非靶標(biāo)代謝組研究溫度對(duì)黃曲霉菌代謝的影響

謝華里，李培武,5*，王秀嬪，張 奇，張良曉，王 同，張 文,5，汪雪芳,5

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所，湖北 武漢 430062；2.農(nóng)業(yè)部油料作物生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430062；3.農(nóng)業(yè)部生物毒素檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430062；4.農(nóng)業(yè)部油料產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430062；5.農(nóng)業(yè)部油料及制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心，湖北 武漢 430062)

非靶標(biāo)代謝組研究溫度對(duì)黃曲霉菌代謝的影響

謝華里1,2,3,4，李培武1,2,3,4,5*，王秀嬪1,3,4,5*，張 奇1,2,3,4，張良曉1,3,4,5，王 同1,2,3，張 文1,2,3,5，汪雪芳1,2,3,5

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所，湖北 武漢 430062；2.農(nóng)業(yè)部油料作物生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430062；3.農(nóng)業(yè)部生物毒素檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430062；4.農(nóng)業(yè)部油料產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430062；5.農(nóng)業(yè)部油料及制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心，湖北 武漢 430062)

采用基于超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用的非靶標(biāo)代謝組學(xué)方法來(lái)研究溫度對(duì)黃曲霉菌生理代謝的影響，使用交互偏最小二乘判別分析(OrthoPLS-DA)等化學(xué)計(jì)量學(xué)方法對(duì)代謝組數(shù)據(jù)進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析，使用二級(jí)質(zhì)譜信息和譜庫(kù)檢索定性黃曲霉菌代謝特征信息。使用內(nèi)標(biāo)結(jié)合混合質(zhì)控樣品的方法對(duì)非靶標(biāo)代謝組方法進(jìn)行質(zhì)量控制。將該方法應(yīng)用于研究溫度對(duì)黃曲霉菌代謝組的影響，發(fā)現(xiàn)不同溫度下有3 593個(gè)(T檢驗(yàn)p<0.01)差異表達(dá)代謝特征，篩選出20個(gè)候選差異代謝物。研究結(jié)果表明，溫度顯著影響三羧酸循環(huán)、脂肪酸、苯丙氨酸、色氨酸、絡(luò)氨酸等生物合成路徑，并調(diào)控黃曲霉毒素、黃匹阿尼酸、曲酸等次生代謝物生物合成路徑酶活性。研究發(fā)現(xiàn)曲酸和黃曲霉毒素前體化合物與黃曲霉毒素的累積變化規(guī)律相似，可作為候選靶標(biāo)進(jìn)行驗(yàn)證。該研究為開展我國(guó)黃曲霉毒素風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和分子預(yù)警研究提供了新的路徑和方法。

黃曲霉菌；代謝組；高分辨質(zhì)譜；黃曲霉毒素生物合成；溫度

黃曲霉毒素是迄今發(fā)現(xiàn)毒性最強(qiáng)的一類污染花生和玉米等農(nóng)產(chǎn)品的生物毒素，對(duì)我國(guó)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全構(gòu)成了很大威脅，特別是近年來(lái)對(duì)花生等油料農(nóng)產(chǎn)品的出口貿(mào)易造成重大影響。當(dāng)前，研究已經(jīng)明確遺傳、生物和非生物因素將影響黃曲霉毒素的形成，并已明確了參與黃曲霉毒素生物合成路徑上的骨架基因，調(diào)控因子及生物合成酶[1]。此外黃曲霉菌全基因組測(cè)序已經(jīng)完成，也對(duì)其次生代謝基因簇進(jìn)行了生物信息學(xué)預(yù)測(cè)[2]，黃曲霉毒素生物合成區(qū)室化分布[3]和光照如何調(diào)控黃曲霉毒素合成也已報(bào)道[4]，這些研究基礎(chǔ)為基于質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合基因挖掘策略進(jìn)行黃曲霉次生代謝研究提供了較為充足的理論基礎(chǔ)。溫度和水分活度是生產(chǎn)和糧油倉(cāng)儲(chǔ)中影響黃曲霉毒素產(chǎn)生最重要的環(huán)境因子。當(dāng)前對(duì)于以溫度調(diào)控黃曲霉毒素形成的機(jī)制仍不明確，僅停留于最適宜溫度為28～30 ℃，低溫(<20 ℃)和高溫(>35 ℃)抑制黃曲霉毒素產(chǎn)生的表觀層面。而通過(guò)研究溫度顯著調(diào)控的靶點(diǎn)，可為黃曲霉毒素的防控提供參考靶點(diǎn)和理論支撐，也為開展黃曲霉污染早期分子預(yù)警和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估研究提供技術(shù)支撐。

