溫度、pH對(duì)橡子粉浸提液轉(zhuǎn)化乙醇影響

郝秋娟,趙士豪*,李 娜,馬同鎖,于子簫

(1.河北經(jīng)貿(mào)大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院,河北 石家莊 050061;2.西南科技大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院,四川 綿陽(yáng) 621010)

溫度、pH對(duì)橡子粉浸提液轉(zhuǎn)化乙醇影響

郝秋娟1,趙士豪1*,李 娜1,馬同鎖1,于子簫2

(1.河北經(jīng)貿(mào)大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院,河北 石家莊 050061;2.西南科技大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院,四川 綿陽(yáng) 621010)

為進(jìn)一步提高橡子粉浸提液轉(zhuǎn)化乙醇的水平,對(duì)發(fā)酵工藝進(jìn)行了優(yōu)化,采用了分階段控溫工藝和恒pH發(fā)酵工藝。優(yōu)化后發(fā)酵工藝為發(fā)酵前期溫度30℃,20 h后發(fā)酵溫度28℃;發(fā)酵過(guò)程中控制恒定pH 4.5;在此工藝條件下,發(fā)酵液結(jié)束后(72 h)酒精度為6.27%vol,比優(yōu)化前酒精度提高27.18%。

橡子粉;溫度;pH;發(fā)酵工藝優(yōu)化

隨著全球各國(guó)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展,對(duì)能源的需求量不斷增加?；茉词悄茉唇Y(jié)構(gòu)的主體,其大量的使用,一方面使化石能源被開(kāi)采殆盡,令人類面臨能源枯竭的危險(xiǎn);另一方面也會(huì)造成環(huán)境變化和污染,威脅全球的生態(tài)安全[1]。

橡實(shí)是泛指除大量栽培種板栗以外的殼斗科植物種仁的總稱,我國(guó)橡實(shí)資源十分豐富,廣泛分布于湖南、廣西、東北、湖北、浙江、江西等地區(qū),年產(chǎn)量很大,其種仁中含有淀粉、蛋白質(zhì)、可溶性糖、維生素等多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),尤其是淀粉含量最高,可以達(dá)到50.6%～58.7%,具有廣闊的應(yīng)用前景[2]。如果利用橡實(shí)中的淀粉發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇,不但可以節(jié)約大量的糧食,緩解生物能源與人爭(zhēng)糧的問(wèn)題,而且對(duì)開(kāi)發(fā)野生植物橡實(shí)資源,發(fā)展林業(yè)經(jīng)濟(jì),應(yīng)對(duì)當(dāng)前國(guó)際能源危機(jī)有著重要的意義。目前對(duì)于橡子粉的研究多集中其淀粉的理化性質(zhì)和化學(xué)組成方面[3-11],但對(duì)于橡子淀粉轉(zhuǎn)化乙醇的工藝研究較少[12-14]。本研究以橡子粉浸提液為原料,主要針對(duì)發(fā)酵過(guò)程中溫度和pH的控制進(jìn)行了研究,以期為以橡子粉為原料采用液體發(fā)酵制備燃料乙醇的工藝研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

橡子:采自河南信陽(yáng);釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae):河北經(jīng)貿(mào)大學(xué)生物工藝實(shí)驗(yàn)室保藏;中溫淀粉酶(3 700 U/g)、糖化酶(100 000 U/g):北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LDZX-50FBS立式壓力蒸汽滅菌器:上海申安醫(yī)療器械廠;SW-CJ-1CU超凈工作臺(tái):上海捷呈實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;DPPX-9272B電熱恒溫培養(yǎng)箱:上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;LYT-330折光儀:上海淋譽(yù)貿(mào)易有限公司;BM1000型雙目生物顯微鏡:南京江南永新光學(xué)有限公司;HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋:江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 橡子粉浸提液的制備[3]

