橡膠樹PEPC基因的克隆、生物信息學和表達分析

王岳坤，陽江華，丁 麗，黃紅海，桂紅星

(中國熱帶農業(yè)科學院橡膠研究所∕農業(yè)部橡膠樹生物學與遺傳資源利用重點實驗室，海南 儋州571737)

橡膠樹PEPC基因的克隆、生物信息學和表達分析

王岳坤，陽江華，丁 麗，黃紅海，桂紅星*

(中國熱帶農業(yè)科學院橡膠研究所∕農業(yè)部橡膠樹生物學與遺傳資源利用重點實驗室，海南 儋州571737)

【目的】克隆橡膠樹磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)基因的全長cDNA，通過生物信息學和基因表達分析，為基因功能研究奠定基礎。【方法】根據(jù)橡膠樹PEPC基因片段序列設計引物，通過RACE獲得cDNA全長，用DNAMAN軟件預測編碼多肽序列，用ProtParam工具分析多肽基本理化性質，用NCBI-Blast工具搜索同源的核酸及多肽序列，用ClustalX2.0軟件比對不同植物來源的多肽序列，并用MEGA 6.06軟件構建系統(tǒng)進化樹，用Real-time RT-PCR分析基因表達模式?！窘Y果】從橡膠樹膠乳中克隆到一個新的PEPC基因的全長cDNA，其長度為3206 bp，包含一個2898 bp的開放讀碼框(ORF)，112 bp的 5’UTR和196 bp 的3’UTR。預測該基因編碼965個氨基酸的多肽(HbPPC2)，其分子量為110.35 kDa，等電點為5.76；該基因的編碼區(qū)核苷酸序列和其編碼多肽氨基酸序列分別與早期克隆的橡膠樹HbPPC1基因(KJ721228)的編碼區(qū)和編碼多肽序列有81.3 %和92.1 %的同源性。預測HbPPC2定位于細胞質，為不穩(wěn)定蛋白，其活性受多種因素調控。預測HbPPC2酶活性中心是其第172位殘基His，磷酸化位點是其第11位殘基Ser，單泛素化位點是其第628位殘基Lys。其第178、179、226和366位殘基Arg在三維結構中靠近，構成葡萄糖-6-磷酸(G6P)的結合位點；其第450、641、753、767位殘基Arg在三維結構中靠近，構成PEP的結合位點。HbPPC2基因在葉片、樹皮、膠乳、雄花、雌花均有表達，在膠乳表達量最高；乙烯利處理顯著下調該基因在膠乳的表達。【結論】本研究可為橡膠樹PEPC功能研究提供理論基礎。

橡膠樹；磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因；克?。簧镄畔W；基因表達

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 植物材料 本研究所用的植物材料為橡膠樹熱研7-33-97，種植在中國熱帶農業(yè)科學院試驗農場。不同組織樣品采自1997年定植的橡膠樹，采樣年份橡膠樹采用“S/2 d/3 ET 1.5 % Ga2(1) 16/y(2w)”割制(半螺旋割線，3日割，施1.5 %乙烯利，拔膠線施藥，每次2 g，帶寬1 cm，每年施 16 次，每2周施1次)，采樣前2 w不涂乙烯利；乙烯利處理的膠乳樣品采自2007年定植的未開割樹，采樣時橡膠樹達開割標準。

1.1.2 質粒、菌株、酶和試劑盒 質粒pMD18-T、大腸桿菌JM109、逆轉錄酶、Taq酶、DNase I、RNase抑制劑、SYBR Green qRT-PCR試劑盒購自Takara公司，SMARTTMRACE 試劑盒購自Clontech公司，凝膠回收試劑盒購自Axygen公司，引物合成和核酸測序委托上海生工公司完成。