代謝組學(xué)(Metabolomics或Metabonomics)是繼基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)等系統(tǒng)生物學(xué)之后興起的一個(gè)分支[5]。當(dāng)前代謝組學(xué)主要分為靶向代謝組學(xué)和非靶向代謝組學(xué)，靶向代謝組學(xué)是針對(duì)特定數(shù)量或種類的代謝分析策略，具有主觀目的性。而非靶向代謝組學(xué)是一種盡可能多的檢測(cè)樣本中代謝物的分析策略，從總體上對(duì)生物學(xué)問(wèn)題在代謝水平上實(shí)現(xiàn)導(dǎo)航，具有無(wú)偏性。由此可見(jiàn)，非靶向代謝組學(xué)研究的代謝物集合更大，這對(duì)分析儀器平臺(tái)提出了更高的精度要求。目前，代謝組學(xué)主要基于核磁共振和質(zhì)譜分析平臺(tái)并結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)進(jìn)行代謝差異研究。其中高分辨質(zhì)譜在非靶向代謝分析方面扮演著重要的角色。該平臺(tái)主要通過(guò)一級(jí)精確質(zhì)量數(shù)和二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)作為定性判據(jù)，為分析海量的代謝信息提供高分辨工具平臺(tái)。目前主流的高分辨質(zhì)譜有飛行時(shí)間質(zhì)譜(TOF-MS)、靜電場(chǎng)軌道阱(Orbitrap-MS)質(zhì)譜和傅立葉變換離子回旋共振FTICR-MS質(zhì)譜。靜電場(chǎng)軌道阱(Orbitrap-MS)質(zhì)譜(MS error<2 ppm)相比于飛行時(shí)間(TOF-MS)質(zhì)譜(MS error<5 ppm)具有更低的測(cè)量質(zhì)量誤差，同時(shí)在儀器穩(wěn)定性和重現(xiàn)性上顯著優(yōu)于飛行時(shí)間(TOF-MS)質(zhì)譜[6]，F(xiàn)TICR-MS雖是目前測(cè)量精度最高的質(zhì)譜，但其掃描速度較前兩者更慢，在代謝組學(xué)研究中應(yīng)用較少。此外，將高分辨質(zhì)譜技術(shù)應(yīng)用于黃曲霉菌等真菌的研究報(bào)道較為缺乏，主要集中在利用高分辨質(zhì)譜技術(shù)對(duì)黃曲霉菌新次生代謝物通路的結(jié)構(gòu)鑒定研究方面[7-8]。

本文通過(guò)利用代謝組研究建立以黃曲霉菌為代表的絲狀真菌的非靶標(biāo)代謝組學(xué)方法，并利用該方法研究溫度對(duì)黃曲霉菌生理代謝的影響，為深入理解黃曲霉菌響應(yīng)環(huán)境因子機(jī)制提供一個(gè)有效的方法途徑。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與材料

甲醇(MeOH)、乙酸乙酯(EA)、二氯甲烷(DCM)、乙腈(ACN)(色譜純,美國(guó)Fisher 公司)，甲酸購(gòu)于Sigma-Aldrich 公司(Bornem,Belgium)。2-氯苯丙氨酸購(gòu)于百靈威公司。超純水通過(guò)Milli-Q Gradient System(Millipore,Brussels,Belgium)產(chǎn)生。PDA固體培養(yǎng)基(200 g馬鈴薯，洗凈去皮切碎，加水1 000 mL蒸煮0.5 h，紗布過(guò)濾，再加葡萄糖10 g，充分溶解后趁熱用紗布過(guò)濾，分裝于三角錐形瓶中，加入瓊脂15 g，搖勻。121 ℃滅菌20 min，冷卻后貯存?zhèn)溆?。沙氏培養(yǎng)基購(gòu)于海博生物公司。冷甘油緩沖溶液(-30 ℃)：丙三醇和NaCl溶液(13.5 g/L)以3∶2(體積比)混合；清洗溶液：丙三醇和NaCl溶液(13.5 g/L)以1∶1(體積比)混合。PBS緩沖溶液：0.01 mol/L PBS緩沖液(pH 7.4)：稱取NaCl 8.0 g、Na2HPO4·12H2O 2.9 g、KCl 0.2 g、KH2PO40.2 g溶于900 mL去離子水中，用鹽酸或氫氧化鈉溶液調(diào)至pH 7.4，補(bǔ)加去離子水并定容至1 L。

