS11-HC是一種高容量、強(qiáng)親水性色譜柱,尤其適用于食品中多種有機(jī)酸和陰離子同時(shí)測定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí),采用AS11-HC色譜柱組分靈敏度高、峰型較尖銳。因此,選擇AS11-HC色譜柱進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.1.2 流速的選擇

對比了0.50 mL/min、0.75 mL/min、1.00 mL/min、1.25 mL/min、1.50 mL/min五種流速條件下分離情況。在0.50mL/min和0.75 mL/min流速時(shí),流速低、壓力小、峰寬較大,出峰時(shí)間較長,靈敏度不高。1.25mL/min和1.50 mL/min流速時(shí)系統(tǒng)壓力較高,直接影響色譜柱使用壽命。1.00mL/min時(shí),壓力適中,靈敏度高,總出峰時(shí)間縮至32min。綜合考慮各種因素,選擇1.00 mL/min為實(shí)驗(yàn)流速。

2.1.3 pH值的選擇

由圖1可知,26種組分中有一些不穩(wěn)定的有機(jī)酸和陰離子,如和離子,受溶液pH值影響較大,當(dāng)pH值＜4.0時(shí)檢測濃度低于理論濃度的80%。為了驗(yàn)證pH值對組分測定的影響,以KOH溶液來配制一系列不同pH值(2.6、3.5、4.5、5.7、6.8、8.5、10.1、11.6)的去離子水溶液,然后將相同理論濃度混合標(biāo)準(zhǔn)溶液配置成不同的pH值,測定不同pH值條件下26種組分測定含量的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí),pH＜5.0時(shí),不穩(wěn)定的有機(jī)酸和陰離子測定含量降低,pH為5.5～6.8時(shí),多數(shù)組分測定結(jié)果穩(wěn)定、靈敏度高。這是由于多數(shù)有機(jī)酸的解離常數(shù)pKa值在4.2～6.5,當(dāng)pKa值與pH值相等時(shí),溶液中的中性分子和離子型分子的濃度相同,組分處于相對穩(wěn)定的狀態(tài),適于定性定量分析。圖1中是受pH值影響較大的7種組分的檢測分析圖譜,結(jié)果表明,在pH值為5.2～6.7左右,檢測組分含量穩(wěn)定,因此,選擇pH值為5.2～6.5進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

圖1 溶液pH值對有機(jī)酸和陰離子檢測的影響Fig.1 Effect of solution pH value on determination of organic acids and anions

2.1.4 梯度淋洗條件的選擇

離子色譜多級梯度淋洗條件見表1,26種組分混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的離子色譜圖見圖2。

表1 離子色譜多級梯度淋洗條件Table 1 Multistage gradient elution conditions of ion chromatography

圖2 26種組分混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的離子色譜圖Fig.2 Ion chromatogram of mixed standard solution of 26 components

由表1及圖2可知,26種組分中某些組分結(jié)構(gòu)相似、分子質(zhì)量相近、出峰時(shí)間接近,一般梯度淋洗條件難以分離。為了便于分析,根據(jù)組分在色譜柱上保留特性,將26種組分分為3類:弱保留組分(1～13)、中等保留組分(14～21)、強(qiáng)保留組分(22～26)。

0～6min是初始淋洗濃度時(shí)間段,依次進(jìn)行了0.80mmol/L、1.00 mmol/L、1.25 mmol/L初始濃度條件下的實(shí)驗(yàn)。0.80 mmol/L濃度下,組分出峰時(shí)間拖后,總出峰時(shí)間變長,且前3種弱保留組分的分離度不好;1.25 mmol/L濃度時(shí),前10種弱保留組分總體分離效果不佳;初始濃度為1.00 mmol/L時(shí),26種組分色譜峰的分離狀況理想。因此,選擇1.00 mmol/L為初始淋洗濃度。

