飼用優(yōu)良乳酸菌鑒定及生物學(xué)特性研究

李 肖，李海洋，房艷華，來航線，韋小敏，婁 義

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 資源環(huán)境學(xué)院，陜西楊凌 712100)

飼用優(yōu)良乳酸菌鑒定及生物學(xué)特性研究

李 肖，李海洋，房艷華，來航線，韋小敏，婁 義

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 資源環(huán)境學(xué)院，陜西楊凌 712100)

對9株供試乳酸菌產(chǎn)酸產(chǎn)氣、生長速率、產(chǎn)酸速率等方面篩選既能用于微生態(tài)制劑又能用于青貯飼料發(fā)酵劑的優(yōu)良乳酸菌；并從細菌形態(tài)學(xué)、生理生化特征和16S rDNA基因序列分析對其進行鑒定；同時進一步研究乳酸菌對溫度、鹽濃度和強酸強堿的耐受性、有機酸組分和藥物敏感性等生物學(xué)特性。試驗篩選出植物乳桿菌R02(Lactobacillusplantarum)、糞腸球菌R07(Enterococcusfaecalis)和戊糖片球菌R09(Pediococcuspentosaceus)3株優(yōu)良乳酸菌。其中菌株R09生長最快，產(chǎn)酸能力最強，乳酸占總酸含量最高，達95.45%，可耐受0.12 g/mL NaCl；R02對溫度的耐受性最強，可耐受55 ℃高溫；R07對強酸強堿環(huán)境有較強的耐受能力，在pH為3.0～9.5的條件下均可生長。菌株R02、R07、R09均具有生長快、產(chǎn)酸和耐受能力強的優(yōu)良生物學(xué)特性，因此具有應(yīng)用于微生態(tài)制劑和青貯飼料的潛能。

青貯飼料；微生態(tài)制劑；乳酸菌；耐受性；藥敏性

近年來，抗生素、激素、防腐劑等藥物性飼料添加劑在動物飼養(yǎng)中過度使用，導(dǎo)致動物腸胃正常菌群失調(diào)，動物免疫力、抗病力下降，產(chǎn)生耐藥性和藥物殘留等問題，給畜禽和人類健康帶來極大的危害[1]。乳酸菌類微生態(tài)制劑具有維持腸道菌群的微生態(tài)平衡、提高營養(yǎng)利用率、促進營養(yǎng)物質(zhì)的吸收、抑制致病菌侵害、增強肌體免疫功能等功效，是飼用微生態(tài)制劑中是應(yīng)用最為廣泛和效果較好的一類[2-4]。目前，國內(nèi)外對乳酸菌的分離鑒定試驗報道較多，已廣泛應(yīng)用于飼料工業(yè)和青貯發(fā)酵劑產(chǎn)品中[5-7]，但目前市場上所售菌劑的活菌數(shù)、產(chǎn)品有效組成和作用效果的穩(wěn)定性都存在很多問題，國內(nèi)研究人員大多對乳酸菌在青貯發(fā)酵過程中發(fā)揮的作用進行探討[4]，但其機理機制還有待進一步深入探究。篩選出能夠旺盛繁殖、以乳酸為單一發(fā)酵產(chǎn)物，對環(huán)境條件有良好耐受能力的乳酸菌是益生菌研究的關(guān)鍵問題，決定著乳酸菌類發(fā)酵劑的使用效果[8]。

本研究以近年來西北農(nóng)林科技大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院微生物生態(tài)研究室保存的9株乳酸菌為供試菌株，從發(fā)酵類型(產(chǎn)酸產(chǎn)氣特性)、生長速率、產(chǎn)酸速率等方面篩選優(yōu)良乳酸菌，通過形態(tài)學(xué)、生理生化和分子生物學(xué)方法對其進行鑒定，并對乳酸菌的耐酸耐堿性、有機酸組分和藥物敏感性等生物學(xué)特性進行研究。篩選出具有應(yīng)用于微生態(tài)制劑和青貯飼料潛能的優(yōu)良乳酸菌，為開發(fā)相應(yīng)產(chǎn)品提供理論基礎(chǔ)和優(yōu)良的出發(fā)菌株。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試菌株 供試9株乳酸菌Lactobacilluscasei(R01)、Lactobacillusplantarum(R02)、Lactobacillusfermentum(R03)、Lactobacillusparaplantarum(R04)、Lactobacilluspentosus(R05)、Enterococcusdurans(R06)、Enterococcusfaecalis(R07)、Lactobacillusbuchneri(R08)、Pediococcuspentosaceus(R09)(CGMCC12487)均為西北農(nóng)林科技大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院微生物生態(tài)研究室多年分離并保存的菌株。

