麻杏石甘湯對(duì)哮喘模型大鼠肺組織STAT4及其mRNA表達(dá)的影響

虞琳 潘建偉 葉樂(lè)平

麻杏石甘湯對(duì)哮喘模型大鼠肺組織STAT4及其mRNA表達(dá)的影響

虞琳 潘建偉 葉樂(lè)平

目的 研究麻杏石甘湯對(duì)哮喘模型大鼠肺組織STAT4及其mRNA表達(dá)的影響，探討其在哮喘治療中的作用及可能機(jī)制。方法 將55只SPF級(jí)SD大鼠隨機(jī)分為5組，對(duì)照組（A組）、哮喘組（B組）、高、中、低劑量麻杏石甘湯+哮喘組（C組、D組、E組），每組11只。采用卵蛋白(OVA)腹腔注射致敏與霧化吸入激發(fā)法制作哮喘模型。留取肺泡灌洗液（BALF）測(cè)定IL-12及IL-13水平；并取肺組織標(biāo)本HE染色后觀察氣道炎癥，免疫組化法及原位雜交法分別檢測(cè)STAT4及其mRNA表達(dá)。結(jié)果 （1）哮喘組大鼠BALF中IL-13水平升高，IL-12水平下降，肺組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯。（2）STAT4及STAT4 mRNA在各組大鼠氣道平滑肌及血管肌層中均有表達(dá)，正常對(duì)照組呈陽(yáng)性表達(dá)，哮喘組陽(yáng)性表達(dá)最弱。（3）麻杏石甘湯干預(yù)后哮喘大鼠IL-13水平下降，IL-12水平上升，炎癥反應(yīng)減輕；STAT4表達(dá)上調(diào)，其中高劑量組與哮喘組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；高劑量、中劑量麻杏石甘湯組STAT4 mRNA表達(dá)與哮喘組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。結(jié)論 卵蛋白致敏大鼠氣道及血管肌層STAT4表達(dá)受抑制，麻杏石甘湯可能通過(guò)上調(diào)STAT4及其mRNA的表達(dá)，減輕哮喘大鼠氣道炎癥反應(yīng)。

哮喘 麻杏石甘湯 STAT4 STAT4 mRNA

近10余年來(lái)，我國(guó)兒童支氣管哮喘（簡(jiǎn)稱(chēng)哮喘）患病率從 2000年的 1．97%上升為2010年的 3.02%[1]，嚴(yán)重影響兒童身心健康，給家庭及社會(huì)造成極大負(fù)擔(dān)。氣道慢性炎癥被公認(rèn)為是哮喘發(fā)病的中心環(huán)節(jié)。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子4（signal transduction and activator of transcription 4，STAT4）作為一種新型轉(zhuǎn)錄因子家族成員，在哮喘氣道炎癥和氣道高反應(yīng)形成中的調(diào)控作用備受關(guān)注[2]。麻杏石甘湯作為祛痰、平喘中成藥在歷史上應(yīng)用已久，現(xiàn)代藥理學(xué)研究亦證實(shí)其具有鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘、解熱的功效，但對(duì)哮喘作用的具體機(jī)制尚未明確，對(duì)STAT4的影響國(guó)內(nèi)更未見(jiàn)報(bào)道。因此，筆者擬通過(guò)建立卵蛋白致敏哮喘大鼠模型，觀察STAT4及其mRNA在肺組織中的表達(dá)，進(jìn)一步探討麻杏石甘湯對(duì)氣道炎癥的作用及可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料 55只SPF級(jí)幼年雄性SD大鼠（購(gòu)自溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），體重120～180g；卵清白蛋白（ovalbumini，OVA）、焦磷酸二乙酯（diethypyrocarbonate，DEPC）、氫氧化鋁凝膠（美國(guó)Sigma公司）；大鼠IL-12、IL-13 ELISA試劑盒（美國(guó)R&D公司）；STAT4兔抗大鼠多克隆抗體（美國(guó)Abcam公司）；STAT4原位雜交檢測(cè)試劑盒、多聚甲醛、水合氯醛（武漢博士德生物公司）；二步法免疫組化檢測(cè)試劑、DAB顯色試劑盒、蘇木素染液（北京中衫金橋）；HE染色試劑盒（江蘇碧云天生物工程有限公司）；其余試劑為市售分析純?cè)噭?/p>

