甘南牦牛肝過氧化氫酶超濾純化工藝及酶學(xué)性質(zhì)研究

馮 平,李正濤,陳慶安,翟丹云,董延虎

(甘肅省商業(yè)科技研究所有限公司,甘肅 蘭州 730020)

甘南牦牛肝過氧化氫酶超濾純化工藝及酶學(xué)性質(zhì)研究

馮 平,李正濤,陳慶安,翟丹云,董延虎

(甘肅省商業(yè)科技研究所有限公司,甘肅 蘭州 730020)

采用超濾工藝從甘南牦牛肝中分離純化過氧化氫酶,得出的超濾最佳工藝為超濾膜截留分子質(zhì)量250 kDa、超濾溫度25℃、壓力0.20 MPa、流速30 m/s、濃縮倍數(shù)為3倍。酶學(xué)性質(zhì)研究結(jié)果顯示,該酶最適溫度、pH值分別為35℃和7.5,米氏常數(shù)(Km)值為53.8 mmol/L。

甘南牦牛肝;過氧化氫酶;超濾;純化;酶學(xué)性質(zhì)

過氧化氫酶(catalase,CAT)EC1.11.1.6是在生物演化過程中建立起來的生物防御系統(tǒng)關(guān)鍵酶之一[1],廣泛存在于動(dòng)植物及微生物體內(nèi)。其分子結(jié)構(gòu)中含有酶蛋白分子1個(gè)、酶蛋白分子中含鐵原子4個(gè)[2],相對(duì)分子質(zhì)量一般在200～340 kDa[3],功能是促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)H2O2分解[4]。目前,國際市場上動(dòng)物來源的過氧化氫酶約占10%左右,微生物來源過氧化氫酶約占88%左右,植物來源的過氧化氫酶約占2%左右。微生物來源過氧化氫酶因其安全性問題不能被用于食品、藥品工業(yè)。

過氧化氫酶在哺乳動(dòng)物的肝與紅細(xì)胞中含量較高[5],且動(dòng)物來源過氧化氫酶因其安全性高,制備分離純化被越來越多人們的重視,已有從牛肝[6]、豬肝[2]、大鼠肝[7]、鴨肝[5]、動(dòng)物血液[8]、貽貝[9]以及人胎盤[10]等分離純化過氧化氫酶的研究。制備分離方法主要是浸提、電泳、層析、透析等,都處于實(shí)驗(yàn)室研究階段,產(chǎn)品規(guī)模小,對(duì)過氧化氫酶工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn),生產(chǎn)成本高、周期長。為綜合利用甘南州牦牛資源,本研究在消化吸收國外先進(jìn)生產(chǎn)技術(shù)的基礎(chǔ)上應(yīng)用超濾膜分離技術(shù),分離純化過氧化氫酶,并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究,研發(fā)生產(chǎn)食品、藥品級(jí)的過氧化氫酶,以期為規(guī)模化生產(chǎn)提供參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料

牦牛肝臟:甘南州瑪曲縣宏達(dá)實(shí)業(yè)有限責(zé)任公司;過氧化氫、鉬酸銨等均為國產(chǎn)分析純。

1.2 設(shè)備與儀器

RU-3600R型紫外分光光度計(jì):上海茸研儀器有限公司;JML型膠體磨:溫州信馳輕工機(jī)械有限公司;HH-S4型多孔恒溫水浴鍋:上海況勝實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司;AL204型電子天平:梅特勒-托利多儀器有限公司;GL-21M湘儀離心機(jī):長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司;PHS-3C型pH計(jì):上海虹益儀器儀表有限公司;微濾器(尼龍膜,孔徑0.45 μm);WTM-1812G膜分離設(shè)備(膜材質(zhì)TMF):杭州沃騰膜設(shè)備工程有限公司。

1.3 方法

1.3.1 粗酶液的制備

新鮮牦牛肝切碎后,以0.3 mm間隙膠體磨打漿,漿液與水1∶5混合,在30℃條件下浸提10 h,浸提液用200目的濾布除去雜蛋白和其他一些懸浮物,濾液6 000 r/min離心10 min,離心收集沉淀;將上清液用孔徑0.45 μm尼龍膜微濾,制得粗酶液。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

以粗酶液為原液,采用膜分離設(shè)備分離純化,以膜通量為指標(biāo)分別探討超濾膜截留分子量(200 kDa、250 kDa、300 kDa)、超濾溫度(20℃、25℃、30℃)、壓力(0.10 MPa、0.15MPa、0.20MPa、0.25MPa)、流速(10m/s、20m/s、30m/s)、濃縮倍數(shù)(1、2、3、4、5、6)5個(gè)因素超濾過氧化氫酶的工藝條件。