1.1.2 培養(yǎng)基[9]MRS瓊脂培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g、酵母膏5.0 g、牛肉膏10.0 g、葡萄糖20.0 g、乙酸鈉5.0 g、檸檬酸氫二銨2.0 g、磷酸氫二鉀2.0 g、硫酸鎂0.58 g、硫酸錳0.05 g、吐溫801.0 mL、瓊脂20.0 g、蒸餾水1 000 mL。

SL培養(yǎng)基：酪蛋白水解物10 g、酵母提取物5 g、檸檬酸二銨2 g、乙酸鈉25 g、硫酸鎂0.58 g、瓊脂15 g、葡萄糖20 g、吐溫801.0 mL、磷酸氫二鉀6 g、硫酸亞鐵 0.03 g、硫酸錳 0.15 g、蒸餾水1 000 mL。

PY基礎(chǔ)培養(yǎng)基：蛋白胨0.5 g，酵母提取物1.0 g，胰酶解酪胨0.5 g，鹽溶液4.0 mL，蒸餾水1 000 mL。

鹽溶液成分：氯化鈣0.2 g，硫酸鎂0.48 g，磷酸氫二鉀1.0 g，磷酸二氫鉀1.0 g，碳酸氫鈉10.0 g，氯化鈉2.0 g，蒸餾水1 000 mL。

1.2 方 法

1.2.1 乳酸菌的純化[9]以含有20 g/L CaCO3的SL培養(yǎng)基和MRS瓊脂培養(yǎng)基，采用平板稀釋法進行培養(yǎng)、純化，觀察其菌落和個體形態(tài)。接種到MRS斜面培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫微好氧條件下培養(yǎng)48 h后置于4 ℃冰箱中保存，備用。

1.2.2 優(yōu)良乳酸菌的篩選 葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣實驗[10]： PY基礎(chǔ)培養(yǎng)基內(nèi)加入30 g/L葡萄糖和0.5 mL/L吐溫80以16 g/L質(zhì)量濃度的溴甲酚紫作指示劑，分裝至試管，在試管內(nèi)倒置一杜氏試管，121 ℃滅菌20～30 min，接菌后置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。

產(chǎn)酸速率[11]：按1×107mL-1的接種量將供試的產(chǎn)酸不產(chǎn)氣同型發(fā)酵乳酸菌接入100 mL pH為6.5的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)。每2 h采用DELTA - 320 pH計測定各菌株發(fā)酵液的pH，繪制各發(fā)酵時間段所對應(yīng)的發(fā)酵液pH的變化曲線，即為產(chǎn)酸速率曲線。

生長曲線[11]： 按1×107mL-1的接種量將供試的同型發(fā)酵乳酸菌接入100 mL MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)36 h。每2 h取樣1次，以不接菌為對照，采用菌落平板計數(shù)法測定樣品的活菌數(shù)，以培養(yǎng)時間為橫坐標，相對應(yīng)的活菌數(shù)為縱坐標，繪制乳酸菌生長曲線。

1.2.3 優(yōu)良乳酸菌的鑒定[9]形態(tài)學(xué)鑒定：將菌株分別涂布在MRS固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)1～2 d，觀察菌落特征，革蘭氏染色和菌體形態(tài)參照程麗娟等[10]的方法。

生理生化鑒定：石蕊牛奶、淀粉水解、精氨酸水解、精氨酸產(chǎn)氨、明膠液化、產(chǎn)硫化氫、馬尿酸鹽水解、葡聚糖產(chǎn)生、V-P試驗以及菌株對D-果糖、葡萄糖、D(+)麥芽糖、D(+)甘露糖、D-甘露醇、蔗糖、木糖等二十種碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)酸試驗參照凌代文等[9]的方法。

16S rDNA序列分析：供試乳酸菌基因組DNA的提取及PCR擴增16S rDNA參照凌代文等[9]的方法。

PCR擴增使用的引物對為：

PA：5′-CCGTCGACGAGCTCAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′

PB：5′-CCCGGGTACCAAGCTTAAGGTGATCCAGCCGCA-3′

16S rDNA序列同源比對及進化樹的構(gòu)建參照李麗[12]的方法。

1.2.4 優(yōu)良乳酸菌生物學(xué)特性研究 耐受性試驗[13]：將活化的乳酸菌按φ=6%接種量接入MRS液體培養(yǎng)基后分別置于4、10、20、28、37、45、55 ℃培養(yǎng)24 h，采用菌落平板計數(shù)法測定各組菌液的活菌數(shù)，進行溫度耐受性分析；用無菌HCl和NaOH調(diào)節(jié)MRS液體培養(yǎng)基pH至3.0、4.0、5.0、6.5、8.0、9.0、9.5，接種培養(yǎng)24 h，測定各組菌液的活菌數(shù)，進行酸堿耐受性分析；用NaCl調(diào)節(jié)MRS液體培養(yǎng)基的鹽質(zhì)量濃度為0、0.015、0.03、0.04、0.065、0.08、0.12 g/mL接種培養(yǎng)24 h，測定各組菌液的活菌數(shù)，進行耐鹽性分析。

