青蒿素對大鼠腦缺血再灌注損傷后凋亡相關(guān)因子及炎癥介質(zhì)表達的影響

袁紅剛

（漢川市人民醫(yī)院神經(jīng)外科，湖北 漢川 431600）

青蒿素對大鼠腦缺血再灌注損傷后凋亡相關(guān)因子及炎癥介質(zhì)表達的影響

袁紅剛

（漢川市人民醫(yī)院神經(jīng)外科，湖北 漢川 431600）

目的 探討青蒿素對大鼠腦缺血再灌注損傷后凋亡因子及炎癥介質(zhì)表達的影響。方法 采用線栓法制備大鼠腦缺血再灌注損傷模型，健康SD大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組、青蒿素預(yù)處理組。缺血2 h，再灌注24 h后，處死大鼠，腦組織取材。采用實時熒光定量PCR檢測Fas、FasL、Bcl-2、Bax mRNA水平。采用ELISA法檢測TNF-α和IL-1β蛋白水平。結(jié)果 與假手術(shù)比較，模型組Fas、FasL、Bcl-2和Bax mRNA表達水平上調(diào)(P＜0.05)，Bcl-2/Bax比值下調(diào)(P＜0.05)，TNF-α和IL-1β蛋白水平升高(P＜0.05)，青蒿素預(yù)處理可明顯下調(diào)Fas、FasL、Bcl-2和Bax mRNA水平及TNF-α和IL-1β蛋白水平(P＜0.05)，上調(diào)Bcl-2/Bax比值(P＜0.05)。結(jié)論 青蒿素對腦缺血再灌注損傷后的腦組織具有保護作用。

青蒿素；Bcl-2；Bax；腫瘤壞死因子α；腦缺血再灌注損傷

缺血性腦血管病嚴重危害人類健康。近年來，腦缺血再灌注后細胞凋亡一直是研究的熱點，然而其發(fā)生機制目前尚不明確。目前已經(jīng)確認的是，細胞凋亡不僅受凋亡相關(guān)因子的調(diào)控，還被許多內(nèi)外因素所調(diào)節(jié)，包括氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等。因此有效地減少腦缺血再灌注損傷后細胞凋亡[1-3]，可以減輕缺血再灌注對腦組織的損傷，有助于神經(jīng)功能的恢復(fù)。青蒿素是一種菊科植物黃花蒿中提取物，是世界衛(wèi)生組織公認的抗瘧疾藥物。大量的研究證實，青蒿素還具有多重生物學(xué)效應(yīng)，如免疫調(diào)節(jié)、抗炎癥、抗凋亡及抗纖維化等。本研究通過線栓法制備大鼠腦缺血再灌注損傷模型，觀察青蒿素預(yù)處理對腦缺血再灌注損傷后Fas、FasL、Bcl-2、Bax RNA水平及TNF-α和IL-1β蛋白水平的影響，探討青蒿素腦保護的作用機制。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與分組 SPF級健康Sprague-Dawley雄大鼠80只，8周齡，體質(zhì)量250～300 g。由武漢大學(xué)實驗動物中心提供。隨機分成3組，即假手術(shù)組（n=20）、模型對照組（n=30）、青蒿素組（n=30）。

1.2 模型制作 參照Zea線栓法（Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats），3%戊巴比妥鈉行腹腔注射麻醉大鼠，麻醉劑量為40～50 mg/kg。將大鼠固定于鼠板上，頸部正中切口，分離右側(cè)頸總動脈，順著右側(cè)頸總動脈經(jīng)頸內(nèi)動脈插入制備好的線栓，直到遇到阻力為止，阻斷大腦中動脈血流2 h,拔出線栓，形成再灌注。假手術(shù)除了不插入線栓，其他步驟與另外兩組一致。再灌注24 h處死大鼠，腦組織取材。

1.3 給藥途徑 青蒿素組在造模1周前給予青蒿素灌胃，劑量為5 mg/（kg·d）。

1.4 實時熒光定量PCR檢測大鼠腦組織Fas、FasL、Bcl-2、Bax RNA表達 取大鼠腦組織 Trizol法，嚴格按照說明書提取總mRNA。Fas：上游引物5′-GTG ATG AAG GGC ATG GTT TAG-3′，下游引物5-′GCA TTT GGT GTT GCT GGT T-3′；FasL：上游引物5′-ACC ACC TCC ATC ACC ACT ACC-3′，下游引物5′-CAT TCC AAC CAG AGC CAC C-3′；Bcl-2：上游引物5′-TTT GAT TTC TCC TGG CTG TCT-3′′，下游引物5′-CTG ATT TGA CCA TTT GCC TG-3′；Bax：上游引物5′-TGA ACT GGA CAA CAA CAT GGA G-3′，下游引物 5′-AGC AAA GTA GAA AAG GGC AAC C-3′；β-actin：上游引物5′-CGT TGA CAT CCG TAA AGA CCT C-3′，下游引物5′-TAG GAG CCA GGG CAG TAA TCT-3′。