1.2 試驗方法

1.2.1 材料處理 不同組織樣品采自9株橡膠樹，每樣品采自3株樹，3個重復，同一天采樣并凍存。乙烯利處理的膠乳樣品采自54株橡膠樹，設6種處理，每處理3株樹，3個重復。6種處理分別在采樣前0、4、8、24、48、72 h涂1.5 %乙烯利(每株樹 2 mL)，同一時間采樣，每株采集2 mL膠乳，同處理3株樹膠乳混合后置于冰上備用。

1.2.2 總RNA提取及cDNA合成 參照唐朝榮等[11]的方法提取膠乳和其它組織的總RNA，取2 μl 膠乳總RNA根據(jù)逆轉錄試劑盒說明書合成cDNA。取2 μl 膠乳總RNA根據(jù)SMARTTMRACE 試劑盒說明書合成5′-和3′-RACE-Ready cDNA。

1.2.3 基因克隆 用蓖麻PEPC的cDNA序列(EF634317.1)搜索橡膠樹膠乳EST數(shù)據(jù)庫(本實驗室建立)，發(fā)現(xiàn)contig06486序列1～753區(qū)段與蓖麻PEPC mRNA序列的2251～3003區(qū)段有91.1 %的同源性。根據(jù)contig06486序列設計引物86-322A(5′-CCAAATCAAT GGTGACCCTA AAGAAAGG-3′)和86-241A(5′-TGACCTGTTT AAATGCTGCT CCAAAGC-3′)，按照SMARTTMRACE試劑盒說明書進行5′-RACE。第1輪PCR以5′-RACE-Ready-cDNA為模板，以86-322A和通用引物UPM(試劑盒提供)組合擴增。第2 輪PCR以第1 輪PCR產物的50倍稀釋液為模板，以86-241A和通用引物NUP(試劑盒提供)組合擴增?；厥盏?輪PCR產物后連接pMD18-T載體，轉化大腸桿菌，挑取陽性克隆測序，獲得5′-RACE片段A。

根據(jù)5′-RACE片段A設計3′-RACE引物86-2242F(5′-GCAATCATTT GGAGAGGAGC ACTTGTG-3′)和86-2353F(5′-GCTGATGGAT GAAATGGCTG TTGTTGC-3′)，按照SMART? RACE試劑盒說明書進行3′-RACE。第1輪PCR以3′-RACE-Ready-cDNA為模板，以86-2242F和通用引物UPM組合擴增，第2輪PCR以第1輪PCR產物的50倍稀釋液為模板，以86-2353F和通用引物NUP組合擴增?；厥盏诙啍U增產物后克隆、測序，獲得3′-RACE片段B。拼接5′-RACE片段A和3′-RACE片段B得到拼接序列C。根據(jù)拼接序列C設計引物86-nF1-115(5′-TCCTCTTTCC CATCCCAACC-3′)和86-nR1-3325(5′-CAGCAAACAC TGGCAGCCCT AAG-3′)，以膠乳cDNA為模板進行PCR擴增，回收PCR產物后克隆、測序，獲得驗證序列D。

1.2.4 生物信息學分析 用Primer Premier 5軟件進行引物設計，用DNAman 5.22 軟件進行序列拼接和序列分析。用BLAST在線工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi/)搜索GenBank的同源序列，用ClustalX 2.0進行蛋白序列比對，用MEGA 6.06軟件構建蛋白序列進化樹(用Clustalw進行序列比對，Neighbor-Jioning算法構建進化樹，用自展值1000檢驗各分支的置信度)。用ProtParam在線工具(http://www.expasy.org/tools/ protparam.html)預測蛋白的基本物理化學性質，用PredictProtein在線工具(http://www.predictprotein.org/)預測蛋白是否存在信號肽和亞細胞定位。