有機酸測定[14]：通過高效液相色譜法進行乳酸菌發(fā)酵液產(chǎn)酸組分的測定。將3株乳酸菌的發(fā)酵液在3 000 r/min離心30 min，將上清液經(jīng)0.45 μm 的微孔濾膜過濾后，測定乳酸、乙酸、丙酸和丁酸的質(zhì)量分數(shù)。流動相為w=0.5%(NH4)2HPO4(用磷酸調(diào)pH為2.55)，流速為2 mL/min；色譜柱為C18，柱溫35 ℃，檢測波長UV 214 nm。

藥敏性試驗[15]：挑取少許R02、R07和R09制成菌懸液，均勻涂布于MRS平板培養(yǎng)基上，將四環(huán)素、氯霉素、紅霉素、復(fù)方新諾明、先鋒噻肟、氟哌酸、氟嗪酸、痢特靈、鏈霉素、卡那霉素、慶大霉素、萬古霉素、氨芐青霉素、青霉素 G、先鋒 V 和利福平共16種藥敏片置于平板上，同時設(shè)置生長對照和標準菌株的陽性對照，35 ℃培養(yǎng)24 h，觀察并記錄抑菌圈大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 優(yōu)良乳酸菌的篩選

2.1.1 葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)酸產(chǎn)氣分析 以R01、R02、R03、R04、R05、R06、R07、R08、R09為供試菌株，進行葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)酸產(chǎn)氣分析，培養(yǎng)基的顏色由紫色變?yōu)辄S色表示產(chǎn)酸，由顏色深淺可判斷菌株產(chǎn)酸能力的強弱，結(jié)果見表1。測定結(jié)果顯示9株菌株均產(chǎn)酸，但產(chǎn)酸能力差異較大，R02、R03、R05、R07、R09產(chǎn)酸能力較強，R01、R04、R08次之，R06較差。菌株R03、R04、R05在產(chǎn)酸的同時，培養(yǎng)基中杜氏試管頂端出現(xiàn)氣泡，表明其產(chǎn)氣，為異型發(fā)酵乳酸菌，其他菌株產(chǎn)酸的同時未產(chǎn)氣，為同型發(fā)酵乳酸菌。

表1 供試菌株發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣Table 1 The results of acid and gas production from glucose fermented by the tested strains

注：“-”表示不能夠產(chǎn)酸或產(chǎn)氣；“+” “++” “ +++” 表示產(chǎn)酸或產(chǎn)氣能力依次增強。

Note：“-”denotes no acid or gas production; “+” “++” “+++”denotes the ability of acid or gas production enhanced gradully.

2.1.2 生長曲線及產(chǎn)酸速率曲線 選取產(chǎn)酸能力強的同型發(fā)酵乳酸菌(R01、R02、R07、R08、R09)進行生長速率和產(chǎn)酸速率測定，其生長曲線和產(chǎn)酸速率曲線分別見圖1和圖2。由圖1可知，5株乳酸菌生長均呈現(xiàn)標準的S型曲線，菌株生長包括適應(yīng)期、對數(shù)期和穩(wěn)定期。菌株R01、R07和R09的適應(yīng)期較長，曲線較平緩，6 h以后進入對數(shù)期，菌株R02和R08的適應(yīng)期較短，且在適應(yīng)期內(nèi)有緩慢的生長；菌株R02和R09的對數(shù)期最短，菌體迅速繁殖，16 h以后進入穩(wěn)定期，菌株R01和R07在對數(shù)期菌體生長速率較R02和R09緩慢，20 h以后進入穩(wěn)定期，菌株R01在穩(wěn)定期菌數(shù)量較低，R08對數(shù)期最長，且生長緩慢。結(jié)果表明，R02、R07和R09 3株菌生長性能較好。

圖1 同型發(fā)酵乳酸菌的生長曲線Fig.1 Growth curve of homo-fermentative lactobacillus

由圖2可以看出，各菌株在培養(yǎng)過程中pH的變化規(guī)律基本一致，pH都呈現(xiàn)先穩(wěn)定后下降再穩(wěn)定的趨勢。結(jié)合生長曲線的測定結(jié)果，乳酸菌處于適應(yīng)期時，培養(yǎng)基中pH變化基本保持穩(wěn)定；當生長進入對數(shù)期，菌體大量繁殖，pH呈現(xiàn)迅速下降的趨勢；生長進入穩(wěn)定期時，代謝減慢，pH又趨于穩(wěn)定。雖然各個菌株在培養(yǎng)期間，pH都明顯下降，但菌株的產(chǎn)酸速率和能力存在明顯差異。R02和R07在對數(shù)生長期時pH下降速度最快，R01和R09次之，R08下降速度緩慢。由圖2可知，R02和R07產(chǎn)酸速率快，且pH下降幅度最大，R01和R09次之。

