微生物轉(zhuǎn)化人參皂苷Re為人參皂苷Rh1的研究

張麗娜,明有山,曲波權(quán),全艷玲,叢景香,吳秀紅*

(遼寧科技大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院,遼寧 鞍山 114000)

微生物轉(zhuǎn)化人參皂苷Re為人參皂苷Rh1的研究

張麗娜,明有山,曲波權(quán),全艷玲,叢景香,吳秀紅*

(遼寧科技大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院,遼寧 鞍山 114000)

人參皂苷Re是人參的主要藥理活性成分,具有抑制癌細胞增長、阻止癌細胞轉(zhuǎn)移及保護神經(jīng)等重要生理作用,稀有人參皂苷Rh1在抗癌方面的療效更為顯著。為獲得較高含量的Rh1,微生物轉(zhuǎn)化是目前較為有效途徑。該研究從人參種植土中篩選可轉(zhuǎn)化常量人參皂苷Re為稀有人參皂苷Rh1的目的菌株S329,以西洋參提取物為反應(yīng)底物進行微生物發(fā)酵實驗,利用高效液相色譜(HPLC)法對人參皂苷Re及其發(fā)酵產(chǎn)物進行分析。結(jié)果表明,通過對菌株形態(tài)學(xué)觀察和18S rDNA測序分析,且通過在NCBI數(shù)據(jù)庫上的Blast比對分析,鑒定高效菌株S329屬于溜曲霉(Aspergillus tamarii),人參皂苷Re轉(zhuǎn)化人參皂苷Rh1的轉(zhuǎn)化率為27.65%。

人參皂苷Re;人參皂苷Rh1;發(fā)酵;菌株篩選;微生物轉(zhuǎn)化

人參具有延緩衰老、益智益肺、滋補強壯和抗腫瘤等藥理活性,被用于治療多種疾病已有幾千年的歷史,此外,人參也被廣泛應(yīng)用于制藥、化妝品等商業(yè)化領(lǐng)域[1-3]。最常見的人參種類有人參、三七和西洋參等。人參皂苷是人參的主要藥理活性成分,是一種以糖苷配基為主鏈,多糖、氨基酸、類黃酮為側(cè)鏈的多萜類物質(zhì)[4-6],可以分為二醇型、三醇型、齊墩果酸和擬人參皂苷元。人參皂苷因結(jié)構(gòu)不同,而具有不同的藥理活性[7]。稀有人參皂苷藥理活性明顯高于常量人參皂苷,如人參皂苷Rh1和Rh2在抑制各種腫瘤細胞增長方面效果顯著,而在人參中含量僅為萬分之一和不到十萬分之二[8-10]。因此,在人參中直接提取稀有皂苷用于醫(yī)學(xué)治療是很不經(jīng)濟的。

分析稀有人參皂苷和常量人參皂苷結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)通過改變β-葡萄糖分子[11-12]的數(shù)量和位置,可以實現(xiàn)常量人參皂苷轉(zhuǎn)化稀有人參皂苷,常見方法有化學(xué)合成,弱酸、弱堿的解離,生物轉(zhuǎn)化和酶轉(zhuǎn)化法[13-14]?；瘜W(xué)法常伴隨羥基化和差向異構(gòu)化產(chǎn)物,且大量使用有機溶劑對環(huán)境不利;酶轉(zhuǎn)化法和生物轉(zhuǎn)化法條件溫和、轉(zhuǎn)化率較高、環(huán)境友好、產(chǎn)物單一,更適合工業(yè)生產(chǎn)。目前利用微生物轉(zhuǎn)化研究稀有人參皂苷已有報道,并已用于制備稀有人參皂苷[15-18]。

基于微生物在生物轉(zhuǎn)化方面的研究與應(yīng)用,本研究主要從人參種植土中篩選可以轉(zhuǎn)化人參皂苷Rh1的菌株,將常量人參皂苷Re微生物轉(zhuǎn)化為稀有人參皂苷Rh1,并采用高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)法進行發(fā)酵產(chǎn)物檢測,并對篩選菌株進行形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)鑒定。所得菌株可高效轉(zhuǎn)化人參皂苷Re,為擴大人參皂苷在醫(yī)藥領(lǐng)域和規(guī)模化生產(chǎn)中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

西洋參粗提物(含10%人參皂苷Re):陜西天之潤科技有限公司;體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇(分析純):沈陽市新東試劑廠;乙腈(色譜純):美國TEADE科技有限公司;葡萄糖(分析純)、硫酸亞鐵(分析純):北京化工廠;蛋白胨(生化試劑):北京奧博星生物技術(shù)有限公司;磷酸氫二鉀(分析純):天津市漢沽區(qū)濱海福利化工廠;硫酸鎂(分析純):國藥集團化學(xué)試劑有限公司;瓊脂(生化試劑):福建泉州市泉港化工廠;硝酸鈉(分析純):沈陽市試劑一廠;硅膠(80-120目):青島海洋化工;人參皂苷Re、人參皂苷Rh1:中國藥品生物制品檢定所;人參種植土:吉林松原人參種植土。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potatodextroseagar,PDA)培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g/L、葡萄糖20 g/L、蛋白胨10 g/L、瓊脂20 g/L。

