接骨木花青素的純化工藝及清除DPPH自由基活性的研究

馮文娟,崔瑋琪,徐澤平,2,陳曉慧,李超孟,董志榮,司文元,包 英

(1.黃河三角洲京博化工研究院有限公司,山東 濱州 256500;2.濱州市環(huán)境微生物技術(shù)工程研究中心,山東 濱州 256500)

接骨木花青素的純化工藝及清除DPPH自由基活性的研究

馮文娟1,崔瑋琪1,徐澤平1,2,陳曉慧1,李超孟1,董志榮1,司文元1,包 英1

(1.黃河三角洲京博化工研究院有限公司,山東 濱州 256500;2.濱州市環(huán)境微生物技術(shù)工程研究中心,山東 濱州 256500)

通過(guò)乙醇浸提法從接骨木鮮果和干果中提取花青素,通過(guò)膜分離技術(shù)、正己烷萃取、大孔吸附樹(shù)脂純化,從接骨木鮮果和干果中提取得到的花青素凍干粉得率分別為0.43%和1.52%,花青素含量可以達(dá)到29.32%。接骨木花青素在質(zhì)量濃度為200 μg/mL時(shí),DPPH自由基的清除率最高為89.40%,相當(dāng)于維生素C的96.28%。結(jié)果表明,接骨木花青素有一定的抗氧化能力。

接骨木;花青素;大孔吸附樹(shù)脂;DPPH自由基

接骨木(Sambucus williamsiiHance),也叫公道老、扦扦活、大接骨丹等,在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用較為廣泛[1-2],對(duì)接骨木的研究主要集中在接骨木化學(xué)成分及總黃酮提取分離及抗氧化活性[3-4],接骨木莖枝葉及果實(shí)花青素成分分離及藥理活性[5-6]?；ㄇ嗨?anthocyanidin)是一種天然水溶性色素,易溶于水、甲醇、乙醇、稀堿與稀酸等極性溶劑中,具有抗氧化、抑菌、預(yù)防心血管疾病等功效[7-9],在食品、化妝品、醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用前景很好,花青素主要來(lái)源有黑豆、紫葡萄皮、藍(lán)莓、紫薯等[10-12],但是這些資源有限,因此開(kāi)發(fā)花青素含量高的資源的意義重大。樹(shù)脂吸附法是利用大孔吸附樹(shù)脂吸附溶液中的有機(jī)物,再經(jīng)一定溶劑將其洗脫下來(lái),從而達(dá)到分離、純化、除雜等目的,由于其純化效果佳,對(duì)設(shè)備要求低,已經(jīng)廣泛用于天然活性成分的分離純化,如大孔樹(shù)脂純化花青素、多糖等[13]。本研究以接骨木鮮果和干果為原料,采用乙醇溶劑法提取接骨木花青素,結(jié)合大孔吸附樹(shù)脂層析和真空冷凍干燥技術(shù)對(duì)花青素進(jìn)行分離純化,并對(duì)其清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基能力進(jìn)行考察,探討其抗氧化能力,希望為接骨木花青素的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)和產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

接骨木果:山東博華生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司;標(biāo)準(zhǔn)品葡聚糖(平均分子質(zhì)量5 900 Da、1.18×104Da、4.75×104Da、11.2×104Da、21.2×104Da、40.4×104Da):美國(guó) Sigma 公司;維生素C(vitaminC,VC):天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;大孔吸附樹(shù)脂AB-8:天津南開(kāi)和成科技有限公司;0.45 μm濾膜:上海安譜科學(xué)儀器有限公司;1 kDa的超濾膜:天津膜天膜科技股份有限公司;其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DL-6M型大型低速離心機(jī):長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)科技有限公司;LC-10AT高效液相色譜儀、UV-1700型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì):日本島津公司;FD-ID-55型真空冷凍干燥機(jī):北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;PHS-3C型pH計(jì):上海今邁生物科技有限公司;RE-5286A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀:上海雅榮生化設(shè)備儀器有限公司;FA2004型電子天平:上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 花青素的提取

接骨木鮮果去除枝葉,準(zhǔn)確稱(chēng)取1 kg加入到1 L體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇溶液(濃鹽酸調(diào)節(jié)pH 2～4)中室溫浸提4 h,4層紗布過(guò)濾,濾渣再次重復(fù)提取一遍,合并兩次濾液,離心,上清液于60℃條件下真空蒸發(fā),獲得花青素濃縮液。