1.2 菌株及培養(yǎng)條件

AF73菌株由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所質(zhì)檢中心(武漢)提供。黃曲霉菌在PDA固體培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)10 d后，用無(wú)菌水(含0.1%的吐溫-80)將孢子從培養(yǎng)基上洗下，用血球板計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)。沙氏液體培養(yǎng)基中接種黃曲霉孢子懸液，使接種量達(dá)5×105個(gè)/mL，將培養(yǎng)瓶置于28 ℃恒溫?fù)u床(200 r/min)培養(yǎng)6 d，得到黃曲霉菌樣品。

1.2 取樣與樣品準(zhǔn)備

1.2.1黃曲霉菌猝滅方法采用改進(jìn)的冷甘油緩沖溶液法猝滅[9]，具體步驟為：快速轉(zhuǎn)移黃曲霉菌株樣品到預(yù)先加入冷甘油緩沖溶液猝滅劑的50 mL離心管中，混合液中樣品體積和猝滅劑體積比保持在1∶4～1∶6之間?？焖倬|(zhì)混合液(渦旋10 s)后，置于 -30 ℃冷卻5 min。真空抽濾，快速過(guò)濾猝滅樣品，吸取5 mL PBS清洗黃曲霉菌絲球，重復(fù)1次，收集得到樣品，冷凍干燥8 h。

1.2.2黃曲霉菌細(xì)胞被膜破碎方法及代謝物提取采用非機(jī)械破碎方法中的有機(jī)溶劑穿透破碎結(jié)合超聲機(jī)械破碎對(duì)細(xì)胞進(jìn)行破碎和代謝物提取。提取溶劑為混合溶劑MeOH-DCM-EA(1∶1∶1，體積比)，同時(shí)加入1%甲酸以提高化合物離子化效率，加入內(nèi)標(biāo)2-氯苯丙氨酸配成500 μg/L溶液。混合提取溶液配制好后，取2 mL提取液加入樣品中進(jìn)行代謝物超聲(超聲功率100%)提取20 min。

1.3 UHPLC-HRMS儀器條件

在高效液相色譜(Dionex,Sunnyvale,CA,USA)上進(jìn)行色譜分離，色譜柱為C18反向色譜柱(Hypersil Gold,100 mm×2.1 mm i.d.3 μm,Thermo Fisher Scientific,USA)。使用Orbitrap Fusion靜電軌道阱高分辨質(zhì)譜(Thermo Scientific,USA)做質(zhì)譜分析。

流動(dòng)相：A為甲醇-水(95∶5,體積比，含0.1%甲酸和10 mmol/L甲酸銨)混合溶液；B為水-甲醇(95∶5，體積比，含0.1%甲酸和10 mmol/L甲酸銨)混合溶液。梯度洗脫程序?yàn)椋?～2 min，85%B;2～8 min，85%～50%B;8～10 min,50%B;10～12 min，50%～30%B;12～13 min，30%B；13～15 min，30%～0%B；15～16 min,0%B;16～24 min，0%～85%B;24～28 min，85%B。流速為0.3 mL/min。柱溫為40 ℃，自動(dòng)進(jìn)樣室溫度為15 ℃，進(jìn)樣量為2 μL。

高分辨質(zhì)譜條件：離子源加熱溫度為300 ℃；噴霧電壓：正離子模式下為3.5 kV，負(fù)離子模式下為3.0 kV；鞘氣為40 Arb；輔氣為5 Arb。離子傳輸毛細(xì)管溫度為320 ℃，毛細(xì)管電壓-1.9 kV。主要的一級(jí)精確質(zhì)量數(shù)全掃參數(shù)如下：檢測(cè)器選用Orbitrap，分辨率選擇120 000 FWHM(半峰寬)，掃描范圍為100～1 000m/z，自動(dòng)增益控制設(shè)定為1.0e6，注入時(shí)間為100 ms。一級(jí)掃描與二級(jí)掃描間主要的過(guò)濾參數(shù)如下：強(qiáng)度閾值為1.0e4，帶電荷為1～2個(gè)，動(dòng)態(tài)排除設(shè)定為1。數(shù)據(jù)依賴采集選擇Top speed模式，循環(huán)時(shí)間為1 s。主要的二級(jí)質(zhì)譜掃描(dd-ms2)參數(shù)如下：碎裂模式為選擇高能碰撞誘導(dǎo)裂解模式(HCD)，碰撞能正離子模式下設(shè)為35 eV，負(fù)離子模式設(shè)為30 eV。檢測(cè)器類型為Orbitrap，分辨率設(shè)為30 000 FWHM，自動(dòng)增益控制設(shè)為5.0e4，最大注入時(shí)間為100 ms，四極桿隔離寬度為1 Da。