1.2 麻杏石甘湯的制備 麻黃6g、杏仁6g、甘草5g、石膏20g（購(gòu)自溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院），麻杏石甘湯的煎制參照衛(wèi)生部國(guó)家中醫(yī)藥管理局發(fā)布的《醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》。雙蒸水浸泡麻黃、杏仁、甘草30min，煮石膏20min，后同煎15min，留取第一道汁后，再加入雙倍雙蒸水煎15min，取汁，混合第一、二道汁，濃縮至相應(yīng)體積，高、中、低劑量中藥組體積分別為50ml、100ml、200ml，含生藥 24.6g/kg、12.3g/kg、6.15g/kg。于 4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理 將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(A組)、哮喘組（B組）、哮喘+高劑量麻杏石甘湯組（C組）、哮喘+中劑量麻杏石甘湯組（D組）、哮喘+低劑量麻杏石甘湯組（E組），每組11只。哮喘模型的制作分致敏和激發(fā)兩階段。致敏階段：B組～E組大鼠于第1天和第8天分別注射OVA和氫氧化鋁凝膠的無(wú)菌抗原液1ml,A組予等量的0.9%氯化鈉溶液。激發(fā)階段:第2次致敏1周后，將B組～E組大鼠放入自制的密閉有機(jī)玻璃箱（40cm×30cm×20cm）中，予含1%OVA的0.9%氯化鈉溶液霧化吸入，1次/d，每次持續(xù)30min，連續(xù)定時(shí)激發(fā)3d；A組用0.9%氯化鈉溶液替代OVA進(jìn)行。C組～E組在第2次致敏后第4天開(kāi)始分別予不同濃度麻杏石甘湯灌胃，2次/d，激發(fā)階段則每次激發(fā)前后4h灌胃同等劑量麻杏石甘湯。

1.4 標(biāo)本的制備 末次激發(fā)24h后予10%水合氯醛3ml/kg腹腔注射，后行腹主動(dòng)脈切開(kāi)處死。即刻切開(kāi)氣管，切取左肺中下段組織，4%多聚甲醛固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋后切片。經(jīng)氣管插管行右肺灌洗，留取支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）8ml（10ml分2次灌洗，回收率確保在80%以上），離心后取上清液-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 BALF中IL-12和IL-13水平測(cè)定 應(yīng)用Sandwich ELISA法檢測(cè)BALF中IL-12、IL-13的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)過(guò)程參照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.6 免疫組化法檢測(cè)STAT4的表達(dá) 切片脫蠟后高壓修復(fù)3min，3%H2O2滅活內(nèi)源性酶后沖洗，5%山羊血清封閉非特異性抗體，37℃水浴箱孵化30min，滴加STAT4兔抗鼠多克隆抗體（1∶200），4℃過(guò)夜；復(fù)溫后滴加生物素標(biāo)記二抗山羊抗兔的IgG37℃孵化30min，沖洗后行DAB染色，蘇木素復(fù)染，PBS返藍(lán)后脫水、透明、封片，顯微鏡下觀察。陽(yáng)性結(jié)果呈棕黃色，用圖像分析儀IPP6.0測(cè)定肺組織平均吸光度值（IOD）作為STAT4相對(duì)水平。

1.7 原位雜交法檢測(cè)STAT4 mRNA的表達(dá) 石蠟切片常規(guī)脫蠟后用3%H2O2滅活內(nèi)源性酶，3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶消化，滴加采用經(jīng)地高辛標(biāo)記的針對(duì)STAT4的寡核苷酸探針雜交液，封閉后再加入生物素化兔抗地高辛，染色、封片。陽(yáng)性細(xì)胞著色呈棕黃色。同用圖像分析儀IPP6.0測(cè)定肺組織平均吸光度值（IOD）作為STAT4 mRNA相對(duì)水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，多組間比較采用方差分析，方差齊者兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，方差不齊者采用Tamhane’s T2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠BALF中IL-12、IL-13水平的比較 B組BALF中IL-13水平顯著高于A組，不同劑量麻杏石甘湯組中均較哮喘組低，其中C、D組與B組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與A組相比，哮喘組IL-12水平明顯下降，而采用麻杏石甘湯干預(yù)后BALF中IL-12水平隨著麻杏石濃度升高而升高。詳見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠BALF中IL-12、IL-13水平的比較（pg/ml）