接骨木干果去除枝條,準(zhǔn)確稱(chēng)取200 g加入到1 L體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇溶液(濃鹽酸調(diào)節(jié)pH2～4)中室溫浸提48h,4層紗布過(guò)濾,濾渣再次重復(fù)提取一遍,合并兩次濾液,離心,上清液于60℃條件下真空蒸發(fā),獲得花青素濃縮液。

1.3.2 接骨木粗多糖的提取

按照1.3.1的方法提取得到花青素濃縮液,加入5倍體積的無(wú)水乙醇進(jìn)行醇沉,抽濾,濾渣60℃烘干即得接骨木粗多糖。將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇,經(jīng)冷凍干燥即得接骨木花青素。接骨木多糖可以說(shuō)是存在于接骨木花青素提取過(guò)程中的一種雜質(zhì),影響花青素的品質(zhì)。

1.3.3 總糖的測(cè)定

多糖含量的測(cè)定采用苯酚-硫酸法[14]。以葡萄糖質(zhì)量(X)為橫坐標(biāo),吸光度值(A)為縱坐標(biāo)繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1得到標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為:A=7.2208X+0.000 9,相關(guān)系數(shù)R2=0.999 9,表明二者線性關(guān)系良好。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of glucose

1.3.4 多糖分子質(zhì)量的測(cè)定

(1)色譜條件

兩根Shodex Ohpak SB-803HQ凝膠色譜柱(8.0 mm×300mm)串連。檢測(cè)器:示差折光檢測(cè)器;流動(dòng)相:0.02%疊氮化鈉水溶液;流速:0.5 mL/min;柱溫:35℃;進(jìn)樣量:20 μL。

(2)標(biāo)準(zhǔn)溶液及接骨木多糖溶液的配制

準(zhǔn)確稱(chēng)取0.050 0 g葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品,加流動(dòng)相溶解定容至10 mL,配制成5.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液,用0.45 μm水系微孔濾膜過(guò)濾即得。

準(zhǔn)確稱(chēng)取1.00g接骨木粗多糖,加流動(dòng)相溶解配制成質(zhì)量濃度為10 mg/mL的溶液,用0.45 μm水系微孔濾膜過(guò)濾即得接骨木多糖溶液。

(3)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

分別吸取葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)溶液20 μL注入液相色譜儀,記錄色譜圖及保留時(shí)間,以保留時(shí)間為橫坐標(biāo),以重均相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)(logMw)為縱坐標(biāo)繪制葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.5 大孔吸附樹(shù)脂純化花青素

(1)樹(shù)脂預(yù)處理

大孔吸附樹(shù)脂AB-8先用2倍體積的無(wú)水乙醇浸泡過(guò)夜,過(guò)濾除醇,蒸餾水清洗直至洗脫液澄清為止。再用2倍體積的4%鹽酸溶液浸泡3 h,過(guò)濾,蒸餾水清洗,直至洗脫液呈中性。用2倍體積的5%氫氧化鈉溶液浸泡3 h,過(guò)濾,蒸餾水清洗,直至洗脫液呈中性。

(2)接骨木花青素分離純化工藝

[15],將預(yù)處理好的大孔吸附樹(shù)脂裝入層析柱,連續(xù)加入按照1.3.1方法提取的接骨木花青素濃縮液以10mL/min流速進(jìn)行吸附,直到層析柱最下面的樹(shù)脂變紅或變黃即為吸附完成。吸附完成后,用5倍柱體積的蒸餾水洗脫,再用3倍柱體積的35%的乙醇溶液洗脫,收集水洗脫液和醇洗脫液,60℃條件下真空濃縮,-40～50℃冷凍干燥48 h,醇洗脫下來(lái)的花青素即為純化后的花青素。

經(jīng)上述乙醇提取,過(guò)濾,離心,提取液濃縮,獲得花青素濃縮液,1份用0.5倍體積的乙酸乙酯萃取油脂12 h,收集下層脫脂液體;1份用0.5倍體積的正己烷萃取油脂12 h,收集下層脫脂液體;另一份不做脫脂處理。將這3份提取液用大孔吸附樹(shù)脂純化,分別收集醇洗脫液,在60℃條件下真空濃縮,-40～50℃冷凍干燥48 h得到接骨木花青素凍干粉。1.3.6花青素含量的測(cè)定