1.5 腦組織TNF-α和IL-1β水平檢測 腦損傷后24 h小時分別斷頭處死6只，在冰上分離右頂傷灶附近腦組織，置于冷生理鹽水中漂洗稱重，然后研磨勻漿，以3 500 r/min、-4℃離心10 min,提取上清液后按照ELISA試劑盒進行操作。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析，計量資料采用“x±s”表示，各組樣本均數(shù)采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Fas和FasL mRNA表達 與假手術(shù)組比較，模型組Fas和FasL mRNA表達水平顯著上調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組比較，青蒿素組Fas和FasL mRNA表達顯著下調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖1。

圖1 Fas和FasL mRNA水平Figure1 Fas and FasL mRNAlevels

2.2 Bcl-2和Bax mRNA表達 與假手術(shù)比較，模型組Bcl-2和Bax mRNA水平顯著上調(diào)，Bcl-2/Bax比值顯著下調(diào)，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組比較，青蒿素組Bcl-2 mRNA水平和Bcl-2/Bax比值顯著上調(diào)，Bax mRNA水平顯著下調(diào)，且差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖2。

圖2 A.Bd-2和Bax mRHA水平；B.Bcl-2/Bax比值Figure 2 A.bd-2 and Bax mRHAlevel;B.Bcl-2/Bax ratio

2.3 TNF-α和IL-1β水平與假手術(shù)比 模型組TNF-α和IL-1β水平均升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組比較，青蒿素組TNF-α和IL-1β水平均降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 3組TNF-α和IL-1β水平比較（x±s）Table 1 Comparison of TNF-alpha and il-1 beta levels in 3 groups(x±s)

3 討論

本研究在大鼠腦缺血再灌注損傷模型的基礎(chǔ)上，給予青蒿素對其進行干預(yù)，結(jié)果顯示，與假手術(shù)比較，模型組Fas、FasL、Bcl-2和Bax mRNA表達水平上調(diào)，Bcl-2/Bax比值下調(diào)，TNF-α和IL-1β蛋白水平升高，青蒿素干預(yù)可明顯下調(diào)Fas、FasL、Bcl-2和Bax mRNA水平及TNF-α和IL-1β蛋白水平，上調(diào)Bcl-2/Bax比值，提示青蒿素可通過抑制神經(jīng)細胞凋亡及炎癥反應(yīng)來發(fā)揮神經(jīng)保護作用[4-6]。

細胞凋亡是受基因調(diào)控的主動性死亡。大量的研究表明，細胞凋亡參與缺血引起的神經(jīng)細胞死亡。腦組織缺血時，缺血中心細胞快速的發(fā)生壞死，半影區(qū)則主要以凋亡的機制發(fā)生遲緩性細胞死亡[7-10]。Fas屬于腫瘤壞死因子的受體家族成員，是一種具有重要功能的細胞表面受體，其與FasL相互作用可介導(dǎo)缺氧所致的細胞凋亡。Fas是參與腦缺血后神經(jīng)細胞凋亡的重要因素之一，另外，F(xiàn)as/FasL通路的激活還介導(dǎo)Caspase-3的激活。本研究結(jié)果顯示，青蒿素預(yù)處理可以降低腦缺血再灌注損傷后的Fas和FasL mRNA表達水平。Bcl-2是抑制細胞凋亡的關(guān)鍵基因，其還可以調(diào)節(jié)Ca2+流入細胞，抑制氧自由基的產(chǎn)生。Bax是細胞凋亡的促進基因[11-12]，并對抗Bcl-2對細胞凋亡的抑制作用。Bcl-2與Bax表達的比值決定著細胞在受到凋亡刺激信號后的存亡。在腦缺血再灌注后，Bcl-2/Bax比值降低時促進細胞凋亡，比值升高時促進細胞存活。本研究中，青蒿素干預(yù)腦缺血再灌注損傷可上調(diào)Bcl-2 mRNA表達及Bcl-2/Bax比值，同時下調(diào)Bax mRNA表達，抑制細胞凋亡，從而保護了腦組織。

本研究還發(fā)現(xiàn)給予青蒿素預(yù)處理可減少腦缺血再灌注損傷后大鼠腦組織中TNF-α和IL-1β蛋白水平。腦缺血激發(fā)的炎癥級聯(lián)反應(yīng)在缺血再灌注損傷中發(fā)揮著中要用。目前已經(jīng)證實，短暫性腦缺血就會誘導(dǎo)TNF-α和IL-1β等促炎癥因子的表達。TNF-α是體內(nèi)最主要的炎癥因子，TNF-α過度表達可直接作用的血管內(nèi)皮細胞，改變其通透性，還刺激內(nèi)皮細胞合成并釋放IL-1β。TNF-α過度表達還可誘導(dǎo)細胞凋亡。TNF-α引發(fā)一系列炎癥介質(zhì)的始發(fā)因素，對腦缺血后腦組織具有損害作用。IL-1β是一種多功能的細胞因子，在正常腦組織中只有少量表達，其在正常中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和腦對各種損傷的反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。IL-1β不僅可以促進T、B細胞活化，還可以誘導(dǎo)TNF-α、IL-6等炎癥因子的產(chǎn)生。IL-1β參與腦水中形成及神經(jīng)元壞死。我們有理由相信本研究結(jié)果表明的青蒿素預(yù)處理能降低腦缺血再灌注損傷后炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-6的表達，能減少其過度釋放導(dǎo)致的腦細胞繼發(fā)性損傷，有助于神經(jīng)功能的恢復(fù)。

