不同基因型谷子的RAPD分析

， ， ， (.衡水學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院， 河北 衡水 053000； .河北省農(nóng)林科學(xué)院旱作農(nóng)業(yè)研究所， 河北 衡水 053000)

不同基因型谷子的RAPD分析

郭曉麗1，時(shí)麗冉1，呂亞慈1，李明哲2
(1.衡水學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院， 河北 衡水 053000； 2.河北省農(nóng)林科學(xué)院旱作農(nóng)業(yè)研究所， 河北 衡水 053000)

利用隨機(jī)多態(tài)性DNA (RAPD)分子標(biāo)記技術(shù)分析了9種不同基因型谷子的遺傳差異。采用20個(gè)隨機(jī)引物對(duì)谷子基因組DNA進(jìn)行RAPD-PCR擴(kuò)增，共得到616條帶，其中多態(tài)性條帶有389條，多態(tài)性比例達(dá)到了63.2%。聚類分析表明，以遺傳相似系數(shù)為0.68 處可將9個(gè)谷子品種劃分為3類。

谷子； RAPD； 聚類分析

谷子，又名粟或者小米，現(xiàn)主要分布于我國(guó)東北、西北、華北等地區(qū)。谷子是北方人民的主食之一，谷粒有很高的價(jià)值，含有豐富的蛋白質(zhì)和維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)谷子擁有生長(zhǎng)周期短、耐瘠薄、耐旱、抗逆性強(qiáng)、籽粒易儲(chǔ)藏等特性,是干旱地區(qū)的重要糧食作物[1-2]。但由于谷子的品種太過(guò)繁多，而且易與野生狗尾巴草雜交不斷產(chǎn)生中間種，想要通過(guò)傳統(tǒng)的形態(tài)標(biāo)記等方法來(lái)完成品種鑒定、良種選育及谷子近緣種分析并不容易。

注：從左至右依次為品種1至品種9。下同。圖1 9個(gè)谷子品種的DNA電泳檢測(cè)

圖2 引物S 8、S 19對(duì)9個(gè)谷子品種的RAPD-PCR擴(kuò)增結(jié)果

隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)技術(shù)是1990年發(fā)明的一種建立于PCR基礎(chǔ)之上的可以對(duì)未知序列的基因組進(jìn)行多態(tài)性分析的分子標(biāo)記技術(shù)[3-4]。RAPD技術(shù)快捷便利，不需要經(jīng)過(guò)分子雜交這一操作，并且隨著反應(yīng)體系的不斷優(yōu)化和檢測(cè)手段的相應(yīng)進(jìn)步，加之目前RAPD方法可大規(guī)模自動(dòng)化分析樣品，RAPD輔助選擇育種和其他相關(guān)應(yīng)用研究更為深入徹底，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于小麥[5]、玉米[6]、水稻[7]等作物的系譜分析、品種鑒定及親緣關(guān)系分析。

本研究以9種不同基因型谷子為材料，采用20種隨機(jī)引物(S 1～S 20)分別對(duì)不同谷子基因組DNA進(jìn)行RAPD分析，進(jìn)而探討谷子樣品間的遺傳多樣性和親緣關(guān)系，從而為谷子資源的利用和開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為谷子育種的親本選配工作提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

9個(gè)谷子品種：冀谷11、龍谷27、首農(nóng)35、M 0902、晉谷21、衡谷10、200151、龍谷25及200152(依次標(biāo)號(hào)為1～9)，均由河北省農(nóng)林科學(xué)院旱作農(nóng)業(yè)研究所提供。

1.2 方 法

1.2.1 谷子的培養(yǎng)

選取優(yōu)質(zhì)飽滿、無(wú)病蟲(chóng)害的谷子各100粒，用0.1%氯化汞消毒10 min，經(jīng)去離子水沖洗干凈后，放于鋪有2層濾紙的培養(yǎng)皿中加入適量蒸餾水浸種發(fā)芽。選取發(fā)芽良好的植株置于25 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待長(zhǎng)至2葉1心時(shí)選取幼嫩葉片進(jìn)行基因組DNA提取。

1.2.2 基因組DNA的提取

9個(gè)谷子品種的基因組DNA采用改良的CTAB法[8]提取。

1.2.3 DNA的濃度測(cè)定

在紫外分光光度計(jì)上檢測(cè)樣品在波長(zhǎng)為260 nm處的光密度值，計(jì)算出DNA的濃度，并最終將所有樣品的濃度稀釋至15 ng/μL，備用。

1.2.4 RAPD-PCR擴(kuò)增

RAPD引物是由生工生物工程(上海)股份有限公司合成的隨機(jī)引物S 1～S 20。10μL反應(yīng)體系包括:10×PCR Buffer 1μL,dNTP 1μL,RAPD引物0.5μL,DNA 2μL,DNA聚合酶0.5μL，ddH2O補(bǔ)足至10μL。反應(yīng)程序?yàn)?94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min,37 ℃退火1 min,72 ℃延伸2 min,共設(shè)45個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。取RAPD擴(kuò)增產(chǎn)物在濃度1.5%的瓊脂糖凝膠上電泳，用熒光染料溴化乙錠進(jìn)行染色，最后在紫外凝膠成像儀上掃描觀察。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

采用Excel軟件整理記錄原始數(shù)據(jù)，統(tǒng)計(jì)出每個(gè)引物所擴(kuò)增出的總帶數(shù)和其中的多態(tài)性條帶數(shù)，得出多態(tài)性位點(diǎn)的百分率。將每一條帶視為一個(gè)性狀，按凝膠同一位置上DNA帶的有無(wú)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，有帶的記作“1”，無(wú)帶的則記作“0”，構(gòu)建出一個(gè)0-1矩陣，最后應(yīng)用NTSYSv 2.10 e軟件計(jì)算谷子的遺傳相似系數(shù)，再用UPUMA方法進(jìn)行谷子的聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種谷子基因組DNA檢測(cè)

