濃香型白酒夏冬兩季生產(chǎn)車間及大曲中霉菌與放線菌的分離純化

李 良,鄭桂朋,吳 昊,岳 智,陳茂彬,鎮(zhèn) 達*

(1.武漢天龍黃鶴樓酒業(yè)有限公司,湖北 咸寧 437000;2.湖北工業(yè)大學(xué) 生物工程與食品學(xué)院 發(fā)酵工程教育部重點實驗室工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心 工業(yè)微生物湖北省重點實驗室,湖北 武漢 430068)

濃香型白酒夏冬兩季生產(chǎn)車間及大曲中霉菌與放線菌的分離純化

李 良1,鄭桂朋2,吳 昊1,岳 智2,陳茂彬2,鎮(zhèn) 達2*

(1.武漢天龍黃鶴樓酒業(yè)有限公司,湖北 咸寧 437000;2.湖北工業(yè)大學(xué) 生物工程與食品學(xué)院 發(fā)酵工程教育部重點實驗室工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心 工業(yè)微生物湖北省重點實驗室,湖北 武漢 430068)

為研究湖北咸寧濃香型黃鶴樓酒霉菌和放線菌的類型和特點,采用不同的培養(yǎng)基,對夏季和冬季車間樣品微生物進行分離純化及形態(tài)鑒別。結(jié)果表明,夏季車間空氣中分離到15株霉菌,大曲中10株霉菌(104～105CFU/g),窖泥中1株霉菌和1株放線菌(102～103CFU/g)。冬季車間空氣中分離到9株霉菌,大曲中9株霉菌(104～105CFU/g),窖泥中7株霉菌(103～104CFU/g);窖泥霉菌菌落的氣絲少,形態(tài)與空氣及大曲中的主要霉菌差異顯著。比較冬季和夏季樣品,僅從冬季大曲的曲心和曲皮中分離到青霉,從夏季底泥中分離到一株放線菌,冬季的空氣霉菌少于夏季,而冬季窖泥中的霉菌多于夏季。

濃香型白酒;生產(chǎn)車間;大曲;霉菌;放線菌;分離純化

中國白酒制曲工藝為開放式,酒窖發(fā)酵又是半開放式,它與窖外生態(tài)環(huán)境關(guān)系十分密切,水質(zhì)、土壤、氣候等因素?zé)o不影響到釀酒微生物區(qū)系形成。唐亞等[1]概括了中國川南地區(qū)的適宜白酒釀造的氣候特征,如溫暖、降雨量適中、濕潤、日照少、風(fēng)小。楊基智等[2]對山東省威海市與中國濃香型白酒主產(chǎn)地宜賓、瀘州在氣候環(huán)境條件進行比較,提出改進工藝的措施。相對而言,酒廠生產(chǎn)車間、窖池的分布、南北朝向、空氣流通條件對窖池微生態(tài)的影響更為直接有效,張良等[3]對瀘州古釀酒作坊空氣曲霉菌進行研究,發(fā)現(xiàn)了多種不同曲霉,并檢測了產(chǎn)酶種類,說明可能對入窖酒糟產(chǎn)生影響,但是近年來相關(guān)的研究還非常少。

湖北黃鶴樓酒濃香型生態(tài)釀酒基地位于湖北咸寧,該地區(qū)氣候溫和、降水充沛,長江依境東流,釀酒基地占地面積48.5 hm2,釀造車間位于地表以下,常年車間內(nèi)的氣溫保持在18～28℃,具有恒溫、低溫的優(yōu)越條件,為建立黃鶴樓濃香型白酒獨特的產(chǎn)品風(fēng)格打下基礎(chǔ)。本實驗立足于生產(chǎn)工藝中的車間空氣、窖泥的微生物種類及分布規(guī)律的研究,擬建立黃鶴樓酒生態(tài)洞釀車間的功能微生物菌種資源庫,總結(jié)黃鶴樓濃香型白酒獨特風(fēng)味的形成機理,以期為進一步改進生產(chǎn)工藝提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

空氣、大曲及窖泥樣品在5號車間當(dāng)天正常生產(chǎn)中采集,時間為2016年9月(夏季)及2017年2月(冬季)。

1.1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potatodextrose agar,PDA)培養(yǎng)基(用于真菌分離)、高鹽察氏瓊脂(saltCzapek-doxagar,SCA)培養(yǎng)基(用于真菌分離)、氯硝胺18%甘油瓊脂(dichloran 18%glycerol,DG18)培養(yǎng)基(用于真菌分離)、Isp2培養(yǎng)基(用于放線菌和真菌分離)、改良高氏1號(improved Gao 1,IG1)培養(yǎng)基(用于放線菌分離)、M1培養(yǎng)基(用于稀有放線菌分離):青島海博生物技術(shù)有限公司。

LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基:牛肉膏3 g,蛋白胨10 g,氯化鈉 5 g,瓊脂20 g,水1 000 mL,pH7.0～7.2。

YEPD培養(yǎng)基(yeast extract peptone dextrose,YEPD):酵母膏10g,蛋白胨20g,葡萄糖20g,瓊脂粉20g,水1000mL,pH自然。

1.1.3 化學(xué)試劑

蛋白胨、牛肉膏和酵母膏(均為生化試劑):北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠;葡萄糖、氯化鈉,雙乙酰、乙酸正戊酯(均為分析純)、瓊脂(生化試劑)、無水乙醇(色譜純):國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2D無菌操作臺:蘇州凈化設(shè)備有限公司;AR3130電子天平:美國Ohaus公司;VORTEX-BE1振蕩器:海門市其林貝爾儀器制造有限公司;DW-HL340低溫冰箱:中科美菱低溫科技有限責(zé)任公司;CX31RTSF顯微鏡:日本Olympus公司;LDZX-75KB立式蒸汽滅菌鍋:上海申安醫(yī)療器械有限公司;ZXSD-A1270生化培養(yǎng)箱:上海智城分析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 采樣方法

空氣樣品采用LB和YEPD平板共20個,在車間各方位放置30 min。窖泥表層去除后,取窖泥樣品。樣品用自封袋密封,低溫保存,一周內(nèi)完成分離純化操作。取塊狀大曲,去除表面2～3 mm層,取碎塊粉碎為曲皮樣品;從塊曲的截面挖取碎塊,粉碎后作為曲心樣品。

1.3.2 菌株的分離純化

空氣樣品用LB和YEPD平板采樣后,在30℃培養(yǎng)2～5d,及時挑出霉菌菌落純化。其他樣品采用稀釋分離法:準(zhǔn)確稱取樣品10 g放至含玻珠的90 mL無菌水中分散,梯度稀釋至10-1～10-4,實際使用3個梯度,取100 mL涂布各種培養(yǎng)基平板各2皿,30℃培養(yǎng)5 d,每天及時挑取菌落至YEPD平板純化。將所有純化的平板進行比較,對每種樣品的形態(tài)完全相同的平板保留一個,對不同培養(yǎng)基上出現(xiàn)相同形態(tài)的菌落予以記錄。

1.3.3 菌株保藏

采用斜面保藏及甘油管-40℃低溫保藏。

1.3.4 菌株形態(tài)觀察

對在YEPD平板培養(yǎng)3天時的菌落形態(tài)拍照記錄,取菌絲及孢子在40×(霉菌)或油鏡(放線菌)鏡檢,對菌絲、子實體和孢子進行觀察并拍照。

1.3.5 發(fā)酵及產(chǎn)物分析

從空氣及大曲中分離的霉菌孢子分別接種到麩皮培養(yǎng)基中(麩皮加水,含水量50%)。在500 mL三角瓶中,30℃的有氧條件下培養(yǎng)制成含大量孢子的麩曲。以高粱米浸泡24 h后,清洗,瀝干至含水量50%左右,100℃蒸30 min,使淀粉糊化。糊化的高粱米冷卻后加入10%大曲粉,0.1%麩曲,充分拌勻后,裝滿1 000 mL廣口試劑瓶,以兩層聚乙烯膜封口,于25℃培養(yǎng)箱中發(fā)酵2周。取出酒糟適量至圓底燒瓶,加1倍體積水,用小火加熱蒸餾,取前餾出物(40%)為樣品,以高粱米和大曲粉(不加入麩曲)的發(fā)酵酒糟的餾出物樣品為對照,樣品經(jīng)無水乙醇調(diào)節(jié)至體積分?jǐn)?shù)為60%后,加入乙酸正戊酯作為內(nèi)標(biāo),以標(biāo)準(zhǔn)雙乙酰為標(biāo)樣,參照胡格等[4]的分析方法,進行氣相色譜儀分析。

1.3.6 菌種的分子生物學(xué)鑒定

基因組DNA采用液氮十六烷基三甲基溴化銨(hexadecyltrimethylammonium bromide,CTAB)法提取,以引物ITS1/ITS4擴增18S rDNA片段,采用3730測序儀測序,對序列進行美國國家生物技術(shù)信息中心(National Center of Biotechnology Information,NCBI)blast分析,由北京六合華大基因科技有限公司完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 夏季車間空氣中微生物分析