稱取適量橡子粉,控制料水比為1∶5(g∶mL),混合均勻,將pH調(diào)至7.5,攪拌均勻,電爐煮沸30 min,煮沸期間不斷攪拌。煮沸結(jié)束后,冷卻至70℃,按30 U/g的量加入中溫α-淀粉酶,加入0.3%的CaCl2,攪拌均勻,控制pH7.5,保持120 min,冷卻至50℃,調(diào)pH4.5,糖化酶添加量300 U/g,攪拌均勻,保持120min。糖化結(jié)束后過(guò)濾,收集清液,煮沸,用折光儀測(cè)定糖度,調(diào)整糖度為16°Bx。

1.3.2 發(fā)酵溫度的確定

恒溫發(fā)酵實(shí)驗(yàn):取浸提液300 mL于500 mL的三角瓶中,控制糖度為16°Bx,調(diào)pH 6.0,接種量4%,溫度分別控制在24℃、26℃、28℃、30℃、32℃進(jìn)行發(fā)酵。發(fā)酵結(jié)束測(cè)定酒精度。

變溫發(fā)酵實(shí)驗(yàn):(1)前20h控制28℃,中后期控制30℃;(2)前20 h控制28℃,降溫至5℃后,直接升溫至30℃培養(yǎng);(3)前20 h控制30℃培養(yǎng),中后期控制28℃;(4)前期30℃培養(yǎng),降溫至5℃后,直接升溫至28℃培養(yǎng);(5)控制恒溫28℃培養(yǎng)。其他同恒溫發(fā)酵,發(fā)酵過(guò)程中每隔12 h測(cè)CO2的質(zhì)量損失情況、酵母數(shù),發(fā)酵結(jié)束后(72 h)測(cè)定酒精度。

1.3.3 發(fā)酵pH的確定

初始pH的確定:分別調(diào)整發(fā)酵液初始pH值為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0,按變溫工藝(3)進(jìn)行溫度控制,其他控制條件同上。發(fā)酵結(jié)束測(cè)定酒精度。

發(fā)酵過(guò)程恒定pH的控制:分別調(diào)整發(fā)酵液的初始pH值為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0,發(fā)酵過(guò)程中,每隔12 h對(duì)發(fā)酵液的pH進(jìn)行調(diào)整,使其維持恒定4.0、4.5、5.0、5.5、6.0,對(duì)照樣品控制初始pH5.0,發(fā)酵過(guò)程中pH不作調(diào)整。其他控制條件同上。發(fā)酵過(guò)程中,每隔12 h測(cè)發(fā)酵液質(zhì)量損失情況、酵母數(shù),發(fā)酵結(jié)束后(72 h)測(cè)發(fā)酵液中的酒精度。

1.3.4 測(cè)定方法

酒精度:按照參考文獻(xiàn)[15]的方法測(cè)定。

酵母數(shù):按照參考文獻(xiàn)[16]的方法測(cè)定。

CO2質(zhì)量損失:按照參考文獻(xiàn)[17]的方法測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵溫度的確定

2.1.1 恒溫發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

考察溫度對(duì)橡子粉浸提液轉(zhuǎn)化乙醇的影響,發(fā)酵結(jié)束測(cè)定酒精度,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 發(fā)酵溫度對(duì)酒精度的影響Fig.1 Effect of fermentation temperature on ethanol content

由圖1可知,隨著發(fā)酵溫度的逐漸升高,酒精度出現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì),并且在28℃時(shí)酒精度最高,為5.48%vol。溫度過(guò)低,會(huì)影響菌體生長(zhǎng),進(jìn)而使生產(chǎn)周期延長(zhǎng),會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵不完全;溫度過(guò)高,會(huì)影響菌體內(nèi)酶活性,使菌體過(guò)早衰老死亡,進(jìn)而影響最終發(fā)酵效果。故恒溫發(fā)酵的最適發(fā)酵溫度為28℃。但是有實(shí)驗(yàn)證明,在黑曲霉[18]、細(xì)菌[19]和酵母[20]發(fā)酵過(guò)程中合理的分階段變溫工藝均會(huì)提高目的產(chǎn)物的產(chǎn)率。為了探究溫度對(duì)此發(fā)酵過(guò)程的影響,進(jìn)一步設(shè)計(jì)了分階段變溫工藝。