1.2.5 表達分析 根據(jù)測序結果，設計引物對HbPPC2-qF1427(5′-CTGAAGAACG CCGACAAGAG T-3′)和HbPPC2-qR1602 (5′-TGGTGCAGTT GCCATAGAAA T-3′)，以18S rRNA為內參基因(引物對5′-GCTCGAAGAC GATCAGATAC C-3′和5′-TTCAGCCTTG CGACCATAC-3′)，用Real-time PCR分析HbPPC2的表達模式。為比較HbPPC2與HbPPC1的表達差異，兩個基因同時進行表達分析。HbPPC1的引物為HbPPC1-qF101 (5′-ATGCTCTGTT ATTGGACCGA TTT-3′)和HbPPC1-qR218 (5′-GGGTCACGCT TCCCTTCATA C-3′)。擴增程序為94 ℃預變性30 s；94 ℃變性5 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，擴增40個循環(huán)。反應結束后，根據(jù)Ct值，用Pfaffl法[12]計算相對表達量。

2 結果與分析

2.1 基因克隆

根據(jù)蓖麻PEPC基因的核苷酸序列，在橡膠樹膠乳EST數(shù)據(jù)庫中搜索，獲得一段753 bp的同源序列。根據(jù)該序列設計引物，以膠乳RNA制備的5′-RACE-Ready cDNA為模板進行5′-RACE，獲得2612 bp的5′-RACE片段A。根據(jù)片段A序列設計引物，以膠乳RNA制備的3′-RACE-Ready cDNA為模板進行3′-RACE，獲得1023 bp的3′-RACE片段B。拼接片段A和片段B，獲得3375 bp的拼接序列C。根據(jù)拼接序列C設計引物，以膠乳cDNA為模板進行PCR，獲得3206 bp的序列D。序列D含有2898 bp的閱讀框，編碼965個氨基酸，5′UTR為112 bp，3′UTR為196 bp (圖1)。將序列D命名為HbPPC2，提交GenBank，登錄號為KP742954。

2.2 HbPPC2基因生物信息學分析

同源性分析顯示，HbPPC2的編碼區(qū)和多肽序列分別與橡膠樹HbPPC1 (KJ721228)的編碼區(qū)和多肽序列有81.3 %和92.1 %的同源性；分別與蓖麻RcPPC3(EF634317.1) 的編碼區(qū)和多肽序列有90.6 %和95.3 %的同源性；分別與胡楊PePPC(XM011031267.1)的編碼區(qū)和多肽序列有89.0 %和94.6 %的同源性。

NCBI-CDD搜索顯示，HbPPC2編碼多肽的第162～965個殘基是PEPC超家族pfam00311的保守域，多肽的N端第9～17位殘基是植物型PEPC可逆磷酸化的特征序列XXSIDAQLR，C端是保守四肽序列QNTG，第774位殘基為C3-PEPC的特有殘基Ala，表明HbPPC2為C3-PEPC基因。

圖1 HbPPC2的核苷酸及編碼的多肽序列Fig.1 Nucleotide and deduced polypeptide sequences of HbPPC2

ProtParam工具分析表明，HbPPC2的編碼多肽相對分子量為110.35 kDa，等電點為5.76，吸光度為1.083，不穩(wěn)定系數(shù)為45.57，脂肪系數(shù)為90.56，總平均親水性為-0.396。Prosite和PredictProtein分析表明，編碼多肽沒有二硫鍵結構，不含信號肽，定位在細胞質。

2.3 氨基酸序列比對和功能位點預測

鑒于蓖麻[6-7]、玉米[4-5]和擬南芥[13]PEPC功能的深入研究，本研究將HbPPC2的氨基酸序列與蓖麻RcPPC3 (ABR29876.1, C3)、RcPPC4 (ABR29877.1, BTPC)、玉米ZmPPC1 (CAA43709.1, C3)、ZmPPC2 (CAA33316.1, C4)、擬南芥AtPPC1 (CAD58725, C3)和橡膠樹HbPPC1 (KJ721228, C3)進行多序列比對，預測HbPPC2的功能位點。圖2顯示，蓖麻RcPPC4的氨基酸序列與其他6條序列的差別最大，插入和缺失片段較長較多，原因是蓖麻RcPPC4屬于BTPC，其他蛋白屬于PTPC；玉米ZmPPC2序列與5個C3-PEPC很相似，原因是C4-和C3-PEPC同屬于PTPC，它們由共同的祖先基因進化而來，氨基酸序列差別較小。

