柱后衍生HPLC法測定功能飲料中的牛磺酸

魏永濤，林娣，曹廣生

(1.濟(jì)南市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，濟(jì)南 250101； 2.山東福瑞達(dá)生物工程有限公司，濟(jì)南 250101)

柱后衍生HPLC法測定功能飲料中的?；撬?/p>

魏永濤1，林娣2，曹廣生1

(1.濟(jì)南市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，濟(jì)南 250101； 2.山東福瑞達(dá)生物工程有限公司，濟(jì)南 250101)

建立柱后衍生-高效液相色譜法測定功能性飲料中牛磺酸的含量。功能性飲料中的?；撬峤?jīng)水溶提取后與鄰苯二甲醛柱后衍生，以檸檬酸三鈉溶液(pH 3.2)為流動相，用AMINO-NA色譜柱分離，熒光檢測器檢測，激發(fā)波長為338 nm，發(fā)射波長為425 nm，柱后衍生反應(yīng)溫度為55℃，流量為0.4 mL／min。牛磺酸質(zhì)量濃度在5.0～25.0 μg／mL范圍內(nèi)與色譜峰面積線性關(guān)系良好，r=0.999 8，檢出限(S／N=3)為0.11 μg／mL，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.73%(n=6)，加標(biāo)回收率在99.2%～101.6%之間。該方法靈敏度高、選擇性好，可用于市售功能性飲料中?；撬岬臏y定。

?；撬?；功能飲料；鄰苯二甲醛；高效液相色譜法；柱后衍生

牛磺酸又稱2-氨基乙磺酸，是一種含硫的β氨基酸，在體內(nèi)多以游離方式存在，具有多種藥理和營養(yǎng)保健作用，被廣泛應(yīng)用于保健食品、醫(yī)藥和食品添加劑等領(lǐng)域。我國于1993年批準(zhǔn)在乳制品、嬰幼兒食品、谷類制品及強(qiáng)化飲料中可添加?；撬嶙鳛楣δ軤I養(yǎng)劑［1-5］。功能性飲品中適當(dāng)添加?；撬?，可達(dá)到強(qiáng)化補(bǔ)給及保健功效。但過量攝入?；撬釙种企w內(nèi)其它營養(yǎng)元素的吸收，造成人體內(nèi)營養(yǎng)失衡［5］，因此嚴(yán)格控制牛磺酸攝入量及準(zhǔn)確檢測功能性飲品中?；撬岬暮浚瑢鉅I養(yǎng)攝入具有重要意義。

目前關(guān)于?；撬岬臋z測方法有滴定法［6-7］、薄層色譜法［8-9］、氨基酸自動分析法［10-13］和高效液相色譜法［14-16］等。滴定法和薄層色譜法具有經(jīng)濟(jì)、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)，但易受其它雜質(zhì)干擾，靈敏度不高；氨基酸自動分析法靈敏度高，選擇性好，卻分析耗時較長，儀器昂貴且較難普及；高效液相色譜法因具有樣品預(yù)處理簡單，檢測快速等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用［17-19］。采用柱前衍生高效液相色譜法［20-23］時，?；撬嵫苌锏姆€(wěn)定時間較短，衍生時間和進(jìn)樣時間對檢測結(jié)果具有較大的影響。隨著氨基酸分析柱的日益成熟和性能的不斷改善，鄰苯二甲醛（OPA）柱后衍生HPLC法已成為分析食品中氨基酸含量的主要手段。筆者采用AMINO-NA柱分離?；撬?，建立了OPA柱后在線衍生HPLC法測定功能性飲料中?；撬岬姆椒?。樣品處理后，在氨基酸專用分析柱中分離被測物，再與OPA柱后在線衍生，由FLD檢測定量。將該法用于市售功能性飲料中牛磺酸含量的測定，取得了良好的效果。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：1260型，配備FLD檢測器，美國安捷倫公司；