1.4 數(shù)據(jù)預(yù)處理與多元統(tǒng)計(jì)分析

使用SIEVE 3.0(Thermo Scientific,USA)對(duì)原始數(shù)據(jù)分別進(jìn)行峰對(duì)齊，提取，代謝物譜庫(kù)檢索定性得到原始峰表。經(jīng)過(guò)處理后導(dǎo)入SIMCA14.1或在線代謝組學(xué)數(shù)據(jù)處理網(wǎng)站MetaboAnalyst 3.0(www.metaboanalyst.ca)[10]或XCMS[11](https://xcmsonline.scripps.edu)進(jìn)行數(shù)據(jù)過(guò)濾、標(biāo)準(zhǔn)化等數(shù)據(jù)預(yù)處理和多元統(tǒng)計(jì)分析。使用代謝組數(shù)據(jù)庫(kù)METLIN(https://metlin.scripps.edu/)、mzCloud(https://www.mzcloud.org/)、YMDB( http://www.ymdb.ca/)和KEGG (http://www. kegg. com/ )和本地庫(kù)進(jìn)行代謝物定性。

1.5 溫度對(duì)黃曲霉菌代謝組的影響

分別以不同溫度(18、28、38 ℃)培養(yǎng)的3組黃曲霉菌作為樣品，使用上述的前處理步驟、檢測(cè)條件和數(shù)據(jù)處理方法，對(duì)黃曲霉菌生理及次生代謝情況進(jìn)行全組分分析，以期初步揭示不同溫度條件對(duì)黃曲霉生理及其產(chǎn)毒的影響機(jī)制。

圖1 非靶標(biāo)代謝組方法確證圖示Fig.1 Method validation plot involved in non-targeted metabolomicsaA.rincipal component analysis scores plot of three temperature and quality control sample;B.8 ℃ and 28 ℃ groups of samples were aligned with the original peak of total ion current;C.lot of retention time deviation for 18 ℃ and 28 ℃ groups of samples;18-BN and 28-BN represent the intracellular group of 18 ℃ and 28 ℃(18-BN和28-BN代表18,28 ℃組樣品胞內(nèi)的6個(gè)重復(fù))

2 結(jié)果與討論

2.1 非靶標(biāo)代謝組學(xué)方法確證

非靶標(biāo)代謝組學(xué)方法分析目標(biāo)是數(shù)以千計(jì)的未知形式代謝物，其方法確證有別于目標(biāo)物分析方法確證，更具挑戰(zhàn)性[12]。為確保研究發(fā)現(xiàn)的差異是生物學(xué)差異而非測(cè)定誤差帶來(lái)的技術(shù)差異，需進(jìn)行有效的質(zhì)量控制。目前國(guó)際上常用方法是使用混合QC質(zhì)控樣品，即從樣本中取少量、等量混勻用作QC樣本，將其插入運(yùn)行序列中用于監(jiān)測(cè)儀器穩(wěn)定性和可重復(fù)性并用于數(shù)據(jù)過(guò)濾[13]。本研究使用2-氯苯丙氨酸作為內(nèi)標(biāo)結(jié)合混合QC質(zhì)控樣品對(duì)數(shù)據(jù)質(zhì)量進(jìn)行監(jiān)測(cè)，并用于方法確證[12,14]。分析結(jié)束后使用QC樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行以下工作：對(duì)分析性能進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)價(jià)，判斷進(jìn)一步數(shù)據(jù)分析的必要性；進(jìn)行代謝特征選取，濾除在QC 中變異大的代謝特征，通常LC-MS分析中過(guò)濾閾值RSD為20%[13,15-16]。將3種不同溫度培養(yǎng)條件下樣品(分胞內(nèi)和胞外樣品共36個(gè))、3個(gè)空白樣本和17個(gè)混合質(zhì)控樣，共56個(gè)原始樣本數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)預(yù)處理后進(jìn)行主成分分析，結(jié)果見(jiàn)圖1A。由圖可見(jiàn)，17個(gè)質(zhì)控樣品較好地聚集在原點(diǎn)附近，圖1B總離子流圖中原始峰對(duì)齊效果也較好，未出現(xiàn)顯著的峰漂移，由圖1C可見(jiàn)保留時(shí)間變異在±0.08 s內(nèi)，以上數(shù)據(jù)表明儀器的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性較好。