采用pH示差法。參考文獻(xiàn)[16],將接骨木鮮果和干果提取的花青素凍干粉分別配制成質(zhì)量濃度為0.10 mg/mL和2.0 mg/mL的溶液,取兩份各1 mL于試管中,分別加4 mL pH=1.0的14.90 g/L氯化鉀緩沖液和pH=4.5的16.40 g/L乙酸鈉緩沖液(用0.2 mol/L的鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值),室溫放置80min,在波長(zhǎng)520nm和700nm處測(cè)定吸光度值。花青素含量計(jì)算公式如下:

A=(A520nm-A700nm)pH1.0-(A520nm-A700nm)pH4.5

式中:A為吸光度值;449.2為矢車(chē)菊花素-3-葡萄糖苷的相對(duì)分子質(zhì)量;N為稀釋倍數(shù);V為定容體積,mL;29 600為矢車(chē)菊花素-3-葡萄糖苷的消光系數(shù);L為光程,1 cm;M為取樣量,g。

1.3.7 花青素紫外可見(jiàn)光光譜掃描

將接骨木花青素分別用pH 1.0的氯化鉀緩沖液和pH 4.5的乙酸鈉緩沖液配制成0.1 mg/mL的溶液,在波長(zhǎng)250～700 nm波長(zhǎng)紫外可見(jiàn)光光譜范圍內(nèi)掃描。

1.3.8 清除DPPH自由基能力

準(zhǔn)確稱(chēng)取0.100 0 g花青素凍干粉配成0.10 mg/mL的花青素母溶液,再用蒸餾水稀釋成200 μg/mL、100 μg/mL、80μg/mL、60μg/mL、40μg/mL、20μg/mL的花青素待測(cè)液。以相同質(zhì)量濃度的維生素C作為陽(yáng)性對(duì)照。

測(cè)定方法參考文獻(xiàn)[17-18],取待測(cè)液2.0mL加入2.0mL的2×10-4mol/LDPPH乙醇溶液混勻,以無(wú)水乙醇為空白對(duì)照,避光反應(yīng)30 min,在波長(zhǎng)517 nm處測(cè)定吸光度值,記為A1;取待測(cè)液2.0mL加入2.0mL的無(wú)水乙醇,混勻,避光反應(yīng)30min,在波長(zhǎng)517nm處測(cè)定吸光度值,記為A2;取2.0mL的2×10-4mol/L DPPH乙醇溶液加入2.0 mL的無(wú)水乙醇,混勻,避光反應(yīng)30 min,在波長(zhǎng)517nm處測(cè)定吸光度值,記為A3。清除DPPH自由基能力計(jì)算公式如下:

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖分子質(zhì)量的測(cè)定

以保留時(shí)間(x)為橫坐標(biāo),以葡聚糖重均相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)數(shù)(y)為縱坐標(biāo),繪制葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知,得到葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程y=-0.251 4x+11.486,擬合系數(shù)R2=0.997,說(shuō)明保留時(shí)間和重均相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)呈良好的線性關(guān)系。

圖2 葡聚糖分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of molecular mass of dextran

10 mg/mL的接骨木多糖溶液經(jīng)過(guò)高效液相色譜儀分析檢測(cè),將保留時(shí)間帶入葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程得到接骨木多糖的相對(duì)分子質(zhì)量,結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 接骨木多糖分子質(zhì)量測(cè)定結(jié)果Table 1 Determination results of molecular mass of polysaccharide fromS.williamsii

本研究檢測(cè)接骨木粗多糖中總糖含量為9.69%。通過(guò)測(cè)定接骨木多糖分子質(zhì)量的分布,選擇合適的超濾膜來(lái)除掉接骨木多糖。由表1可知,接骨木多糖的分子質(zhì)量有82.24%分布在1 000 Da以上,因此采用1 000 Da的膜不僅可以將接骨木提取物中的大部分多糖除掉,還可以除掉接骨木提取物中其他大分子物質(zhì),從而起到純化花青素的效果。

2.2 花青素的分離純化

以未經(jīng)過(guò)大孔吸附樹(shù)脂純化處理為空白對(duì)照,檢測(cè)接骨木花青素凍干粉中花青素含量,結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 不同處理對(duì)花青素含量的影響Fig.3 Effects of different treatments on the content of anthocyanidin

以接骨木鮮果和干果為原料得到的花青素凍干粉花青素得率分別為0.43%和1.52%。由圖3可知,大孔吸附樹(shù)脂AB-8對(duì)花青素具有很好的吸附除雜作用。純化后的花青素凍干粉中花青素含量可以達(dá)到27.74%,比未純化的花青素純度提高了27.27個(gè)百分點(diǎn)。水洗脫下來(lái)的花青素凍干粉中花青素含量較低,為3.65%,可以收集后再次用大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行純化。以鮮果為原料經(jīng)大孔吸附樹(shù)脂純化后的花青素凍干粉中花青素含量顯著高于干果的,因此選擇接骨木鮮果為原料進(jìn)行下面的實(shí)驗(yàn)。