2.2 麻杏石甘湯對(duì)大鼠氣道炎癥的影響 A組大鼠氣道、血管形態(tài)規(guī)整，氣道平滑肌及血管肌層無(wú)增生，未見(jiàn)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡腔無(wú)明顯滲出。B組大鼠氣道、血管肌層明顯增生，周?chē)人嵝粤＜?xì)胞、淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，基底膜增厚，部分氣道上皮脫落，管腔內(nèi)可見(jiàn)黏液栓，肺間質(zhì)增寬。麻杏石甘湯組肺組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、血管平滑肌增生均較B組減輕，且隨著劑量的增高，改善越顯著。詳見(jiàn)圖1（見(jiàn)插頁(yè)）。

2.3 麻杏石甘湯對(duì)STAT4表達(dá)的影響 STAT4主要表達(dá)于正常大鼠氣道及血管肌層（0.3617±0.0812），呈棕黃色強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，在B組大鼠表達(dá)減少，其IOD為0.1396±0.0711，麻杏石甘湯干預(yù)后B組STAT4表達(dá)上調(diào)，其中C組IOD為0.2251±0.0540，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。D組IOD 為 0.1872±0.0396，E組為 IOD 為0.1539±0.0306，與B組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。詳見(jiàn)圖2（見(jiàn)插頁(yè)）。

2.4 麻杏石甘湯對(duì)STAT4 mRNA表達(dá)的影響 A組大鼠氣道及血管肌層均可見(jiàn)STAT4 mRNA呈棕黃色陽(yáng)性表達(dá)（0.2848±0.0616），B 組大鼠 STAT4 mRNA 表達(dá)（0.1671±0.0532）較A組明顯減弱（P＜0.05）。麻杏石甘湯灌胃后大鼠氣道肌層及血管亦可見(jiàn)STAT4 mRNA陽(yáng)性表達(dá)，且表達(dá)強(qiáng)于B組，其中C組（0.2193±0.0722）、D組（0.1962±0.0708）與B組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。詳見(jiàn)圖3（見(jiàn)插頁(yè)）。

3 討論

哮喘發(fā)病率逐年攀升,目前我國(guó)兒童哮喘的總體控制水平尚不理想[3]，對(duì)其發(fā)病機(jī)制的深入探索一直是學(xué)者研究的重點(diǎn)。STATs是一種新型的轉(zhuǎn)錄因子家族成員，可進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)直接結(jié)合DNA調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄，在介導(dǎo)多種細(xì)胞因子和趨化因子的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中起到關(guān)鍵作用[4]。在目前已發(fā)現(xiàn)的7種STATs家族成員中，STAT1、STAT4、STAT6與哮喘氣道炎癥和重塑中關(guān)系是哮喘防治領(lǐng)域的熱點(diǎn)問(wèn)題，其中STAT4在CD4+T細(xì)胞向輔助性T淋巴細(xì)胞1（Th1）分化中起著至關(guān)重要的作用[5-6]。經(jīng)典免疫學(xué)認(rèn)為，Th1/Th2細(xì)胞在數(shù)量、活化及功能方面的比例失衡是哮喘發(fā)病的核心環(huán)節(jié)。Th1主要分泌 IL-2、IL-12、IFN-γ，Th2則通過(guò)分泌 IL-4、IL-13 等細(xì)胞因子，誘導(dǎo)趨化因子介導(dǎo)肺部炎癥，誘導(dǎo)分泌免疫球蛋白 E（immunglobulin E，IgE），促進(jìn)黏液高分泌，加重氣道高反應(yīng)（airway hyperresponsiveness，AHR），還可直接刺激成纖維細(xì)胞參與氣道重塑，在變態(tài)反應(yīng)中起著獨(dú)特而重要的作用[7]。

本研究應(yīng)用卵蛋白致敏建立哮喘大鼠模型，激發(fā)過(guò)程中可見(jiàn)哮喘組大鼠表現(xiàn)煩躁不安、呼吸急促、四肢顫動(dòng)、毛色失去光澤，嚴(yán)重者四肢癱軟，俯伏不動(dòng)，呼吸節(jié)律不規(guī)則。留取標(biāo)本時(shí)可見(jiàn)哮喘大鼠肺臟體積增大、腫脹，可見(jiàn)不規(guī)則暗紅色充血區(qū)。哮喘大鼠肺組織切片HE染色見(jiàn)氣道平滑肌及血管肌層增生，與對(duì)照組相比，周?chē)仔约?xì)胞（嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞）大量浸潤(rùn)，部分氣道上皮損傷、脫落。同時(shí)，與正常組比較，哮喘大鼠BALF中Th2細(xì)胞因子IL-13明顯升高，Th1細(xì)胞因子IL-12減少，證實(shí)存在Th1/Th2比例失衡，表明哮喘模型復(fù)制成功。