種子培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基):馬鈴薯20g/L,葡萄糖10g/L,蛋白胨10 g/L。

發(fā)酵培養(yǎng)基:NaNO31.5g/L,蛋白胨1.0g/L,MgSO4·7H2O 0.5g/L,K2HPO41.0 g/L,FeSO40.1 g/L,加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%Re作為發(fā)酵底物,pH為中性。

上述培養(yǎng)基均在121℃下進行高溫濕法滅菌30 min。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1100高效液相色譜儀:美國Agilent科技有限公司;GR-202電子分析天平:日本AND公司;B-30立式壓力蒸汽滅菌器:上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;SW-CJ-5超凈工作臺:上海錦屏儀器儀表有限公司通州分公司;LRH-250A生化培養(yǎng)箱:廣東醫(yī)療器械廠;RE-2000E旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀:鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;BSD-150空氣振蕩培養(yǎng)箱:上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.3 方法

1.3.1 硅膠柱分離人參皂苷Re

稱取2.000 g西洋參提取物(含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的人參皂苷Re),充分溶解于少量甲醇中,加入6.000 g硅膠,不斷攪拌,水浴蒸干,蒸干后的樣品用研缽將其研磨,制成樣品膠待用。稱取適量硅膠裝入玻璃柱內(nèi),再鋪一層定量濾紙及海沙;將樣品膠置于硅膠柱頂部,以氯仿∶甲醇=9∶1、7∶3、5∶5、3∶7、1∶9(V/V)的洗脫液依次洗脫,各梯度洗脫液為50 mL,收集柱后餾分。將含有Re的餾分段進行濃縮,用高效液相色譜檢測分析,制得人參皂苷Re的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為50%,以此作為微生物轉(zhuǎn)化的底物。

1.3.2 菌株分離

配制1 g/L的人參種植土溶液,依次稀釋至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5倍,在無菌操作條件下,分別將不同濃度的人參種植土溶液加到裝有PDA培養(yǎng)基的平板上,置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～7 d。

在無菌操作條件下,把生長狀態(tài)較好的孢子小心地用接種針挑出,在已經(jīng)滅菌的平板固體培養(yǎng)基中劃線,重復(fù)劃線幾次,每個菌株接兩個,在28℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～7d,培養(yǎng)好后觀察,若純化的培養(yǎng)基中還有其他菌株,則用同樣的方法操作,直到培養(yǎng)基中只有單一菌株菌落為止。

在無菌條件下,將分離純化好的菌株接種到斜面固體培養(yǎng)基,置于28℃培養(yǎng)箱內(nèi),培養(yǎng)3～7 d,待菌絲長滿斜面,即可將純化的菌株放入冰箱保存。

1.3.3 種子液的制備

在無菌條件下將斜面培養(yǎng)基中孢子接種到種子液中,置于28℃、轉(zhuǎn)速為160 r/min的空氣振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d,待長出菌絲球進行轉(zhuǎn)化實驗。

1.3.4 人參皂苷生物轉(zhuǎn)化

發(fā)酵液培養(yǎng)基按裝液量30 mL/50 mL高壓滅菌,冷卻至室溫,在無菌操作條件下,將4 mL種子液的菌絲球接種到發(fā)酵液中,置于28℃、轉(zhuǎn)速為160 r/min的空氣振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 d。離心,過濾,利用高效液相色譜分析發(fā)酵液中的稀有人參皂苷Rh1的含量。

1.3.5 高效液相色譜分析條件

UG80-CAPCELL PAK NH2色譜柱(5 μm,4.6 mm×250mm),乙腈∶水(10∶90,V/V)為流動相,流速為0.8mL/min,柱溫為30.0℃,紫外檢測波長為203 nm,進樣量為20 μL。在此色譜條件下,按照人參皂苷Re和Rh1對照品的保留時間分別作為人參皂苷Re和Rh1的定性依據(jù)。人參皂苷Re和Rh1對照品的質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo),峰面積(y)為縱坐標(biāo),繪制人參皂苷Re和Rh1標(biāo)準(zhǔn)曲線,其線性回歸方程分別為y=6.3794x+20.419(R=0.9994)、y=3.6225x-50.125(R=0.9998),以此進行人參皂苷Re和Rh1的定量分析。