2.2全組分分析溫度對(duì)黃曲霉菌生理及其產(chǎn)毒的影響

2.2.1溫度對(duì)黃曲霉菌生理代謝輪廓分析采用UHPLC-HRMS分別在正負(fù)離子模式下對(duì)樣本進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，在18、28、38 ℃培養(yǎng)條件下樣本分別用正負(fù)離子模式采集到總離子流圖(TIC)。從總離子流圖可以總體上觀察3個(gè)溫度下的樣品是否存在差異，但具體差異需進(jìn)一步提取分析。

2.2.2潛在差異代謝物篩選由圖2可見(jiàn)，質(zhì)荷比分布云圖可以對(duì)采集到的特征化合物質(zhì)量分布和出峰時(shí)間有直觀了解。在p≤0.01和差異表達(dá)倍數(shù)≥1.5情況下發(fā)現(xiàn)3 593個(gè)特征化合物，圖中包含p值可視化、定向差異表達(dá)倍數(shù)值和特征化合物質(zhì)荷比信息，且包含了每個(gè)樣本的總離子流圖和保留時(shí)間。圖中上半部分綠色部分代表化合物強(qiáng)度增強(qiáng)的組分，下半部分代表了化合物減弱的部分，氣泡的大小與特征值的差異表達(dá)倍數(shù)取log值后的大小相關(guān)，即氣泡大者，差異表達(dá)倍數(shù)取log值后也大。本研究中，特征化合物主要分布為出峰時(shí)間較早的極性化合物，質(zhì)量分布在100～600 Da左右，5～10 min出峰的中等極性化合物質(zhì)量分布在200～800 Da左右，10～18 min出峰的弱極性化合物質(zhì)量分布在200～1 000 Da。從氣泡大小可看出，大部分特征化合物的差異表達(dá)倍數(shù)(Fold change)值較大，表明篩選的特征化合物差異顯著。

圖2 黃曲霉菌數(shù)據(jù)集質(zhì)荷比分布云圖Fig.2 Cloud plot of aspergillus flavus data set

OrthoPLS-DA是一種有監(jiān)督的模式識(shí)別分析方法，與PCA相比，可在不降低模型預(yù)測(cè)能力的前提下，增強(qiáng)模型的解釋能力。本研究中，對(duì)18 ℃與28 ℃培養(yǎng)樣品進(jìn)行OrthoPLS-DA分析比較，得到該2個(gè)溫度下培養(yǎng)組的OrthoPLS-DA得分圖3A，同樣，38 ℃與28 ℃培養(yǎng)組的比較也經(jīng)過(guò)OrthoPLSDA分析，其得分圖見(jiàn)圖4A。從圖3A，4A可看出，這兩組都可以與28 ℃培養(yǎng)組明顯區(qū)分。R2Y、Q2分別代表模型OrthoPLS-DA的解釋能力和預(yù)測(cè)能力。本研究中18、28 ℃培養(yǎng)組模型的R2Y、Q2分別為0.98和0.96。28、38 ℃培養(yǎng)組模型的R2Y、Q2分別為0.99和0.92。說(shuō)明兩個(gè)模型都具有較高的解釋能力和預(yù)測(cè)能力，分類效果明顯。由于OrthoPLS-DA分析模型易出現(xiàn)過(guò)擬合，常采用如交叉檢驗(yàn)(Cross-validation)、置換檢驗(yàn)(Permutation test)或刀切法(Jackknife)來(lái)檢驗(yàn)?zāi)Ｐ褪欠襁^(guò)擬合。本研究采用200次置換檢驗(yàn)對(duì)模型進(jìn)行驗(yàn)證(圖5)。在置換檢驗(yàn)驗(yàn)證中，R2-intercept和Q2-intercept兩個(gè)參數(shù)用來(lái)檢驗(yàn)OrthoPLS模型是否過(guò)擬合，經(jīng)驗(yàn)表明，R2-intercept值不宜超過(guò)0.3～0.4，Q2-intercept不宜超過(guò)0.05。而對(duì)于OrthoPLS-DA模型是否過(guò)擬合，主要以Q2-intercept值為依據(jù)[18]。本研究中，18、28 ℃培養(yǎng)組置換檢驗(yàn)(Permutation test)得到的R2-intercept和Q2-intercept值分別為0.607和-0.818。28、38 ℃培養(yǎng)組置換檢驗(yàn)(Permutation test)得到的R2-intercept和Q2-intercept值分別為0.986和-0.252。從圖5可見(jiàn)，兩組中所有R2-intercept和Q2-intercept左邊的點(diǎn)均低于右邊的點(diǎn)，表明模型的預(yù)測(cè)能力大于任何一次隨機(jī)排列y變量的預(yù)測(cè)能力，回歸線的斜率也大于1，證明建立的兩個(gè)OrthoPLS-DA模型沒(méi)有出現(xiàn)過(guò)擬合。同時(shí)，對(duì)兩個(gè)OrthoPLS-DA模型進(jìn)行CV-ANOVA驗(yàn)證，p<0.001(分別為0.000 8和5.18×10-5),這說(shuō)明采用OrthoPLS-DA模型篩選本研究中的差異代謝物具有統(tǒng)計(jì)學(xué)依據(jù)，可繼續(xù)進(jìn)行后續(xù)差異代謝物篩選。