柱后衍生裝置：PCR3型，美國蘭博公司；高速冷凍離心機(jī)：CF16RXⅡ，日本日立公司；電子分析天平：MS105DU型，美國梅特勒-托利多公司；

甲醇：色譜純，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；

2-巰基乙醇：色譜純，北京百靈威科技有限公司；

鄰苯二甲醛、聚氧乙烯月桂酸醚、硼酸、氫氧化鉀、檸檬酸三鈉：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

?；撬釋φ掌罚杭兌葹?00%，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；

硼酸鉀溶液：0.5 mol／L，稱取 30.9 g硼酸和26.3 g氫氧化鉀，用水溶解并定容至1 000 mL；

檸檬酸三鈉溶液：稱取19.6 g檸檬酸三鈉，加入950 mL水溶解，加入1 mL苯酚，用硝酸調(diào)節(jié)pH值至3.2，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾［24］；

實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

色譜柱：AMINO-NA柱(100 mm ×6.0 mm，日本島津公司)；流動相：檸檬酸三鈉溶液，流量為0.4 mL／min；熒光衍生溶液流量：0.4 mL／min；色譜柱及柱后衍生裝置PCR3溫度：55℃；檢測器：熒光檢測器，激發(fā)波長為338 nm，發(fā)射波長為425 nm；進(jìn)樣體積：20 μL；外標(biāo)法定量。

1.3 溶液制備

1.3.1 衍生化溶液

稱取0.6 g鄰苯二甲醛，用10 mL甲醇溶解，加入0.5 mL 2-巰基乙醇、0.35 g聚氧乙烯月桂酸醚，用硼酸鉀溶液定容至1 000 mL，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后使用，臨用前現(xiàn)配且避光操作。

1.3.2 對照品溶液

精密稱取?；撬釋φ掌?5.80 mg，用水稀釋并定容至25 mL，得?；撬針?biāo)準(zhǔn)儲備溶液。精密量取?；撬針?biāo)準(zhǔn)儲備溶液5.0 mL于100 mL容量瓶中，加水至標(biāo)線，搖勻即得?；撬針?biāo)準(zhǔn)溶液。分別移取?；撬針?biāo)準(zhǔn)溶液 1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，置于 5 個10 mL容量瓶中，配制成質(zhì)量濃度分別為5.0，10.0，15.0，20.0，25.0 μg／mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3.3 樣品溶液

精密稱取混勻樣品約2.0 g于100 mL容量瓶中，加入50 mL水，超聲提取15 min，待冷卻至室溫，用水定容至標(biāo)線并搖勻，以5 000 r／min離心10 min，取上清液經(jīng)0.45μm濾膜過濾，取續(xù)濾液，再經(jīng)0.22μm濾膜過濾，待測。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品溶液制備時稀釋液的選擇

對樣品溶液制備時所需稀釋液進(jìn)行試驗(yàn)考察，在紅牛、樂虎、東鵬特飲3種功能飲料樣品中分別加水稀釋［16，25-26］或加入偏磷酸 (去除蛋白 )稀釋［20］，超聲提取15 min，冷卻至室溫，然后加入水稀釋并定容至100 mL，取樣進(jìn)行測定。結(jié)果表明，加入偏磷酸和直接加水稀釋，其測定結(jié)果無顯著性差異，因此選擇超純水作為稀釋液。

2.2 流動相的選擇

AMINO-NA柱為強(qiáng)酸陽離子交換色譜柱，當(dāng)流動相pH為3.10～3.25時，強(qiáng)酸性陽離子交換劑具有較高的交換容量(全部離子化)。對于流動相pH的控制，陽離子交換劑常選用檸檬酸根離子的緩沖液；同時在離子交換色譜中，又常用硝酸鈉控制流動相的離子強(qiáng)度［27］。因此選擇檸檬酸三鈉作為流動相［24］。