2.3 有機(jī)溶劑萃取

檢測(cè)接骨木花青素凍干粉中花青素含量,結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 脫脂處理對(duì)花青素含量的影響Fig.4 Effect of degreasing treatment on the content of anthocyanidin

未經(jīng)過(guò)脫脂處理的花青素濃縮液中含有大量的油脂,直接使用大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行純化,不僅影響花青素的質(zhì)量,而且會(huì)降低大孔吸附樹(shù)脂的使用壽命,因此,在大孔樹(shù)脂純化之前,有必要去除花青素濃縮液中的油脂。采用有機(jī)溶劑萃取法,由圖4可知,經(jīng)正己烷脫脂和大孔吸附樹(shù)脂純化后得到的花青素凍干粉中花青素含量為29.32%,均顯著高于未脫脂和乙酸乙酯脫脂處理組,并且乙酸乙酯能夠溶解于水中,正己烷不溶于水,因此選擇正己烷作為去除油脂的有機(jī)溶劑。

2.4 接骨木花青素紫外可見(jiàn)光光譜掃描

圖5 接骨木花青素的UV-vis光譜掃描曲線Fig.5 UV-vis spectral scanning curve of anthocyanidin from S.williamsii

由圖5可知,接骨木花青素在波長(zhǎng)520nm和280nm處有最大吸收峰,這與參考文獻(xiàn)[15]的研究中矢車(chē)菊花素-3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品的光譜掃描結(jié)果一致,矢車(chē)菊花素-3-O-葡萄糖苷是眾多花青素中的一種,可以初步說(shuō)明從接骨木果實(shí)中提取出來(lái)的物質(zhì)中含有矢車(chē)菊花素-3-O-葡萄糖苷。

2.5 清除DPPH自由基能力

圖6 接骨木花青素對(duì)DPPH自由基清除能力Fig.6 Scavenging ability of anthocyanidin fromS.williamsii on DPPH free radical

由圖6可知,接骨木花青素對(duì)DPPH自由基具有一定的清除能力,隨著花青素質(zhì)量濃度的增大,DPPH自由基清除率增大,在花青素質(zhì)量濃度為200 μg/mL時(shí),DPPH自由基的清除率最高為89.40%,相當(dāng)于VC的96.28%。結(jié)果表明,接骨木花青素有一定的抗氧化能力。

3 結(jié)論

通過(guò)接骨木糖分子質(zhì)量的分析,82.24%的接骨木糖的分子質(zhì)量分布在1 000 Da以上,可采用1 000 Da的超濾膜除掉接骨木提取物中的大部分糖來(lái)純化花青素。

與乙酸乙酯相比,正己烷能夠更加有效的去除接骨木提取液中的油脂,提高花青素的純度,延長(zhǎng)大孔吸附樹(shù)脂的壽命。大孔吸附樹(shù)脂AB-8能夠很好的純化接骨木花青素,經(jīng)正己烷脫脂和大孔吸附樹(shù)脂純化后得到的花青素凍干粉中花青素含量可以達(dá)到29.32%,比未純化的花青素純度提高了28.85個(gè)百分點(diǎn)。

接骨木花青素對(duì)DPPH自由基具有一定的清除能力,在花青素質(zhì)量濃度為200 μg/mL時(shí),DPPH自由基的清除率最高為89.40%,相當(dāng)于VC的96.28%。結(jié)果表明,接骨木花青素有一定的抗氧化能力。

本研究的膜分離技術(shù)、正己烷萃取脫脂和大孔吸附樹(shù)脂純化,可以顯著提高接骨木花青素的純度,希望為接骨木花青素的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

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FENG Wenjuan1,CUI Weiqi1,XU Zeping1,2,CHEN Xiaohui1,LI Chaomeng1,DONG Zhirong1,SI Wenyuan1,BAO Ying1
(1.Yellow River Delta Jingbo Research Institute of Chemical Industry Co.,Ltd.,Binzhou 256500,China;2.Binzhou Environmental Microbial Technology and Engineering Research Center,Binzhou 256500,China)

TS255.1

0254-5071(2017)11-0134-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.11.029

2017-08-24

山東省科技重大專(zhuān)項(xiàng)(2015ZDJS03003)

馮文娟(1986-),女,工程師,碩士,研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)深加工。