表1 夏季車間空氣中分離到的霉菌Table 1 Moulds isolated from air samples in summer workshop

續(xù)表

由表1可知,空氣中霉菌的菌落形態(tài)非常豐富,共分離到15株不同形態(tài)的霉菌,未分離到放線菌。夏季空氣霉菌的多樣性很強,樣品中霉菌子實體包括孢子囊(膨大,有外膜)、分生孢子梗(無膨大的頂囊,但有分枝的孢子梗,上面著生成串孢子)、分生孢子頭(有膨大的頂囊,上面著生成串孢子)及孢子座(有其他復(fù)雜的著生孢子的結(jié)構(gòu)),菌絲包括有隔和無隔,甚至有卷曲狀菌絲,孢子形狀也有不常見的柱狀和鐮刀狀。其中菌株P(guān)1根據(jù)形態(tài)鑒定為青霉,其他菌株暫未確定其種屬。

2.2 夏季窖泥中微生物分析

表2 夏季窖泥中分離到的霉菌及放線菌Table 2 Moulds and actinomycetes isolated from summer mud samples

由表2可知,壁泥和底泥中僅從底泥中分離到兩種菌株,包括放線菌6P1及霉菌6D1。這兩種菌落出現(xiàn)在10-2稀釋度平板上,說明數(shù)量較少。

2.3 夏季大曲中微生物分析

由表3可知,從大曲皮及曲心中分離出10株霉菌,其中曲皮5株,曲心5株。從形態(tài)上劃分,主要有4種類型:一是具有孢子囊、氣絲豐富的類型,與根霉相似,但也包括有隔菌絲的類型,還有待進一步細(xì)分;二是曲霉型,具有頂囊和孢子鏈;三是具孢子囊,但是菌落氣絲很少;四是氣絲少,無頂囊而具有孢子鏈的類型。從曲皮及曲心中分離到的霉菌有相同類型,也有不同類型,但是均未分離到青霉和放線菌。

表3 夏季大曲中分離到的霉菌Table 3 Moulds isolated from summer Daqu samples

2.4 冬季洞釀車間空氣中微生物分析

根據(jù)第一批培養(yǎng)基的分離效果,第二批樣品采用LB及YEPD兩種平板分離車間空氣霉菌和放線菌,共獲得9株,結(jié)果見表4。由表4可知,具有近似根霉形態(tài)的菌株較多,也有一株曲霉,另外菌株L23,為長囊狀孢子囊,含內(nèi)生孢子,而L24為外生孢子,但未觀察到子實體,總共有四種主要形態(tài)。沒有分離到青霉和放線菌。與2016年9月采集的樣品比較,2017年2月(冬季)的發(fā)酵車間空氣中的霉菌種類較少。

表4 冬季生產(chǎn)車間的空氣中分離到的霉菌Table 4 Moulds isolated from the air samples in winter workshop

2.5 冬季窖泥微生物分析

由表5可知,在窖泥中獲得7株霉菌,這些菌株形態(tài)與根霉、曲霉、青霉等常見類型不同,普遍無明顯氣絲。菌株D22具有外生孢子及膨大的頂囊,但是其孢子不是呈串生長,與曲霉差別明顯。與2016年9月的窖泥樣品比較,這次獲得的霉菌類型較多,相同之處在于,從兩批樣品中的窖泥中獲得的霉菌均無明顯氣絲。

2.6 冬季大曲微生物分析

從2017年2月這批大曲樣品中共分到9種霉菌,結(jié)果見表6。由表6可知,其中6株氣絲豐富,有孢子囊和內(nèi)生孢子,與根霉相似,另有兩株與青霉相似(曲皮、曲心各一株),有一株與曲霉相似,來自曲皮。各自數(shù)量級達到104～105CFU/g。根霉類型的菌株差別在于孢子囊數(shù)量不同,以及菌絲有隔和無隔的差別,有待細(xì)分。曲心和曲皮中均分離到青霉,這與上次夏季大曲樣品不同。樣品中未分到放線菌。