根據(jù)PTPC序列特征、蓖麻RcPPC3功能位點和玉米ZmPPC2晶體結構，預測HbPPC2的第172位殘基His是其酶活性中心；第11位殘基Ser是磷酸化修飾位點；第628位殘基Lys是單泛素化位點；第178、179、226和366位殘基Arg在三維結構中靠近，構成1個G6P結合位點；第450、641、753、767位殘基Arg在三維結構中靠近，構成PEP結合位點；第641、888位殘基Arg和第963位殘基Asn構成Asp結合位點；第560位殘基Glu和第597位殘基Asp構成Mg2+結合位點。這些位點的殘基替代或三維結構變化均可引起酶活性明顯變化。

2.4 分子進化分析

根據(jù)HbPPC2氨基酸序列，搜索NCBI數(shù)據(jù)庫中同源序列，選取基因功能比較明確的15條序列(兼顧PEPC分型)和橡膠樹HbPPC1序列，用ClustalX 2.0對蛋白序列進行比對，然后用MEGA 6.06軟件中鄰接法構建進化樹(圖3)。結果顯示，17條序列的進化樹呈明顯的階梯形排列，最基部是大腸桿菌的細菌型PEPC，其次是蓖麻、擬南芥、水稻的細菌型PEPC，往上是玉米、高粱的C4-PEPC，高粱、水稻的C3-PEPC，擬南芥、蓖麻、橡膠樹、玉米的C3-PEPC和冰葉日中花的CAM-PEPC聚在一起，位于階梯形進化樹的最上部，橡膠樹和蓖麻的4條C3-PEPC序列進化距離最近。

圖2 不同植物PEPC序列比對Fig.2 Sequence alignment of PEPCs from different plants

圖3 HbPPC2的進化樹分析Fig.3 Phylogenetic analysis of HbPPC2

2.5 表達分析

表達分析表明，2個基因在膠乳的表達量均明顯高于其它組織；HbPPC2在樹皮、雄花、雌花也有較高的表達量，在葉片表達量最低；HbPPC1在葉片具有較高表達量，在樹皮幾乎不表達，與HbPPC2表達模式存在差異(圖4)。乙烯利處理明顯下調膠乳HbPPC2的表達，在處理后4 h，表達量降至處理前的5 %～10 %，此后一直維持這種低水平的表達量至乙烯利處理后72 h，HbPPC1基因也呈這種應答模式(圖5)。

3 討 論

圖4 HbPPC基因在橡膠樹不同組織的相對表達量Fig.4 Expression profiles of HbPPC in different tissues of Hevea

圖5 膠乳HbPPC基因對乙烯利處理的表達應答Fig.5 Expression responds of latex HbPPC to ethephon treatment

PEPC具有復雜的轉錄后活性調控途徑，能夠敏感地根據(jù)環(huán)境因素的變化調節(jié)活性。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，PEPC至少有以下5種轉錄后活性調控途徑：①異構調節(jié)。雙子葉植物PEPC被葡萄糖-6-磷酸(G6P)激活，被蘋果酸、Asp抑制；單子葉植物PEPC還能被Gly和Ala激活。②磷酸化調節(jié)。在PTPC多肽N端的Ser殘基磷酸化上調酶活性，同時降低蘋果酸和L-Asp的抑制效果，提高G6P的激活效果。③單泛素化調節(jié)。正在萌發(fā)的蓖麻[16]、高梁[17]種子PTPC多肽分別在Lys-628、Lys-624殘基單泛素化后活性下降，該位點單泛素化和其N端Ser殘基的磷酸化是相互排斥的反應。④PTPC和BTPC亞基的互作調節(jié)。C3-PEPC呈活性狀態(tài)時一般由完全相同亞基組成四聚體(Class-1 PEPC)，但當PTPC與BTPC亞基結合形成異源八聚體(Class-2 PEPC)之后，酶的異構調節(jié)不敏感[7,18]。⑤細胞溶質pH值的調節(jié)。細胞溶質pH值越偏堿性，PEPC活性越高[1-3]。