圖3 18 ℃和28 ℃培養(yǎng)組的OrthoPLS-DA分析得分圖(A)和差異化合物特征變量圖(S-plot)(B)Fig.3 OrthoPLS-DA score plot of 18 ℃group and 28 ℃group(A) and the plot of feature importance(S-plot)(B)

圖4 38 ℃和28 ℃培養(yǎng)組的OrthoPLS-DA分析得分圖(A)和差異化合物特征變量圖(S-plot)(B)
Fig.4 OrthoPLS-DA score plot of 38 ℃group and 28 ℃group(A) and the plot of feature importance(S-plot)(B)

圖5 18 ℃和28 ℃培養(yǎng)組(A)以及28 ℃和38 ℃培養(yǎng)組(B)的OrthoPLS-DA模型驗(yàn)證圖Fig.5 OrthoPLS-DA permutationtest model validation plot of 18 ℃group and 28 ℃group(A) and 28 ℃group and 38 ℃group(B)

2.2.3潛在差異代謝物鑒定對(duì)重要特征變量進(jìn)行選取，其中圖3B和4B圖中遠(yuǎn)離原點(diǎn)的化合物為差異顯著的潛在的差異代謝物，同時(shí)以有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變量(p<0.05)作為差異化合物判斷標(biāo)準(zhǔn),并通過(guò)MZcloud、Metlin和本地庫(kù)等數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜信息匹配及部分標(biāo)準(zhǔn)品驗(yàn)證，篩選出20個(gè)溫度影響黃曲霉菌生理代謝的潛在差異代謝物(表1)，其中纈氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、硬脂酸、油酸、曲酸、黃匹阿尼酸、3a,3a′-二聚吡咯吲哚生物堿、黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、氧甲基雜色曲霉毒素、降散盤衣酸、雜色曲菌素 B經(jīng)過(guò)標(biāo)品驗(yàn)證，對(duì)其相對(duì)含量進(jìn)行了比較分析(圖6)。

表1 溫度影響黃曲霉菌生理代謝的潛在差異代謝物Table 1 Potential biomarkers of physiological metabolism of aspergillus flavus affected by temperature

(續(xù)表1)

Potentialbiomarkerst/minFormulaMassDaAdductionsKEGGIDMetabolicpathwayVariationtendencyDitryptophenaline(3a，3a′?二聚吡咯吲哚生物堿)13 69C42H40N6O4693 31838[M+H]+-Ditryptophenalinebiosynthesis18<28<38AflatoxinB1(黃曲霉毒素B1)9 97C17H12O6313 07066[M+H]+C06800Aflatoxinbiosynthesis18<28>38AflatoxinB2(黃曲霉毒素B2)9 51C17H14O6315 08631[M+H]+C16753Aflatoxinbiosynthesis18<28>38O?Methylsterigmatocystin(氧甲基雜色曲霉毒素)13 54C19H14O6339 08631[M+H]+C03944Aflatoxinbiosynthesis18<28<38Norsolorinicacid(降散盤衣酸)17 60C20H18O7369 09797[M-H]-C20452Aflatoxinbiosynthesis18<28<38VersicolorinB(雜色曲菌素B)16 14C18H10O7337 03537[M-H]-C20583Aflatoxinbiosynthesis18<28<38