在6～22min時(shí)間段,有21種待測組分,先后進(jìn)行了30多次實(shí)驗(yàn)分析,最終選擇使用3次淋洗濃度和淋洗斜率變化。首先,在6～13 min時(shí),淋洗斜率為1.857 mmol/(L·min);在13～17 min時(shí),淋洗濃度由14.00 mmol/L增至14.50 mmol/L,此時(shí)幾乎是一個(gè)等度淋洗濃度,便于結(jié)構(gòu)性能相近組分的分離;在17～22 min時(shí),淋洗濃度由14.50 mmol/L增至18.00 mmol/L,淋洗斜率為0.700 mmol/(L·min)。在多級梯度淋洗條件下,多組分靈敏度高、分離效果好。

在22～33min時(shí),進(jìn)行了最高淋洗濃度分別為50mmol/L、60 mmol/L、70 mmol/L條件下對比分析實(shí)驗(yàn)。結(jié)果證實(shí),在50mmol/L濃度時(shí),5種強(qiáng)保留組分出峰時(shí)間拖長,且靈敏度不高;在70mmol/L濃度時(shí),5種組分出峰速度快、靈敏度高,但分離度變小、組分峰有重疊情況;最高淋洗濃度為60mmol/L時(shí),5種強(qiáng)保留組分靈敏度和分離度較好,因此,選擇此濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

時(shí)間段的劃分、初始濃度、淋洗斜率大小、最高淋洗濃度都是分離測定的重要影響因素,在實(shí)際操作中,應(yīng)該全面系統(tǒng)地分析,科學(xué)合理地選擇。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 線性范圍與檢出限

在0.02～2.00 mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi),進(jìn)行了7個(gè)不同濃度水平(0.02 mg/L、0.05 mg/L、0.10 mg/L、0.20 mg/L、0.50 mg/L、1.00 mg/L、2.00 mg/L)標(biāo)準(zhǔn)工作液的測定,以組分質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo),以組分峰面積(Y)為縱坐標(biāo),進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線線性擬合,結(jié)果見表2。由表2可知,26種組分線性相關(guān)系數(shù)R均＞0.99,線性良好;個(gè)別有機(jī)酸因自身不穩(wěn)定或分離度不高,線性相關(guān)性不理想;除了苯甲酸檢出限為0.217 6 mg/L外,25種組分檢出限在0.000 1～0.072 8 mg/L。

表2 測定組分的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限(S/N=3)Table 2 Linear ranges,linear equations,correlation coefficient and detection limit of components determined

2.2.2 回收率實(shí)驗(yàn)

在白酒樣品中依次進(jìn)行了0.50mg/L、1.00mg/L、2.00mg/L 3個(gè)濃度添加水平下的回收率測定實(shí)驗(yàn),來驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確度,結(jié)果見表3。

表3 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of recovery rate tests

由表3可知,26種組分測定回收率為73.50%～115.13%,回收率結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)在1.07%～10.23%范圍內(nèi),從回收率大小來看,僅有在0.50 mg/L和1.00 mg/L添加水平下,奎尼酸、苯甲酸、順烏頭酸三種物質(zhì)回收率＜80.0%,1.00 mg/L添加水平下的甲酸回收率＞110%,其他均處于80%～110%范圍內(nèi);從精密度RSD結(jié)果來看,奎尼酸和甲酸RSD偏大,其他RSD均＜8.00%。這說明白酒中26種組分用該法測定時(shí),精密度和準(zhǔn)確度較好。

2.2.3 精密度實(shí)驗(yàn)

選取一種代表性白酒樣品,進(jìn)行6次平行測定,并計(jì)算結(jié)果相對標(biāo)準(zhǔn)偏差,結(jié)果見表4。

表4 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of precision tests

由表4可知,白酒中檢出的6種組分6次平行測定實(shí)驗(yàn)結(jié)果相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在3.38%～4.97%范圍內(nèi)。測定精密度結(jié)果符合檢測技術(shù)要求,說明該檢測方法精密度良好。