2.3 衍生劑流量與衍生反應(yīng)溫度的選擇

影響衍生化效果的主要因素是衍生劑的流量和衍生反應(yīng)溫度［24］。根據(jù)色譜柱廠商推薦的條件(流量為 0.3～0.8 mL／min，柱溫不高于 95℃ )，固定色譜柱流量為0.4 mL／min，柱溫為55℃，考察衍生劑流量為 0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 mL／min 時衍生物色譜峰面積的變化情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，衍生流量為0.4 mL／min時，其它雜質(zhì)的干擾最小，衍生物的響應(yīng)值最高，因此衍生劑流量選擇為0.4 mL／min。固定衍生流量為0.4 mL／min和其它色譜條件，考察衍生溫度為45～75℃時，衍生物色譜峰面積的變化情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，衍生溫度為55℃時，衍生物的響應(yīng)值最佳，因此選擇衍生反應(yīng)溫度為55℃。

2.4 激發(fā)波長和發(fā)射波長的選擇

在2-巰基乙醇作用下，?；撬崤cOPA縮合反應(yīng)產(chǎn)生藍(lán)色熒光，該縮合物最大激發(fā)波長在335～340 nm 之間［28-29］，試驗(yàn)選擇以 338 nm 作為固定激發(fā)波長。設(shè)置發(fā)射波長分別為415，425，435，445，455，465 nm，結(jié)果發(fā)現(xiàn)發(fā)射波長為425 nm時，其它物質(zhì)在激發(fā)波長338 nm處無熒光發(fā)射或發(fā)射的熒光強(qiáng)度最弱，干擾最小，因此選擇發(fā)射波長為425 nm。

2.5 色譜分離

在1.2儀器工作條件下，對牛磺酸對照品溶液及供試品溶液進(jìn)行測定，色譜圖分別見圖1、圖2。由圖1、圖2可知，使用AMINO-NA柱能很好地分離飲料中的游離?；撬?，使用熒光檢測器定量檢測衍生物，減少了其它物質(zhì)的干擾，提高了檢測靈敏度。

圖2 ?；撬峁┰嚻啡芤荷V圖

2.6 工作曲線方程與檢出限

在1.2儀器工作條件下，對1.3.2中系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行測定，以牛磺酸質(zhì)量濃度(X，μg／mL)為橫坐標(biāo)，以色譜峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得線性方程為Y=131.1X+26.7，r=0.999 8，線性范圍為 5.0～25.0 μg／mL。

以3倍信噪比(S／N=3)對應(yīng)的?；撬豳|(zhì)量濃度作為方法檢出限，經(jīng)計(jì)算得方法的檢出限(LOD)為 0.11 μg／mL。

2.7 精密度試驗(yàn)

移取質(zhì)量濃度為2.5 μg／mL的?；撬針?biāo)準(zhǔn)工作溶液重復(fù)進(jìn)樣測定，記錄色譜峰面積并計(jì)算測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表2。由表2可知，?；撬針?biāo)準(zhǔn)工作溶液測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.73%，表明方法的精密度較高。

表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.8 加標(biāo)回收試驗(yàn)

按實(shí)驗(yàn)方法對紅牛飲料樣品進(jìn)行測定，然后進(jìn)行低、中、高濃度的加標(biāo)回收試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見表3。由表3可知，方法的加標(biāo)回收率在99.2%～101.6%之間，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.12%～0.20%，表明所建方法準(zhǔn)確度良好。

表3 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果(n=4)

2.9 樣品測定

用所建立的方法對市售紅牛品牌6個不同批次的飲料樣品進(jìn)行測定，結(jié)果見表4。

表4 樣品測定結(jié)果(n=4)

由表4可知，方法測定結(jié)果的平均值與標(biāo)示值接近，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.10%～0.20%，說明本方法具有較高的準(zhǔn)確度和精密度，可用于功能性飲料中牛磺酸的檢測。

3 結(jié)語

采用AMINO-NA柱分離功能性飲料中的?；撬?，與鄰苯二甲醛(OPA)柱后在線衍生，衍生物由熒光檢測器定量檢測，該方法簡化了實(shí)驗(yàn)操作步驟，提高了檢測靈敏度，測定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，適用于市售功能性飲料中?；撬岬臋z測。