1.3.3 酶學(xué)性質(zhì)研究

(1)酶活力測定:采用比色測定法[11]、滴定法[12]相結(jié)合測定酶活力單位,以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)品,用Lowry法[13]測定蛋白濃度。比酶活力=酶活力單位/蛋白濃度

(2)酶最適溫度測定:將純化的酶產(chǎn)物原液用1 mol/L、pH7.5磷酸鹽緩沖液適當(dāng)稀釋后,分別在不同溫度(10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃)條件下反應(yīng),用比色法測定酶活力,測定牦牛肝臟過氧化氫酶的最適溫度。

(3)酶最適pH值測定:將純化的酶產(chǎn)物原液用濃度為0.1 mol/L磷酸緩沖液、不同pH值(4.5、5.5、6.5、7.5、8.5、9.5、10.5)適當(dāng)稀釋后,在35℃條件下反應(yīng),用比色法測定酶活力,測定牦牛肝臟過氧化氫酶最適pH值。

(4)米氏常數(shù)(Km)值測定:分別以6.0 mmol/L、11.9 mmol/L 、17.9 mmol/L、23.9 mmol/L、29.8 mmol/L的H2O2作為底物,在上述條件下,用滴定法測定酶活力,使用Lineweave-Burk雙倒數(shù)作圖法[14]求米氏常數(shù)(Km)值。

1.3.4 膜通量計(jì)算公式

式中:F為膜通量,L/(m2·h);Q為透過液的體積,L;A為超濾膜面積,m2;T為純水透過時(shí)間,h。

2 結(jié)果與分析

2.1 超濾分離純化工藝的確定

2.1.1 不同截留分子質(zhì)量超濾膜對(duì)膜通量的影響

圖1 不同截留分子質(zhì)量超濾膜對(duì)膜通量的影響Fig.1 Influence of interception molecular mass ultrafiltration membrane on membrane flux

粗酶液在超濾壓力為0.20MPa、溫度25℃、流速為20m/s的條件下,分別使用截留分子質(zhì)量為200 kDa、250 kDa、300kDa的超濾膜純化濃縮1h,每10min測一次膜通量,結(jié)果(圖1)可知,截留分子質(zhì)量為300kDa時(shí)膜通量最高,200kDa時(shí)膜通量最低,250 kDa時(shí)膜通量出現(xiàn)持續(xù)穩(wěn)定趨勢,截留分子質(zhì)量為300 kDa與200 kDa的膜通量在純化初期階段下降速度較快,當(dāng)時(shí)間超過20 min后呈穩(wěn)定趨勢,這是由于純化初期,大于超濾膜截留分子質(zhì)量的粒子被截留在膜表面上,小于超濾膜截留分子質(zhì)量的粒子會(huì)進(jìn)入膜孔內(nèi),導(dǎo)致膜通量降低。如果純化濃縮時(shí)間延長,超濾膜表面形成較厚一層濾餅,促使膜通量處于比較穩(wěn)定的水平。

表1 不同截留分子質(zhì)量超濾膜對(duì)過氧化氫酶比活力的影響Table 1 Effect of interception molecular weight ultrafiltration membrane on catalase specific activity

由表1可知,采用截留分子質(zhì)量250 kDa超濾膜純化濃縮的過氧化氫酶濃縮液比活力最高,為2618.6U/mg,這是由于大分子雜蛋白物質(zhì)不能透過截留分子質(zhì)量過小的膜,而雜蛋白可透過截留分子質(zhì)量過大的膜,同時(shí)透過粗酶液,會(huì)導(dǎo)致過氧化氫酶的比活力降低。綜合考慮膜通量與比活力,純化濃縮過氧化氫酶較理想超濾膜截留分子質(zhì)量為250 kDa。

2.1.2 超濾溫度對(duì)膜通量的影響

粗酶液在超濾壓力0.20 MPa、流速為20 m/s、截留分子質(zhì)量250 kDa超濾膜的條件下,溫度梯度20℃、25℃、30℃超濾膜純化濃縮1 h,每10 min測一次膜通量。由圖2所示,隨著超濾系統(tǒng)內(nèi)酶液溫度越高,膜通量也越高,超濾溫度為20℃時(shí)膜通量最低。由于溫度升高,超濾膜的溶脹速度加快,而導(dǎo)致膜通量的快速下降,溫度達(dá)到30℃時(shí),純化初始階段其膜通量達(dá)到最高值,但溫度為25℃與30 ℃時(shí)濃縮后期溫度對(duì)超濾膜通量的影響不太明顯,膜通量較為相近的情況,理論上必須選用比較高的溫度,因?yàn)闇囟仍礁?過氧化氫酶的黏度越小,從而有效控制超濾膜通量的降低。但是考慮到保持過氧化氫酶的活性,選擇25 ℃為過氧化氫酶膜純化濃縮的最佳超濾溫度。