2.3 實(shí)際樣品測定

白酒中有機(jī)酸是其重要呈味物質(zhì),主要有乳酸、甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸等,此外還可能含有極少量辛酸和庚酸。取5種白酒用該法進(jìn)行26種組分測定,其離子色譜圖見圖3,各組分測定結(jié)果見表5。

圖3 5種白酒樣品中有機(jī)酸和陰離子檢測離子色譜圖Fig.3 Ion chromatogram of determination of organic acids and anions in fiveBaijiusamples

由圖3可知,在6.5 min出現(xiàn)了一個(gè)蘑菇包型色譜峰,這是白酒中乙醇的色譜峰,會在一定程度上影響奎寧酸(出峰時(shí)間8.35 min)的定量;白酒中主要有機(jī)酸是乳酸和乙酸,乳酸是釀酒發(fā)酵過程產(chǎn)生的,且可以與乙醇產(chǎn)生乳酸乙酯,是白酒呈香味的重要物質(zhì),其含量大小是白酒質(zhì)量的一個(gè)重要標(biāo)志。1、2、4號白酒中乳酸含量較高,且總體有機(jī)酸種類豐富、含量較高,說明酒體質(zhì)量較高,這3種酒市場價(jià)格高,也恰好印證該結(jié)論。而3、5號白酒的乳酸含量較低,有機(jī)酸總體含量低,且5號白酒檢出有害離子NO2-,酒體質(zhì)量相對不高。有4種白酒在15.0 min出現(xiàn)了一個(gè)色譜峰,經(jīng)單標(biāo)確認(rèn)為己酸色譜峰。從圖3可看出,雖然白酒樣品測定時(shí)有高含量的乙醇干擾,含量較高的乙酸和乳酸分離度不夠高,但是總體基線平穩(wěn),各組分色譜峰形尖銳,多數(shù)色譜峰分離度較理想,說明檢測方法穩(wěn)定、實(shí)用。

表5 5種白酒樣品中26種組分測定結(jié)果Table 5 Determination results of 26 components in fiveBaijiusamples

由表5可知,5種白酒中各種有機(jī)酸含量大小不一,5種白酒中檢出的有機(jī)酸有乳酸、乙酸、甲酸、丁酸、戊酸、馬來酸、順烏頭酸、反烏頭酸,其中含量最大3種有機(jī)酸分別是乳酸(0.494 4～4.060 4 mg/L)、乙酸(3.007 9～5.497 8 mg/L)、馬來酸(0.951 7～1.673 2 mg/L),而D-奎尼酸、丙酸、丙酮酸、戊二酸、琥珀酸、酒石酸、草酸、富馬酸、苯甲酸、檸檬酸未檢出;檢出的無機(jī)陰離子有Cl-(0.085～0.395mg/L)、NO2-、PO43-,而其他5種陰離子未檢出。

3 結(jié)論

本研究通過對流速、溶液pH值、初始梯度濃度、淋洗斜率等多種實(shí)驗(yàn)影響因素的分析,確定了白酒中26種組分分離的梯度淋洗條件,建立了離子色譜法快速測定白酒中26種有機(jī)酸和陰離子的方法。結(jié)果表明,流速為1.00mL/min,pH值為5.3～6.0,初始淋洗濃度為1.00 mmol/L,最高淋洗濃度為60 mmol/L時(shí),26種組分分離效果理想。本方法操作快速便捷、靈敏度高、適用性強(qiáng),經(jīng)簡單前處理后即可上機(jī)測定,32 min內(nèi)26種組分全部出峰,完全適于白酒中26種有機(jī)酸和陰離子的快速測定。

[1]張 秋,范光森,李秀婷.我國白酒質(zhì)量安全現(xiàn)狀淺析[J].中國釀造,2016,35(11):15-16.

[2]MAY H,LIM P,ZHANGS W.Simultaneous determination of organic acids in Chinese liquor by GC-MS method[J].Asian J Chem,2014,26(15)：4707-4710.