IL-12與受體結(jié)合后，可引起STAT4磷酸化、同源二聚化及核易位[8]，從而誘導(dǎo)其下游的CD4+T細(xì)胞向Th1 分化，促進(jìn) IFN-γ 的表達(dá)[1，5-6，9-10]。當(dāng) STAT4 缺乏時(shí)，CD4+Th1的分化和IFN-γ的表達(dá)受到抑制，CD4+Th1的完整分化需要STAT4和T-bet共同參與[10]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)免疫組化、原位雜交法從蛋白及基因水平發(fā)現(xiàn)，STAT4及STAT4 mRNA在各組大鼠氣道平滑肌及血管肌層中均有表達(dá)。哮喘組大鼠STAT4及STAT4 mRNA的表達(dá)顯著低于正常對(duì)照組，提示哮喘時(shí)氣道平滑肌和血管肌層的STAT4基因轉(zhuǎn)錄、蛋白翻譯均受到抑制。筆者推測(cè)，哮喘時(shí)肺組織中IL-12等Th1細(xì)胞因子分泌不足，STAT4表達(dá)減少，間接促進(jìn)了Th2的優(yōu)勢(shì)分化，參與哮喘氣道炎癥的發(fā)病。但Dulek等[11]應(yīng)用呼吸道合胞病毒（RSV）感染STAT4-/-小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，STAT4基因敲除的小鼠亦未能產(chǎn)生Th2優(yōu)勢(shì)應(yīng)道，沒(méi)有出現(xiàn)AHR、粘液高分泌及嗜酸性粒細(xì)胞聚集等現(xiàn)象。Kim等[12]研究也發(fā)現(xiàn)IL-13介導(dǎo)的Th2哮喘表型，如AHR和非嗜酸性炎癥等，也必須依賴(lài)IL-12-STAT4-IFN-γ軸。說(shuō)明STAT4在哮喘發(fā)病中的作用除了減少Th1的形成，在促進(jìn)Th2細(xì)胞因子表達(dá)方面可能也發(fā)揮了重要作用。本研究?jī)H從IL-12、IL-13及STAT4基因、蛋白的層面進(jìn)行闡述，STAT4通路相應(yīng)的其他上游及下游細(xì)胞因子、結(jié)合蛋白等具體信號(hào)途徑尚未研究，特別是對(duì)Th2細(xì)胞因子的具體作用及機(jī)制，還有待更深入的研究。

近年來(lái)中西醫(yī)結(jié)合治療兒童哮喘受到越來(lái)越多學(xué)者的重視，一些中草藥已被證實(shí)具有抗炎、抗過(guò)敏及免疫調(diào)節(jié)的作用，最新的國(guó)內(nèi)兒童哮喘指南[13]也將中藥提入治療方案中。麻杏石甘湯出自張仲景的《傷寒論》，由麻黃、杏仁、炙甘草、石膏四味藥組成，具有辛涼宣肺、清熱平喘的功效?，F(xiàn)代藥理研究證實(shí)麻黃所含的麻黃堿為β2受體激動(dòng)劑，可舒張支氣管平滑肌痙攣；杏仁所含的苦杏仁苷經(jīng)酶水解后產(chǎn)生氫氰酸，可使呼吸運(yùn)動(dòng)趨于安靜而奏止咳平喘作用，并能促進(jìn)動(dòng)脈壁前列腺I(mǎi)2（PGI2）樣物質(zhì)生成，擴(kuò)張微血管，改善微循環(huán)；生石膏的成分主要為含水硫酸鈣對(duì)支氣管神經(jīng)肌肉有抑制及鎮(zhèn)靜作用，加上鈣質(zhì)能降低支氣管通透性，故有解除支氣管痙攣的作用[14]。筆者前期研究已發(fā)現(xiàn)，麻杏石甘湯能下調(diào)哮喘大鼠氣道上皮STAT6及STAT6 mRNA的表達(dá)，抑制IL-13的分泌[15]。本研究發(fā)現(xiàn)麻杏石甘湯能減輕卵蛋白致敏大鼠激發(fā)后的躁動(dòng)不安、呼吸急促等表現(xiàn)，減少氣道EOS浸潤(rùn)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，哮喘大鼠在不同濃度麻杏石甘湯灌胃后，BALF中IL-13有不同程度的下調(diào)，IL-12水平上升，氣道平滑肌及血管肌層STAT4及STAT4 mRNA表達(dá)均有增強(qiáng)。因此筆者推測(cè)麻杏石甘湯可能通過(guò)促進(jìn)Th1細(xì)胞因子分泌，間接抑制Th2，上調(diào)STAT4表達(dá)，進(jìn)而減少EOS的浸潤(rùn)，減輕氣道炎癥反應(yīng)。國(guó)內(nèi)有報(bào)道認(rèn)為麻杏石甘湯可調(diào)節(jié)哮喘小鼠Th1/Th2平衡，但主要通過(guò)STAT6等途徑[16]。本研究中麻杏石甘湯的方劑劑量根據(jù)人及動(dòng)物間藥物換算公式所得，若能有標(biāo)準(zhǔn)化片劑等制型，相信實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)將更具有指導(dǎo)意義。