圖2 超濾溫度對(duì)膜通量的影響Fig.2 Effect of ultrafiltration temperature on membrane flux

2.1.3 超濾壓力對(duì)膜通量的影響

粗酶液在超濾溫度25℃、流速20 m/s、截留分子質(zhì)量250 kDa超濾膜的條件下,用壓力梯度0.10 MPa、0.15 MPa、0.20 MPa、0.25 MPa超濾膜純化濃縮1 h,每10 min測一次膜通量。由圖3所示,整體壓力膜通量都趨于下降,其膜通量降低幅度不同。其中0.10 MPa膜通量最低,膜通量下降速度最快,0.25 MPa膜通量最大。隨著濃縮時(shí)間的延長,0.15 MPa、0.20 MPa、0.25 MPa膜通量都集中在一個(gè)范圍,其中0.20 MPa時(shí)膜通量比較高,而且下降速度最平緩。考慮到膜通量和節(jié)能方面,最佳濃縮壓力選擇0.20 MPa。

圖3 超濾壓力對(duì)膜通量的影響Fig.3 Effect of ultrafiltration pressure on membrane flux

2.1.4 流速對(duì)膜通量的影響

粗酶液在壓力0.20 MPa、溫度25℃、截留分子質(zhì)量250 kDa超濾膜的條件下,用流速梯度為10 m/s、20 m/s、30 m/s超濾膜純化濃縮1 h,每10 min測一次膜通量。由圖4所示,隨著進(jìn)料流速增大,膜通量越大。流速為10 m/s時(shí)膜通量最低,流速30 m/s時(shí)膜通量最高。由于物料傳質(zhì)系數(shù)與進(jìn)料流速成正比,純化酶液含有的雜蛋白物質(zhì)透過膜時(shí)間較短,膜表面上不會(huì)出現(xiàn)濾餅層,其膜通量可以保持較高的水平。因此在純化濃縮過程中保證充分截留過氧化氫酶的前提下,進(jìn)料流速選擇30 m/s。

圖4 流速對(duì)膜通量的影響Fig.4 Effect of velocity on membrane flux

2.1.5 濃縮倍數(shù)對(duì)膜通量的影響

圖5 濃縮倍數(shù)對(duì)膜通量的影響Fig.5 Effect of concentration multiple on membrane flux

由圖5可知,粗酶液在上述試驗(yàn)因素確定的最佳工藝條件下純化濃縮,膜濃縮倍數(shù)升高會(huì)導(dǎo)致膜濃縮時(shí)間延長,超濾膜通量下降。當(dāng)濃縮倍數(shù)為3倍時(shí),其膜通量呈現(xiàn)比較穩(wěn)定狀態(tài)。因此過氧化氫酶超濾膜最佳濃縮倍數(shù)為3倍。

2.2 酶學(xué)性質(zhì)研究

2.2.1 酶最適溫度測定

圖6 溫度對(duì)過氧化氫酶活力的影響Fig.6 Effect of temperature on catalase activity

由圖6可知,20～35℃酶活呈上升至穩(wěn)定趨勢,溫度超過35℃后酶活迅速下降。牦牛肝過氧化氫酶最適溫度選擇35℃。

2.2.2 酶最適pH值測定

圖7 pH值對(duì)過氧化氫酶活力的影響Fig.7 Effect of pH value on catalase activity

由圖7可知,隨著pH值的升高,過氧化氫酶的酶活逐漸升高,在pH值為7.5時(shí),酶活為最高;pH值＞9.5時(shí),酶活急劇下降。所以牦牛肝臟過氧化氫酶最適pH值為7.5。

2.2.3 米氏常數(shù)Km以及最大反應(yīng)速度Vm的測定

圖8 過氧化氫酶催化過氧化氫的雙倒數(shù)圖Fig.8 Lineweaver-Burk plot for H2O2catalyzed by the catalase

由圖8所示,得到線性回歸方程y=6.708 9x+0.125,牦牛肝過氧化氫酶的最大反應(yīng)速度Vm值為8.0 μmol/min,米氏常數(shù)(Km)值為53.8 mmol/L。