[3]孫鵬飛,張福艷,吳海靜,等.衡水老白干酒中產(chǎn)酸微生物的分離鑒定及性能研究[J].中國釀造,2016,35(3):36-37.

[4]牛金剛,梁曉靜,劉 霞,等.分光光度法測定水溶液中的有機(jī)酸含量[J].應(yīng)用化學(xué),2010,27(3):342-343.

[5]李永庫,劉衣南,呂琳琳,等.毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用法測定葡萄酒中8種有機(jī)酸含量[J].質(zhì)譜學(xué)報(bào),2013,34(5):288-289.

[6]朱曉蘭,高 蕓,蘇慶德.毛細(xì)管氣相色譜法測定番茄中的非揮發(fā)性有機(jī)酸、高級脂肪酸和低分子量糖類[J].食品科學(xué),2004,25(9):152-153.

[7]王銀輝,沈小梅,馬 雷,等.超高效液相色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(UPLC-MS/MS)同時(shí)測定白酒中7種有機(jī)酸的分析研究[J].釀酒,2016,43(1):43-45.

[8]ZAKY A S,PENSUPA N,ANDRADE-EIROA A,et al.A new HPLC method for simultaneously measuring chloride,sugars,organic acids and alcohols in food samples[J].J Food Compos Anal,2017,56(1)：25-26.

[9]史亞利,劉京生,蔡亞岐,等.離子交換色譜法同時(shí)測定啤酒中有機(jī)酸和無機(jī)陰離子[J].分析化學(xué),2005,33(5):605-608.

[10]GENG X M,ZHANG S F,WANG Q,et al.Determination of organic acids in the presence of inorganic anions by ion chromatography with suppressed conductivity detection[J].J Chromatogr,2008,1192(1)：187-190.

[11]DOLGONOSOV A M,KOLOTILINA N K.Ion-exchange sample preparation for the determination of anions in highly alkaline solutions by ion chromatography[J].J Anal Chem,2015,70(11)：1322-1324.

[12]GUO B,ZHAO Y,LIU J Y.Simultaneous determination of seven carbohydrates in tobacco by ultrasonic extraction-ion chromatography[J].Asian J Chem,2014,26(16)：5149-5155.

[13]施超歐,姚寶龍,胡 咪,等.離子轉(zhuǎn)換色譜-紫外檢測法測定啤酒中的無機(jī)陰離子和有機(jī)酸[J].色譜,2016,34(10):951-955.

[14]LUO X M,CHEN L,ZHAO Y Q.Simultaneous etermination f three chloroacetic acids,three herbicides,and 12 anions in water by on chromatography[J].J Sep Sci,2015,38(17)：3096-3102.

[15]成 霈,劉 佳,顧慧瑩,等.離子色譜法測定果酒中的有機(jī)酸[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2011,37(8):175-176.

[16]吳飛燕,賈之慎,朱 巖.離子色譜電導(dǎo)檢測法測定酒中的有機(jī)酸和無機(jī)陰離子[J].浙江大學(xué)學(xué)報(bào),2006,33(3):312-313.

SONG Weide1,LI Zhaojie2,YANG Liming1,WANG Kai1,GAO Yaohua1,LI Linjie1,JIANG Weizhen1
(1.Rizhao Entry-Exit Inspection&Quarantine Bureau,Rizhao 276826,China;2.Weihai Entry-Exit Inspection&Quarantine Bureau,Weihai 264200,China)

O657.7

0254-5071(2017)11-0153-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.11.033

2017-08-08

山東出入境檢驗(yàn)檢疫局科技項(xiàng)目(SK201619);國家質(zhì)檢總局科技項(xiàng)目(2017IK220,2015IK204)

宋衛(wèi)得(1981-),高級工程師,碩士,研究方向?yàn)槭称钒踩珯z測技術(shù)。