綜上所述，麻杏石甘湯能上調(diào)Th1細(xì)胞因子IL-12的表達(dá)，下調(diào)Th2細(xì)胞分泌，促進(jìn)肺組織中STAT4的表達(dá)，減少哮喘大鼠氣道炎癥，參與哮喘防治的調(diào)控，為其在哮喘現(xiàn)代臨床應(yīng)用提供了依據(jù)。相信隨著哮喘機(jī)制研究的進(jìn)一步深入，臨床麻杏石甘湯片劑、STAT4制劑等的研發(fā)，將為哮喘的中西醫(yī)結(jié)合治療提供更廣闊的空間。

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Expression of STAT4 in asthma rats treated with Chinese medicine Maxingshigan Decoction

YU Lin,PAN Jianwei,YE Leping.
Department of Pediatrics,the Fourth Affiliated Hospital Zhejiang University School of Medicine,Yiwu 322000,China

Objective To investigate the expression of STAT4 in asthma rats treated with Chinese medicine Maxingshigan Decoction. Methods Fifty five SPF SD rats were randomly divided into 5 groups:control group(group A),asthma group(group B),high-dose,medium-dose and low-dose Maxingshigan Decoction treatment groups(group C,group D,group E).The rat model of asthma was established by ovalbumin(OVA)challenge methods.The bronchoalveolar lavage fluid(BALF)and lung tissues were obtained.The concentrations of IL-12 and IL-13 in BALF were measured by ELISA,the inflammation of airways was observed by HE staining;the expressions of STAT4 protein and mRNA were detected by immunohistochemistry and in situ hybridization,respectively. Results Compared with the control group,the concentration of IL-13 in BALF of asthma group was higher,while it was decreased in Maxingshigan Decoction treatment groups of asthma rats.On the contrary,the concentration of IL-12 in BALF was lower in asthma group than that in control group.The IL-12 levels in BALF were increased in Maxingshigan Decoction groups,and compared with asthma rats,the levels in groups C and D were significantly elevated(P＜0.05).HE staining showed airway smooth muscle and vascular muscle hyperplasia and peripheral inflammatory cells infiltration in asthma rats.Maxingshigan Decoction dose-dependently alleviated the pathological changes in asthma rats.STAT4 and its mRNA were expressed in airway smooth muscles and vascular muscle layers in all groups.The expression of STAT4 in Maxingshigan Decoction groups was higher than that in control group,and the expression of STAT4 protein in group C was significantly higher than that in asthma group (P＜0.05).The expression of STAT4 mRNA in groups C and D were significantly up-regulated compared with the asthma group (P＜0.05). Conclusion Chinese medicine Maxingshigan Decoction can reduce airway inflammation in asthma rats through up-regulation of STAT4 expression.

Asthma Maxingshigan Decoction STAT4 STAT4 mRNA

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.21.2017-1672

322000 義烏，浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第四醫(yī)院兒科（虞琳、潘建偉）；溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院兒童呼吸科（葉樂(lè)平）

葉樂(lè)平，E-mail：yeleping@163.com

2017-07-13）

嚴(yán)瑋雯）