-：no data

圖6 3個(gè)溫度條件下20個(gè)潛在差異代謝物的相對(duì)含量比較Fig.6 The relative content comparison of 20 potential differential metabolites under the 18,28,38 ℃

2.2.4潛在差異代謝物的代謝通路分析利用MBROLE 2.0[19]對(duì)鑒定的潛在差異代謝物進(jìn)行代謝通路分析，結(jié)合表1和圖6A、B、C可看出，各潛在差異代謝物變化趨勢(shì)如下：18 ℃相較于28 ℃組，三羧酸循環(huán)中的蘋果酸、檸檬酸，脂肪酸生物合成中的軟脂酸(Palmitic acid)和硬脂酸(Stearic acid)，油酸(Oleic acid)和亞油酸(Linoleic acid)，纈氨酸(Valine)，亮氨酸(Leucine)，苯丙氨酸(Phenylalanine)，色氨酸(Tryptophan)，絡(luò)氨酸(Tyrosine)下調(diào)。其中色氨酸是必需氨基酸,在生物體中起著至關(guān)重要的作用,在能量代謝中是蛋白質(zhì)合成或分解的中間體。這些化合物的下調(diào)說(shuō)明低溫抑制了黃曲霉菌的能量代謝，同時(shí)也降低了對(duì)黃曲霉毒素合成[20]提供乙酰輔酶A等前體化合物反應(yīng)原料供應(yīng)。從圖6D、E可以發(fā)現(xiàn)，低溫顯著下調(diào)了黃曲霉毒素B1、B2、黃匹阿尼酸、曲酸、3a,3a′-二聚吡咯吲哚生物堿等次生代謝物。黃匹阿尼酸的生物合成[21]前體物質(zhì)包括色氨酸，而色氨酸的下調(diào)導(dǎo)致黃匹阿尼酸的合成下調(diào)。此外，經(jīng)過(guò)標(biāo)品鑒定的黃曲霉毒素生物合成路徑上的前體物質(zhì)降散盤衣酸、雜色曲菌素 B在低溫18 ℃下都實(shí)現(xiàn)了下調(diào)，但并未完成阻斷。推測(cè)原因如下：低溫(18 ℃)降低了黃曲霉毒素生物合成路徑上的合成酶活性；低溫(18 ℃)使黃曲霉菌三羧酸循環(huán)，脂肪酸合成，必須氨基酸等與能量代謝路徑有關(guān)的化合物下調(diào)，而能量代謝可產(chǎn)生乙酰輔酶A，該化合物才可進(jìn)一步合成丙二酰輔酶A和黃曲霉毒素生物合成路徑上的首個(gè)穩(wěn)定的前體物質(zhì)降散盤衣酸。從圖6C可見(jiàn)，高溫38 ℃相比于28 ℃培養(yǎng)條件，黃曲霉初生代謝三羧酸循環(huán)中的蘋果酸、檸檬酸、琥珀酸相繼下調(diào)，但下調(diào)幅度較18 ℃和28 ℃組小。說(shuō)明高溫稍微抑制了黃曲霉菌的呼吸代謝，降低了為黃曲霉毒素生物合成前體原料。從圖6A、B、C可見(jiàn)，纈氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、絡(luò)氨酸代謝，脂肪酸生物合成中的軟脂酸和硬脂酸，油酸和亞油酸，碳代謝中的山梨醇、木糖醇相繼上調(diào)。說(shuō)明溫度的升高提升了黃曲霉菌碳代謝、脂肪生物合成等路徑中酶活性，溫度促進(jìn)了這些代謝中的酶促反應(yīng)，從而使黃曲霉生成更多的脂質(zhì)并進(jìn)行生物質(zhì)積累，這與Elmer[22]等的研究結(jié)果相似。在次生代謝方面，從圖6D、E可見(jiàn)，升溫使黃匹阿尼酸出現(xiàn)上調(diào)，3a,3a′-二聚吡咯吲哚生物堿也出現(xiàn)上調(diào)，曲酸和黃曲霉毒素B1,B2在38 ℃出現(xiàn)顯著下調(diào)，但前體化合物降散盤衣酸、雜色曲菌素B、氧甲基雜色曲霉素卻上調(diào)，原因可能是：38 ℃條件下抑制了黃曲霉毒素合成路徑上從氧甲基雜色曲霉毒素轉(zhuǎn)化到黃曲霉毒素的酶的活性。特別地，溫度調(diào)控黃曲霉毒素和黃匹阿尼酸的生物合成的結(jié)果與Yu等[23]轉(zhuǎn)錄組研究結(jié)果相吻合，高溫使黃曲霉毒素的重要調(diào)控因子AflR和AflS出現(xiàn)下調(diào)，從而使黃曲霉毒素的合成量降低?？偠灾瑴囟日{(diào)控了三羧酸循環(huán)、脂肪酸等初生代謝途徑，并影響黃曲霉毒素、黃匹阿尼酸、曲酸等次生代謝物生物合成路徑酶活性。這一研究結(jié)果從代謝水平上對(duì)影響黃曲霉菌生長(zhǎng)和產(chǎn)毒的重要非生物因子——溫度如何調(diào)控黃曲霉菌生長(zhǎng)和產(chǎn)毒素機(jī)制有了更深的理解。