橡膠樹莖干樹皮的乳管組織(乳管系統(tǒng))糖代謝很旺盛，割膠后排出的膠乳，不僅包含20 %～50 %的橡膠烴，還包含橡膠烴生物合成所需的糖、酶類物質和細胞器(橡膠粒子和黃色體)。因此，乳管的膠乳再生能力是維系橡膠樹生長發(fā)育和膠乳產量的一個重要構成因素。糖酵解是膠乳再生原料(蔗糖)降解為異戊二烯前體物(乙酰-CoA)的必經代謝途徑，PEP是糖酵解的重要中間產物，其代謝方向及強度極大影響糖酵解效率和膠乳再生能力。在健康的常規(guī)割膠樹莖干乳管系統(tǒng)中，PEP旁路代謝流和主路代謝流的比率及其變化幅度是多少，這是一個有待深入研究的科學問題。上世紀法國學者Jacob等認為，在一般生理條件下，PEP旁路代謝流不超過主路代謝流的10 %，因為強勁的PEP旁路代謝流不利于橡膠烴的生物合成[19]。乙烯利(ET)處理可有效地提高膠乳產量，其原因主要是：⑴延長割膠后的排膠時間，使膠樹排出更多膠乳；⑵促進乳管的糖代謝，使乳管膠乳再生能力增強。膠乳pH值一般保持在6.6～6.9范圍，在ET處理后的1～3 d，pH值可提升0.3～0.4個單位。由于催化蔗糖轉化為葡萄糖和果糖的轉化酶活性對pH值很敏感，pH值稍微提升便導致轉化酶活性顯著上升，導致乳管糖代謝和膠乳再生能力顯著增強[19]。值得注意的是，膠乳pH值提高，也顯著激活PEPC，把較多的糖帶入PEP旁路代謝，這在物質和能量方面均不利于橡膠烴的生物合成，況且相對強勁的PEP旁路代謝產生較多的H+，使膠乳pH值較快回復至ET處理前的水平。本研究發(fā)現(xiàn)，ET處理顯著下調膠乳PEPC基因的表達，使膠乳PEPC數(shù)量下降，這可能部分抵消了膠乳pH值上升PEPC活性提高的效果，使膠乳pH值較長時間保持在較高水平，并使乳管糖代謝保持有利于膠乳再生的方向。

4 結 論

本研究從橡膠樹膠乳中克隆到1個PEPC基因的全長cDNA，其長度為3206 bp，包含2898 bp的閱讀框，編碼965個氨基酸。該cDNA的編碼多肽的第162～965個殘基是PEPC超家族pfam00311的保守域，N端第9～17位殘基是植物型PEPC可逆磷酸化的特征序列XXSIDAQLR，C端是保守的四肽序列QNTG，第774位殘基為C3-PEPC的特有殘基Ala。該cDNA的編碼區(qū)和編碼多肽序列分別與早期克隆的橡膠樹HbPPC1 (KJ721228)基因的編碼區(qū)和編碼多肽序列有81.3 %和92.1 %的同源性；分別與蓖麻RcPPC3(EF634317.1)的編碼區(qū)和編碼多肽序列有90.6 %和95.3 %的同源性。因此，確認該cDNA為橡膠樹一個新的PEPC基因的全長cDNA，命名為HbPPC2，登錄號為KP742954。預測其編碼多肽的分子量為110.35 kDa，等電點為5.76，定位于細胞質，為不穩(wěn)定蛋白，其活性受多種因素調控。預測編碼多肽的第172位殘基His是酶的活性中心；第11位殘基Ser是酶的磷酸化位點；第628位殘基Lys是酶的單泛素化位點；第178、179、226、366位殘基Arg在三維結構中靠近，構成G6P的結合位點；第450、641、753、767位殘基Arg在三維結構中靠近，構成PEP的結合位點。HbPPC2在葉片、樹皮、膠乳、雄花、雌花均有表達，在膠乳表達量最高；乙烯利處理顯著下調其在膠乳的表達。本研究可為橡膠樹PEPC功能研究提供一些理論基礎。