1.3.6 菌株的形態(tài)學(xué)觀察和18S rDNA序列鑒定

在顯微鏡下觀察高效菌株的形態(tài)特征。高效菌株委托上海生工生物工程股份有限公司測序。將取出的菌株基因組DNA為模板,采用NS1(GTAGTCATATGCTTGTCTC)和NS(GCATCACAGACCTGTTATTGCCTC)作為一對引物,進行特異性擴增,擴增產(chǎn)物長度約為1 189 bp。將聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)產(chǎn)物用1%瓊脂糖進行電泳(150 V、100 mA)分析,然后進行基因序列對比分析。

1.3.7 轉(zhuǎn)化率計算公式

式中:A為轉(zhuǎn)化率,%;其中c1為發(fā)酵液中人參皂苷Rh1的質(zhì)量濃度,mg/L;V1為發(fā)酵后發(fā)酵液的體積,mL;c0為空白對照發(fā)酵液中人參皂苷Re的質(zhì)量濃度,mg/L;V0為空白對照發(fā)酵液體積,mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 高效菌株的形態(tài)學(xué)觀察和基因組分類測序分析

2.1.1 菌株形態(tài)學(xué)觀察

將分離純化的高效菌株S329經(jīng)PDA培養(yǎng)基培養(yǎng),并在顯微鏡下觀察菌株S329形態(tài)特征,結(jié)果見圖1。

圖1 分離菌株S329的菌落形態(tài)(A)及孢子形態(tài)(B)Fig.1 Colonial morphology(A)and spore morphology(B)of the isolated strain S329

圖1 A可知,分離菌株S329呈鋪開式生長,中央部分稍現(xiàn)絮狀,初為黃綠色,后呈深棕褐色。由圖1B可知,在顯微鏡下可觀察到菌株S329分生孢子呈球形,直徑為180 μm;小頂囊呈球形,直徑為80 μm,可觀察到足細胞,初步確認(rèn)該高效菌株S329為多細胞的曲霉屬(Aspergillus)。

2.1.2 分離菌株分子生物學(xué)鑒定

對分離菌株S329進行分子生物學(xué)鑒定,將測得的18S rDNA基因序列與GenBank中核酸數(shù)據(jù)庫進行對比分析,找到與測得的菌株同源性相近的屬,再利用DNAstar軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)果如圖2所示。

圖2 分離菌株S329系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of the isolated strain S329

由圖2可知,分離菌株S329與溜曲霉(Aspergillustamarii)ZJUT ZQ013的相似度為100%,鑒定分離菌株S329為溜曲霉(Aspergillus tamarii)。

2.2 HPLC檢測分析人參皂苷

在1.3.5高效液相色譜分析條件下分析發(fā)酵液中人參皂苷Re和Rh1含量,并與人參皂苷Re和Rh1對照品色譜圖對比分析,結(jié)果如圖3所示。

在此色譜條件下,人參皂苷Re和Rh1的保留時間分別為8.125 min和21.773 min,分別以以人參皂苷Re和Rh1對照品的出峰時間相比較,作為人參皂苷Re和Rh1的定性依據(jù)。由圖3(a)可知,發(fā)酵前人參皂苷Rh1含量很少,經(jīng)28℃、160 r/min搖床發(fā)酵6 d后,由圖3(b)可知,Re含量明顯減小,Rh1含量大大增加,由標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程計算發(fā)酵前后Re和Rh1含量變化。人參皂苷Re轉(zhuǎn)化為Rh1的轉(zhuǎn)化率為27.65%,優(yōu)于現(xiàn)有研究報道[19]。

圖3 發(fā)酵液發(fā)酵前(a)、發(fā)酵后(b)以及人參皂苷標(biāo)品(c)的高效液相色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of fermentation liquid before fermentation(a),after fermentation(b)and ginsenoside standard(c)

3 結(jié)論

從人參種植土中篩取的高效菌株經(jīng)生態(tài)學(xué)觀察和分子學(xué)鑒定分析確定為溜曲霉(Aspergillus tamarii)ZJUT ZQ013,在最優(yōu)發(fā)酵條件下可轉(zhuǎn)化常量人參皂苷Re為稀有人參皂苷Rh1,轉(zhuǎn)化率為27.65%,稀有人參皂苷Rh1在西洋參和人參中含量為0.01%,結(jié)果表明高效發(fā)酵后所得菌株Rh1量是人參中含量的約2 700倍。為進一步分離制備稀有人參皂苷Rh1提供了基礎(chǔ)。

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ZHANG Lina,MING Youshan,QU Boquan,QUAN Yanling,CONG Jingxiang,WU Xiuhong*
(School of Chemical and Engineering,University of Science and Technology Liaoning,Anshan 114000,China)

Q33

0254-5071(2017)11-0114-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.11.025

2017-08-14

遼寧省教育廳項目(L2014106)

張麗娜(1991-),女,碩士研究生,研究方向為天然藥物的分離。

*通訊作者:吳秀紅(1968-),女,教授,博士,研究方向為天然藥物制備與分離。