綜上所述，本研究觀察青蒿素能降低腦缺血再灌注損傷后凋亡因子及炎癥介質(zhì)的表達，證明青蒿素具有腦細胞保護作用，從分子水平對其作用機制研究的一種擴充，但具體機制仍有待于進一步研究，為臨床開展腦保護治療提供新思路。

[1] 商崇智,董化江,單娜娜,等.青蒿素對腦缺血/再灌注損傷大鼠白細胞介素-8表達的影響[J].新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2013,30(4):246-248.

[2] 馬瑞松,江洪,李元紅,等.青蒿素對大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響及其作用機制探討[J].海南醫(yī)學(xué),2016,27(11):1734-1736.

[3] 沈秀珍,王凌,方毅華.青蒿素減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷的機制研究[J].湖北科技學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2016,30(3):191-193.

[4] 李國前,王杰華,楊小霞,等.丁苯酞對大鼠腦缺血再灌注損傷后凋亡相關(guān)因子表達的影響[J].中國臨床藥理學(xué)雜志,2011,27(9):682-685.

[5] 鐘森,陳文超,徐永強,等.三七總皂苷對腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)干細胞相關(guān)調(diào)節(jié)因子及腦細胞凋亡的影響[J].中國中醫(yī)急癥,2010,19(2):279-282.

[6] 趙鵬,史忠,周坤,等.頸交感干離斷對大鼠腦缺血再灌注損傷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子的影響[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,2010,32(22):2361-2364.

[7] 王杰華,陳淑增,許秀秀.氟伐他汀預(yù)處理對腦缺血再灌注損傷大鼠凋亡相關(guān)因子表達的影響[J].神經(jīng)解剖學(xué)雜志,2013,29(6):677-680.

[8] 張俊華,于明,蘇建華,等.瑞舒伐他汀對腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)細胞凋亡及凋亡誘導(dǎo)因子表達的影響[J].中華老年心腦血管病雜志,2015,17(8):868-870.

[9] 蔣青,沈明勤,石磊,等.關(guān)于成立中國中藥協(xié)會中藥飲片質(zhì)量保障專業(yè)委員會決定[J].中國實驗方劑學(xué)雜志,2014.

[10]毛曉霞,夏愛華,吳曉光,等.2015中國中藥制藥科技(重慶)大會暨海峽兩岸傳統(tǒng)中藥制劑技術(shù)傳承與創(chuàng)新研討會(第一輪)[J].中國實驗方劑學(xué)雜志,2014.

[11]王寶亮,岳亞男,鄭晨星,等.2015中國中藥制藥科技(重慶)大會暨海峽兩岸傳統(tǒng)中藥制劑技術(shù)傳承與創(chuàng)新研討會(第一輪)[J].中國實驗方劑學(xué)雜志,2014.

[12]陳焱.關(guān)于成立中國中藥協(xié)會中藥飲片質(zhì)量保障專業(yè)委員會決定[J].中國實驗方劑學(xué)雜志,2014.

Effects of artemisinin on expression of apoptosis-related factors and inflammatory mediators

Yuan Hong-gang
(Neurosurgery of hanchuan people's hospital,Hanchuan,Hubei,431600,China)

Objective To observe of artemisinin on expression of apoptosis-related factors and inflammatory mediators.Methods 80 male adult Sprague-Dawley rats were randomly assigned into 3 groups：sham group,model group and artemisinin group.The middle cerebral artery occlusion reperfusion model was made by the suture method(ischemia for 2 hour and reperfusion for 24 h).After that were sacrificed by decapitation,the mRNA level of Fas,FasL,Bcl-2,Bax were measured by real time RT-PCR,the level of TNF-α and IL-1β were measured by ELISA.Results The level of Fas,FasL,Bcl-2,Bax,TNF-α and IL-1β were increased significantly in rats with focal cerebral ischmeia-reperfusion(P＜0.05).Compared with the model group,The level of Fas,FasL,Bax,TNF-α and IL-1β were decreased significantly in rats of artemisinin group(P＜0.05),the Bcl-2 was up regulated(P＜0.05).Conclusion Artemisinin exert a protective effect against focal cerebral ischmeia-reperfusion via reducing apoptosis and inflammation.

Artemisinin;Bcl-2;Bax;TNF-α;Cerebral ischmeia-reperfusion

10.3969/j.issn.1009-4393.2017.33.010