2.1.2 變溫發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

發(fā)酵過(guò)程中檢測(cè)CO2質(zhì)量損失情況、菌體濃度以及酒精度,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2～圖4。

圖2 不同溫度控制工藝對(duì)CO2質(zhì)量損失的影響Fig.2 Effects of different temperature control process on the mass loss of CO2

圖3 不同溫度控制對(duì)酵母菌數(shù)的影響Fig.3 Effects of different temperature control process on yeast count

由圖2～圖4可知,工藝(1)由于前期溫度較低,酵母細(xì)胞數(shù)較少,為4.92×107個(gè)/mL,因此CO2質(zhì)量損失及酒精度均較少;工藝(2)和工藝(4)中均采用了冷處理抑制中后期酵母菌的生長(zhǎng),可能是冷處理在一定程度上影響了酵母酶系統(tǒng),影響了酵母對(duì)糖的利用情況進(jìn)而影響了酵母生長(zhǎng),故低溫冷處理不適用于酵母轉(zhuǎn)化產(chǎn)酒精的發(fā)酵過(guò)程。采用工藝(5)得到的酵母細(xì)胞最多,為5.8×107個(gè)/mL,但CO2質(zhì)量損失和酒精度(4.72%vol)并不高,這可能是由于酵母大量繁殖與產(chǎn)物轉(zhuǎn)化競(jìng)爭(zhēng)了底物,故降低了酒精產(chǎn)率;采用工藝(3)時(shí)酵母菌數(shù)為5.4×107個(gè)/mL,CO2質(zhì)量損失13.8 g,酒精度最高5.79%vol。所以采用工藝(3)即前期30℃,中后期28℃是橡實(shí)粉發(fā)酵轉(zhuǎn)化乙醇的最佳溫度。

圖4 不同溫度控制工藝對(duì)酒精度的影響Fig.4 Effects of different temperature control process on ethanol content

2.2 發(fā)酵pH的確定

2.2.1 初始pH的確定

通常酵母菌在pH3.0～7.5的范圍內(nèi)均能生長(zhǎng),發(fā)酵液的pH不僅影響底物的解離情況,還影響微生物細(xì)胞膜的帶電情況,進(jìn)而影響微生物細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收,同時(shí)還影響其細(xì)胞的生長(zhǎng)和代謝。并且pH不同,還會(huì)影響葡萄糖代謝關(guān)鍵酶的活力[21]。考察初始pH對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酒精的影響,結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 初始pH對(duì)酒精度的影響Fig.5 Effect of initial pH value on ethanol content

由圖5可知,隨著pH值的逐漸增大,酒精度出現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),其中pH 5.0時(shí)酒精度最高,為5.85%vol。可見(jiàn)該酵母在pH4.5～5.5較適宜。

2.2.2 恒定pH的控制

為了進(jìn)一步考察發(fā)酵過(guò)程pH對(duì)于發(fā)酵的影響,按照實(shí)驗(yàn)方法1.3.3分別控制不同的過(guò)程pH,結(jié)果見(jiàn)圖6～圖8。