3 結(jié) 論

本研究利用非靶標(biāo)代謝組方法研究了18、28、38 ℃ 3個(gè)溫度條件對(duì)黃曲霉菌生理代謝機(jī)制的影響。共鑒定出20個(gè)溫度顯著調(diào)控黃曲霉菌生理代謝的潛在差異代謝物，發(fā)現(xiàn)溫度主要影響三羧酸循環(huán)、脂肪酸生物合成、糖代謝和氨基酸代謝等能量代謝通路以及黃曲霉毒素、曲酸、黃匹阿尼酸、3a,3a′-二聚吡咯吲哚生物堿等次生代謝通路。表明溫度通過(guò)影響上述代謝通路調(diào)控黃曲霉菌的生長(zhǎng)和產(chǎn)生黃曲霉毒素、曲酸、黃匹阿尼酸等次生代謝物。這些差異代謝物為黃曲霉毒素風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估研究提供了候選參考目標(biāo)，為黃曲霉毒素分子預(yù)警提供了新的分析方法。

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Study on Effects of Temperature on Metabolism of Aspergillus Flavus Based on Untargeted Metabolomics

XIE Hua-li1,2,3,4,LI Pei-wu1,2,3,4,5*,WANG Xiu-pin1,3,4,5*,ZHANG Qi1,2,3,4,ZHANG Liang-xiao1,3,4,5,WANG Tong1,2,3，ZHANG Wen1,2,3,5,WANG Xue-fang1,2,3,5

(1.Oil Crops Research Institute of the Chinese Academy of Agricultural Science,Wuhan 430062,China;2.Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Oil Crops,Wuhan 430062,China;3.Ministry of Agriculture,Key Laboratory of Detection for Mycotoxins,Wuhan 430062,China;4.Ministry of Agriculture,Laboratory of Risk Assessment for Oilseeds Products,Wuhan 430062,China;5.Ministry of Agriculture,Quality Inspection and Test Center for Oilseeds Products,Ministry of Agriculture,Wuhan 430062,China )

A method of non-targeted metabolomics coupled to ultra-high performance liquid chromatography- high resolution mass spectrometry was used to investigating effect of temperature on the metabolism of aspergillus flavus. Multivariate statistical analysis on the metabolomics data was carried out by using chemometric methods of OrthoPLS-DA(alternative partial least squares discriminant analysis) etc. The metabolism characteristics of aspergillus flavus were identified by MS/MS and library searching. In the study,the non-targeted metabolomics analytical method was validated by using internal standard and pooled quality control samples. The method was applied to investigate the effect of temperature on the metabolome of aspergillus flavus,and 3 593(T-test,p<0.01) differential metabolites were found under different temperature conditions. Twenty candidate biomarkers were screened out. The results showed that temperature significantly affected the biosynthetic pathways of tricarboxylic acid cycle,fatty acid,phenylalanine,tryptophan and tyrosine,and regulated the secondary metabolites biosynthetic pathway enzymesactivity of aflatoxin,cyclopiazonic acid and kojic acid. This study provide a new insight for risk assessment and early warning research of aflatoxin in China.

aspergillus flavus；metabolomics；high-resolution mass spectrum；aflatoxins biosynthesis；temperature

2017-02-08；

2017-08-17

國(guó)家自然科學(xué)基金(31640062)；國(guó)家農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估重大項(xiàng)目；國(guó)家糧食行業(yè)科研專項(xiàng)(201513006)

*

李培武,研究員，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量與食物安全，Tel:027-86812943，E-mail:peiwuli@oilcrops.cn 王秀嬪,副研究員，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)技術(shù)，E-mail:xiupinwang@163.com

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.11.003

O657.63

A

1004-4957(2017)11-1304-09