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中國儀器儀表行業(yè)協(xié)會七屆五次理事（擴(kuò)大）會議在鄭州隆重召開

中國儀器儀表行業(yè)協(xié)會第七屆五次理事(擴(kuò)大)會議不久前在鄭州隆重召開，來自協(xié)會理事單位和會員企業(yè)的200余位代表參加了會議，專職副理事長兼秘書長李躍光、副理事長高玉清、曾艷麗、郭峻峰、宣瑞國、任紅軍、歐陽勁松、王學(xué)信、劉龍官、陳吉文、鐘瓊?cè)A、張明遠(yuǎn)、莊慶偉、李源等領(lǐng)導(dǎo)出席。

會議由副理事長高玉清主持。理事會的主要議程有兩項(xiàng)：第一項(xiàng)是聽取協(xié)會2017年的工作情況匯報(bào)，第二項(xiàng)是審議吸收新會員、副理事長變更、增補(bǔ)理事和聘任副秘書長的議案。

會議首先聽取了中國儀器儀表行業(yè)協(xié)會專職副理事長兼秘書長李躍光同志關(guān)于2017年協(xié)會工作情況匯報(bào)。報(bào)告就一年來協(xié)會的工作做了認(rèn)真總結(jié)，今年協(xié)會主要工作是適應(yīng)新形勢下企業(yè)會員的需要，同時對協(xié)會下一步的工作提出了很好的設(shè)想。各會員單位、各理事、各副理事長單位積極響應(yīng)，計(jì)劃通過大家共同的努力把協(xié)會的自身建設(shè)和協(xié)會工作做得更好。

會議審議通過了關(guān)于吸收新會員、副理事長變更、增補(bǔ)理事和聘任副秘書長的議案。

為了給各位會員企業(yè)提供更好更多的行業(yè)信息，加強(qiáng)企業(yè)之間交流和行業(yè)情況溝通，今年特意在召開理事擴(kuò)大會議的同期，安排舉辦儀器儀表行業(yè)發(fā)展峰會。會后，協(xié)會組織參會代表考察了新鄉(xiāng)市平原示范區(qū)，考察項(xiàng)目包括華蘭生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)園、電子信息產(chǎn)業(yè)園等。

(儀器信息網(wǎng))

Determination of Taurine in Functional Drinks by HPLC with Post-column Derivatization

Wei Yongtao1， Lin Di2， Cao Guangsheng1
(1. Jinan City Institute for Food and Drug Control， Jinan 250101， China ；2. Shandong Freda Bio-engineering Co.， Ltd.， Jinan 250101， China)

A method for detecting taurine in functional drinks by HPLC with post-column derivatization was established. Taurine in functional drinks was extracted after being dissolved in water，and derivatized with ortho-phthalaldehyde post-column. Sodium citrate solution (pH3.2) was used as mobile phase，and an AMINONA column was applied for separation. The excitation wavelength of fluorescence detector was set at 338 nm and emission wavelength at 425 nm. The temperature for derivatization reaction was 55℃，and the flow rate was 0.4 mL／min. The mass concentration of taurine was linear with chromatographic area in the range of 5.0-25.0 μg／mL,r=0.999 8. The detection limit(S／N=3) was 0.11 μg／mL, the relative standard deviation of detection results was 0.73%(n=6). The spiked recovery was between 99.2% and 101.6%. This method has high sensitivity and selectivity，which can be used for the determination of taurine in commercially available functional drinks.

taurine; functional drink; ortho-phthalaldehyde; high performance liquid chromatography; postcolumn derivatization

O657.7 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1008-6145(2017)06-0041-04

10.3969／j.issn.1008-6145.2017.06.010

聯(lián)系人：魏永濤；E-mail： xiaozi2964@163.com

2017-08-12