通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳對(duì)9種不同谷子的基因組DNA完整性進(jìn)行檢測(cè)(圖1)，所提取的基因組DNA條帶清晰，降解程度較低，雖然混有少量的RNA，但不影響后續(xù)PCR擴(kuò)增結(jié)果。

2.2 不同品種谷子RAPD-PCR電泳圖分析

將RAPD-PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，再用紫外凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描觀察。每個(gè)引物重復(fù)擴(kuò)增3次，選取清晰準(zhǔn)確的圖片進(jìn)行擴(kuò)增分析(圖2)。

注：1為冀谷11；2為龍谷27；3為首農(nóng)35；4為M 0902；5為晉谷21；6為衡谷10；7為200151；8為龍谷25；9為200152。圖3 9個(gè)谷子品種的聚類分析

將掃描后的電泳圖進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果如表1所示。在所有引物擴(kuò)增出的特異性條帶數(shù)中，引物S 4、S 15、S 16、S 19所占比例最高，達(dá)到70%以上。最低的為引物S 5，沒(méi)有擴(kuò)增出特異條帶。隨機(jī)引物S 1～S 20共計(jì)擴(kuò)增出條帶616條，其中多態(tài)性帶有389條，多態(tài)性比例達(dá)到了63.2%。

2.3 不同品種谷子的聚類分析

以9個(gè)谷子品種的擴(kuò)增圖譜為基礎(chǔ)，進(jìn)一步采用NTSYS軟件進(jìn)行處理，應(yīng)用UPGMA法進(jìn)行不同谷子的聚類分析。由圖3可以看出，9份谷子樣本在遺傳相似系數(shù)為0.68 處可劃分為3類。第1類為：冀谷11，首農(nóng)35，晉谷21,200151，龍谷25和200152。其中，龍谷25和200152谷子品質(zhì)間的親緣關(guān)系最為接近，遺傳相似系數(shù)為0.851；其次為首農(nóng)35和晉谷21。在本組中，各品種之間的遺傳相似系數(shù)均在0.711～0.851之間，親緣關(guān)系比較接近。第2類為：M 0902和衡谷10，它們之間的遺傳相似系數(shù)為0.754。第3類為龍谷27，它與其他品種的遺傳距離相對(duì)均較遠(yuǎn)。

表1 20種隨機(jī)引物的擴(kuò)增結(jié)果

引物名稱擴(kuò)增條數(shù)特異性條數(shù)多態(tài)率(%)S1351748．6S231412．9S3412356．1S4362775．0S5451840．0S6261246．2S7341647．0S8412356．0S9331545．5S10482347．9S11421535．7S12271866．7S13371745．9S14412356．0S15322371．8S16433479．0S17331339．4S18221359．0S19463780．4S20281864．3

3 討 論

種質(zhì)資源是遺傳育種的物質(zhì)基礎(chǔ)，作物的遺傳多樣性研究歷來(lái)都是遺傳育種工作的重要方面。隨著分子生物學(xué)的理論基礎(chǔ)及相關(guān)技術(shù)的迅猛發(fā)展，在農(nóng)作物遺傳育種的研究中越來(lái)越得到廣泛的應(yīng)用。近年來(lái)，隨著RAPD、SSR、RFLP等分子標(biāo)記技術(shù)的快速發(fā)展，分子標(biāo)記越來(lái)越多的被應(yīng)用于谷子研究中[9]。

本研究通過(guò)采用RAPD技術(shù)對(duì)不同品種谷子進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，9個(gè)谷子品種之間的遺傳相似系數(shù)為0.526～0.851，表明不同品種間存在一定的遺傳差異。同時(shí)谷子品種龍谷27和200151之間遺傳距離最遠(yuǎn)(0.526)，龍谷25和200152之間遺傳距離最近(0.851)。同時(shí)，從電泳圖中也發(fā)現(xiàn)，龍谷27在不同引物擴(kuò)增結(jié)果中均出現(xiàn)了與其他品種差異較大的擴(kuò)增條帶(圖2)，充分說(shuō)明了它與其他品種間的基因組差異較大，可在雜交育種中優(yōu)先考慮作為候選品種。

[1]張雪峰.中國(guó)谷子產(chǎn)業(yè)發(fā)展問(wèn)題研究[D].東北農(nóng)業(yè)大學(xué),2013:18-19.

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RAPD Analysis of Different Millet Genotypes

GUOXiaoli1,SHILiran1,LüYaci1,LIMingzhe2
(1.Department of Life Science of Hengshui University,Hengshui Hebei 053000，China；2.Dry Land Farming Institute,Hebei Academy of Agricultural and Forestry Science,Hengshui Hebei 053000，China)

s:In this paper,RAPD molecular-marker technique was used to detect the genetic difference among 9 Millets.Using 20 primers for genomic DNA,we obtained 616 bands.389 polymorphic bands were detected,representing of 63.2%.UPGMA cluster analysis showed that these accessions could be divided into three groups.

millet; RAPD; cluster analysis

2017-01-13

河北省高等學(xué)?？茖W(xué)研究計(jì)劃項(xiàng)目(Z 2014014)。

郭曉麗(1977—)，女，河北邯鄲人；博士，副教授，主要從事植物分子遺傳學(xué)和基因工程方向研究；E-mail:gxllgf@163.com。

李明哲(1976—)，男，河北饒陽(yáng)人；碩士，副研究員，主要從事作物育種研究；E-mail:limingzhe1976@yahoo.com.cn。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2017.07.029

S 515

A

1001-4705(2017)07-0029-03