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(責任編輯 陳 虹)

Cloning,Bio-informaticsandExpressionAnalysisofPEPCGenefromHeveabrasiliensis

WANG Yue-kun, YANG Jiang-hua, DING Li, HUANG Hong-hai, GUI Hong-xing*

(Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Rubber Tree, Ministry of Agriculture / Rubber Research Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Hainan Danzhou 571737, China)

【Objective】This study aimed to clone the full-length cDNAs of phosphoenolpyruvate carboxylase (PEPC) genes ofHeveabrasiliensis, elucidate the sequence characters of encoded proteins and their expression profiles, with a view to lay the foundations of the research on biologic function ofHeveaPEPC genes.【Method】 Primers were designed according to the partial sequences ofHeveaPEPC gene and the full-length cDNA of PEPC gene was cloned fromHevealatex by RACE technology. The amino acid sequence of encoded protein was predicted by DNAMAN software and its basic physical and chemical characteristics were predicted by ProtParam tool. Similar nucleotide and protein sequences were obtained by NCBI-Blast. Protein sequences from different plants were multiple-aligned by ClustalX 2.0 software and the phylogenetic tree was constructed by MEGA 6.06. The expression profiles of the PEPC genes were analyzed by real-time RT-PCR. 【Result】 A full-length cDNA of a new PEPC gene was cloned fromHevealatex which contained a 2898 bp open reading frame (ORF), a 112 bp 5′UTR and a 196 bp 3′UTR. It was predicted to encode a polypeptide of 965 amino acids (HbPPC2) with a theoretical molecular weight of 110.35 kDa and a PI of 5.76. The sequences of its coding region and coded polypeptide shared 81.3 % and 92.1 % homology respectively toHeveaHbPPC1 gene (KJ721228) which had been cloned previously. HbPPC2 was predicted to locate in cytoplasm, belonging to non-stable protein whose enzymatic activity might be regulated by diverse factors. The His172residue of HbPPC2 was predicted to be the enzymactic activity site; the Ser11residue to be the phosphorylation site; the Lys628residue to be the mono-ubiquination site; the group of Arg178, Arg179, Arg226, and Arg336residue-close in three-dimension structure-to form the glucose-6-phosphate (G6P) biding site; and the group of Arg450, Arg641, Arg753, and Arg767residue-close in three-dimension structure-to form the phosphoenolpyruvate (PEP) biding site.HbPPC2 gene was ubiquitously expressed in bark, latex, leaf, male and female flower, with the highest expression in latex, however its expression in latex reduced significantly after ethephon treatment onHeveatrunk.【Conclusion】This result may provide theoretical basis for the research of HbPPC.

Heveabrasiliensis; Phosphoenolpyruvate carboxylase (PEPC) gene; Cloning; Bio-informatics; Gene expression

S794.1

A

1001-4829(2017)11-2436-08

10.16213/j.cnki.scjas.2017.11.008

2017-03-20

中國熱帶農業(yè)科學院基本科研業(yè)務費專項資金(163 0022012011，1630022017023)

王岳坤(1969-)，男，廣東普寧人，副研究員，從事橡膠樹膠乳生理和分子生物學研究；*為通訊作者，E-mail：xwangyk@126.com，guihongxing@263.net,電話:0898-23306599。