3 結(jié)論

甘南牦牛肝過氧化氫酶純化最佳工藝為:截留分子質(zhì)量超濾膜250 kDa、超濾溫度25℃、壓力0.20 MPa、流速30 m/s,在最佳工藝條件下,超濾膜通量達(dá)到比較穩(wěn)定狀態(tài)最佳濃縮倍數(shù)為3倍。

研究結(jié)果表明,制備的牦牛肝過氧化氫酶最適溫度為35℃,與貽貝過氧化氫酶的最適溫度(35℃)[9]相近。最適pH值為7.5,與大鼠(7.5)[7]、蘆薈(7.5)[13]、豬血(7.4)[15]、鴨肝(7.0)[5]、貽貝(7.0)[9]、火龍果(7.0)[16]中的過氧化氫酶最適pH值近似,說明不同來源的過氧化氫酶對(duì)環(huán)境中pH值有相似的適應(yīng)性。米氏常數(shù)(Km)值為53.8 mmol/L,與鈍頂螺旋藻過氧化氫酶的Km值(54 mmol/L)[17]相近,與蚯蚓過氧化氫酶米氏常數(shù)(Km)143 mmol/L[18]相比,蚯蚓過氧化氫酶對(duì)底物的親和力要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于牦牛肝過氧化氫酶,牦牛肝過氧化氫酶與底物過氧化氫結(jié)合專一性較高。

[1]張前榮,莊尹宏,溫慶放,等.絲瓜過氧化氫酶(Catalase,CAT)酶學(xué)特性的研究[J].中國園藝文摘,2017,9(1):1-3.

[2]劉曉輝,何司彥,林奕娜,等.韭菜過氧化氫酶不同環(huán)境下活性研究[J].佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2017,35(1):32-35.

[3]MARCEL Z,FRANZ K.Understanding the structure and function of catalases：clues from molecular evolution andin vitromutagenesis[J].Progr Biophy Mol Biol,1999,72：19-66.

[4]于德玲,王昌留.過氧化氫酶的研究進(jìn)展[J].中國組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志,2016,25(2):189-194.

[5]楊佳棟,魏鳳菊,潘新新,等.動(dòng)物過氧化氫酶(CAT)的研究進(jìn)展[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2016,7(1):59-62.

[6]沈國強(qiáng),張 棟,楊春霞.牛肝過氧化氫酶提取工藝的研究[J].化學(xué)與生物工程,2008,25(1):37-39.

[7]周娜磊,李 玥,高 媛,等.大鼠肝臟過氧化氫酶的分離純化及性質(zhì)[J].氨基酸和生物資源,2009,31(2):56-58.

[8]田薈琳,張坤生.豬血中過氧化氫酶的提取及性質(zhì)研究[J].食品科學(xué),2006,27(12):311-314.

[9]林少琴,蘭瑞芳,余 萍,等.貽貝過氧化氫酶的純化及部分性質(zhì)[J].食品科學(xué),2000,21(11):22-24.

[10]汪開治.從人胎盤提純過氧化氫酶[J].生物技術(shù)通報(bào),1999(5):6-7.

[11]GOTH L.A simple method for determination of serum catalase activity and revision of reference range[J].Clin Chimia Acta,1991,196(2-3)：143-152.

[12]朱德榮,段惠軍.現(xiàn)代醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2002:7-12.

[13]LOWRY D H.Protein measurement with the folin phenol reagent[J].J Biol Chem,1951,193(1)：265-275.

[14]陳鈞輝,陶 力,朱婉華,等.生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)[M].北京:科學(xué)出版社,2004:36-42.

[15]田薈琳,張坤生.豬血中過氧化氫酶的提取及性質(zhì)研究[J].食品科學(xué),2006,27(12):311-314.

[16]張福平,劉燕菁.火龍果過氧化氫酶活性的研究[J].食品工業(yè)科技,2008,29(11):128-132.

[17]栗淑媛,劉 燕.螺旋藻過氧化氫酶的比較研究[J].微生物學(xué)報(bào),2002(6):16-19.

[18]徐煒紅,楊齊衡,路英華,等.蚯蚓過氧化氫酶的純化及性質(zhì)[J].華東師范大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,1996(4):95-100.

FENG Ping,LI Zhengtao,CHEN Qing'an,ZHAI Danyun,DONG Yanhu
(Gansu Institute of Business and Technology Co.,Ltd.,Lanzhou 730020,China)

Q554

0254-5071(2017)11-0130-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.11.028

2017-08-14

馮 平(1984-),女,工程師,碩士,研究方向?yàn)樯锕こ獭?/p>