由圖6～圖8可知,酵母細(xì)胞生長(zhǎng)的最適pH值為4.5～5.0,當(dāng)發(fā)酵液維持恒定pH4.5時(shí),CO2質(zhì)量損失和發(fā)酵液酒精度最大,分別為10 g和6.03%vol;酵母數(shù)與恒定pH5.0時(shí)酵母數(shù)相當(dāng),為6×107個(gè)/mL,略高于初始pH5.0條件下酵母數(shù);恒pH4.0和恒pH6.0、恒pH5.5的酵母數(shù)低于前3種條件。這可能是因?yàn)榘l(fā)酵液呈弱酸性時(shí),可以抑制發(fā)酵液中的雜菌生長(zhǎng),促進(jìn)酵母細(xì)胞的酒精發(fā)酵作用,但是當(dāng)pH過(guò)低時(shí),酵母細(xì)胞中的酒化酶就會(huì)受到抑制,使產(chǎn)酒量減少。采用初始pH5.0發(fā)酵時(shí),隨著發(fā)酵的進(jìn)行,代謝產(chǎn)物增加,pH不斷降低,當(dāng)pH過(guò)低時(shí),會(huì)使酵母菌大量死亡。所以控制恒定pH4.5是橡實(shí)粉發(fā)酵轉(zhuǎn)化乙醇的最佳pH。

圖6 不同恒pH對(duì)CO2質(zhì)量損失的影響Fig.6 Effects of constant pH on the mass loss of CO2

圖7 不同恒pH對(duì)酵母生長(zhǎng)的影響Fig.7 Effects of different constant pH on yeast growth

圖8 不同恒pH對(duì)酒精度的影響Fig.8 Effects of different constant pH on ethanol content

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為了考察優(yōu)化后發(fā)酵工藝的效果,分別采用優(yōu)化前工藝和優(yōu)化后工藝進(jìn)行發(fā)酵,發(fā)酵過(guò)程中考察CO2質(zhì)量損失、酵母數(shù)以及酒精度。取3組平行實(shí)驗(yàn)的平均值作圖,結(jié)果見(jiàn)圖9～圖11。

圖9 優(yōu)化前后CO2質(zhì)量損失對(duì)比Fig.9 Comparison of the CO2mass loss before and after optimization

圖10 優(yōu)化前后酵母菌生長(zhǎng)情況對(duì)比Fig.10 Comparison of yeast growth before and after optimization

圖11 優(yōu)化前后酒精度對(duì)比Fig.11 Comparison of ethanol content before and after optimization

由圖9～圖11可知,優(yōu)化前CO2質(zhì)量損失最大為9.0g,酵母數(shù)為5.1×107個(gè)/mL,酒精度為4.93%vol;優(yōu)化后CO2質(zhì)量損失最大為11.6 g,酵母數(shù)為5.5×107個(gè)/mL,酒精度為6.27%vol;優(yōu)化后比優(yōu)化前CO2質(zhì)量損失提高28.9%,酵母數(shù)增加13.7%,酒精度提高27.18%。綜上所述,經(jīng)優(yōu)化后發(fā)酵工藝更有利于酵母的生長(zhǎng)繁殖和代謝。

3 結(jié)論

經(jīng)研究,橡實(shí)粉浸提液發(fā)酵轉(zhuǎn)化乙醇的最佳工藝條件為:發(fā)酵前期溫度30℃,20 h后發(fā)酵溫度28℃;采用恒定pH 4.5;在此工藝條件下,發(fā)酵液結(jié)束后(72 h)酒精度為6.27%vol,比優(yōu)化前酒精度提高27.18%。合理的溫度和pH控制有利于目的產(chǎn)物的獲得。

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HAO Qiujuan1,ZHAO Shihao1*,LI Na1,MA Tongsuo1,YU Zixiao2
(1.College of Biological Science and Engineering,Hebei University of Economics and Business,Shijiazhuang 050061,China;2.School of Life Science and Engineering,Southwest University of Science and Technology,Mianyang 621010,China)

TS231

0254-5071(2017)11-0110-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.11.024

2017-08-20

河北省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(14236802D-2);河北省高等學(xué)?？茖W(xué)研究計(jì)劃項(xiàng)目(QN2015092);河北經(jīng)貿(mào)大學(xué)2014年大學(xué)生創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目(201400052)

郝秋娟(1976-),女,講師,碩士,主要從事發(fā)酵工程方向的教學(xué)和研究工作。

*通訊作者:趙士豪(1966-),男,教授,碩士,主要從事食品加工技術(shù)方向的教學(xué)和研究工作。