2.7 不同培養(yǎng)基的分離效果

對2017年冬季各樣品的6種培養(yǎng)基分離獲得的菌株數(shù)進行統(tǒng)計結(jié)果見表7。由表7可知,對每個樣品而言,SCA、DG18、Isp2、M1和PDA培養(yǎng)基都易于生長霉菌。高鹽察氏培養(yǎng)基營養(yǎng)物豐富,即使有高鹽環(huán)境但仍然有較多霉菌生長,說明大曲中的霉菌較耐高鹽,但窖泥中的霉菌不適于該培養(yǎng)基。DG18培養(yǎng)基具有甘油高滲環(huán)境,適于曲和窖泥霉菌的生長,特別是適于窖泥中的霉菌的生長,說明窖泥霉菌較耐甘油高滲條件。窖泥霉菌的分離純化宜采用DG18而不是高鹽察氏培養(yǎng)基。Isp2培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富,但是pH偏堿性(pH7.2),與DG18培養(yǎng)基比較,不適于曲中的霉菌生長,但適于窖泥中的霉菌生長。PDA培養(yǎng)基適合部分樣品的霉菌生長,本實驗中唯一獲得的一株放線菌來自PDA平板。相比而言,M1培養(yǎng)基適于多數(shù)樣品霉菌的生長,說明M1培養(yǎng)基雖然濃度過低但營養(yǎng)全面,如果提高營養(yǎng)物濃度,也許可以獲得更好的效果。改良高氏一號培養(yǎng)基中pH偏堿,而且加入3%重鉻酸鉀,在現(xiàn)有分離純化條件下未能分離到任何霉菌和放線菌。如繼續(xù)應(yīng)用改良高氏一號于霉菌和放線菌的分離,需要改進方法,如減少樣品稀釋程度、去除重鉻酸鉀的加入等。

在空氣霉菌的分離中,PDA培養(yǎng)基上獲得的霉菌種類遠(yuǎn)少于YEPD和LB培養(yǎng)基,這應(yīng)該與其營養(yǎng)物豐富度不如后兩者有關(guān)。

表7 6種培養(yǎng)基分離2017冬季樣品中的菌株數(shù)Table 7 Numbers of strains isolated from 2017 samples in winter by6 kinds of media

3 討論

文獻研究表明[5],相對于細(xì)菌,濃香型白酒窖泥的真菌多樣性較低。本研究中在冬季窖泥中分離到多種霉菌,而且夏季和冬季窖泥的霉菌差異較大。考慮到屬于不同窖池取樣,但是屬于同車間同窖齡的條件,認(rèn)為季節(jié)對窖泥霉菌的數(shù)量和種類有明顯影響。本研究中從上部窖泥、下部窖泥和底泥分離到不同的種類,這些窖泥霉菌還有待做進一步鑒定,以與枝江大曲[6-7]和瀘州老窖[8]等濃香型大曲酒的窖泥真菌進行比較。另外,從窖泥中分離到一株放線菌。放線菌在濃香型白酒的窖泥中的分布和功能研究正逐步獲得企業(yè)及研究機構(gòu)的關(guān)注[5,9-10],本研究獲得的一株放線菌也有待進一步鑒定。

相對于細(xì)菌和酵母,大曲中的霉菌種類相對較少[11]。梁金輝等[12]從古井濃香型酒大曲中共分離到55株細(xì)菌,43株酵母和11株霉菌,本研究從夏冬兩季的大曲中分別分離了10株和9株霉菌,與前者相似。我們特別關(guān)注的青霉菌只在冬季大曲中出現(xiàn)。行業(yè)中認(rèn)為青霉菌的出現(xiàn)可能會導(dǎo)致異味、出酒率下降等不利現(xiàn)象。但是更多的文獻發(fā)現(xiàn)青霉屬是大曲中的常見霉菌[12-15]。

本研究分離到大量空氣霉菌,其中夏季空氣霉菌類型遠(yuǎn)多于冬季霉菌。通過對分離到的霉菌的跟蹤分析,有可能找到典型的有益及有害霉菌,從而對生產(chǎn)工藝進行指導(dǎo)。

4 結(jié)論

黃鶴樓酒洞釀車間冬季的空氣霉菌顯著少于夏季,冬季窖泥霉菌明顯多于夏季窖泥,而兩季的大曲中霉菌種類數(shù)量相近。說明濃香型黃鶴樓酒生產(chǎn)車間的空氣、窖泥的霉菌數(shù)量差異較大。該結(jié)果為闡明夏季和冬季基酒質(zhì)量差異的機理提供了支持。

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L
I Liang1,ZHENG Guipeng2,WU Hao1,YUE Zhi2,CHEN Maobin2,ZHEN Da2*
(1.Wuhan Pride Yellow Crane Tower Distillery Co.,Ltd.,Xianning 437000,China;2.Hubei Key Laboratory of Industrial Microbiology,Hubei Collaborative Innovation Center for Industrial Fermentation,Hubei Key Laboratory of Fermentation Engineering,Ministry of Education,School of Food and Biological Engineering,Hubei University of Technology,Wuhan 430068,China)

TS262.3

0254-5071(2017)11-0054-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.11.012

2017-08-07

科技部重點項目(2016YFD0400500)

李 良(1982-),男,工程師,碩士,主要從事酒類研究開發(fā)工作。

*通訊作者:鎮(zhèn) 達(1968-),男,副教授,博士,主要從事酒類發(fā)酵研究工作。