綜合同型發(fā)酵乳酸菌的生長曲線和產(chǎn)酸速率的結(jié)果得出：R02、R07和R09 3株菌生長性能和產(chǎn)酸能力均較好，可用于后續(xù)研究及應(yīng)用。

圖2 同型發(fā)酵乳酸菌的產(chǎn)酸速率Fig.2 Rate of acid production of homo-fermentative lactobacillus

2.2 優(yōu)良乳酸菌的鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定 篩選獲得的3株優(yōu)良乳酸菌在MRS平板培養(yǎng)的菌落特征和菌體的形態(tài)特征見圖3及表2。3株菌均為革蘭氏陽性、接觸酶陰性的同型發(fā)酵乳酸菌，菌株R02為桿狀菌，菌株R07和R09為球狀菌。

2.2.2 生理生化鑒定結(jié)果 對篩選出的3株無芽孢、革蘭氏陽性、接觸酶陰性乳酸菌R02、R07和R09進行碳源利用方式及生理生化指標鑒定，結(jié)果見表3。 R02、R07和R09菌株均不具備水解淀粉、還原硝酸鹽和產(chǎn)生H2S的能力，無運動性，耐酸性能好。依據(jù)形態(tài)和培養(yǎng)特征，結(jié)合菌株對碳源的利用方式，初步判斷R02屬于乳桿菌屬， R07屬于鏈球菌屬，R09屬于片球菌屬。

圖3 R02、R07和R09的革蘭氏染色及菌落形態(tài)照片F(xiàn)ig.3 Gram staining and colony morphology of R02, R07 and R09 strains

表2 R02、R07和R09的特性Table 2 Characteristics of R02, R07 and R09 strains

2.2.3 分子生物學(xué)鑒定 經(jīng)16S rDNA序列同源比對構(gòu)建的進化樹見圖4。R02與植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)親緣關(guān)系最近，R07與糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)親源關(guān)系最近，R09與戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)親緣關(guān)系最近。因此，結(jié)合3株菌的形態(tài)特征、生理生化和16S rDNA比對結(jié)果鑒定R02為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)；R07為糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)；R09為戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)。

2.3 優(yōu)良乳酸菌生物學(xué)特性研究

2.3.1 耐受性試驗結(jié)果 由圖5可知，3株菌的最適培養(yǎng)溫度均為37 ℃，R02菌株對低溫和高溫均有較強的耐受能力，在培養(yǎng)溫度達到55 ℃時仍可生長，R07和R09菌株對溫度較為敏感，溫度高于45 ℃時菌株生長微弱。由圖6可知，各菌株的生長隨著NaCl質(zhì)量濃度的增高而減弱，R09菌株在NaCl質(zhì)量濃度0.12 g/mL時仍可良好生長，說明R09菌株具有很強的耐鹽能力，R02和R07次之，其在NaCl質(zhì)量濃度高于0.03 g/mL后生長性能顯著減弱。由圖7可知，pH對乳酸菌的影響較大，各菌株在pH為6.5時菌數(shù)最大，為各菌株的最佳培養(yǎng)條件。R09菌株在pH為9時生長較好，說明R09對強堿環(huán)境有一定的耐受能力，R02和R07次之。

2.3.2 有機酸組分測定 通過高效液相色譜儀對乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)酸情況進行酸組分分析，結(jié)果見表4。3菌株經(jīng)液體發(fā)酵后均產(chǎn)生乳酸和少量丙酸，無乙酸和丁酸產(chǎn)生，3株菌產(chǎn)乳酸均超過85%，其中R09和R02達95%以上。說明R02、R07和R09這3株菌在生產(chǎn)上具有良好的潛能。

表3 R02、R07和R09的生理生化鑒定結(jié)果Table 3 The physiological and biochemical characteristics result of R02, R07 and R09 strains

注：+ 表示結(jié)果呈陽性；++ 表示結(jié)果呈較強陽性；+++ 表示結(jié)果呈強陽性；- 表示結(jié)果呈陰性。

Note：+ denotes positive, ++ denotes stronger positive；+++ denotes strongest positive;- denotes negative.

圖4 菌株R02、R07和R09的系統(tǒng)進化樹Fig.4 Evolutionary tree of R02, R07 and R09 strains

不同字母表示差異顯著(Plt;0.05)。下同。

The different letter in the same column are significantly different(Plt;0.05).The same below.

圖5不同溫度下培養(yǎng)乳酸菌24h后的活菌數(shù)
Fig.5Viablebacterialcellcountoflactobacillusculturedatdifferenttemperaturefor24h

圖6 不同NaCl質(zhì)量濃度培養(yǎng)乳酸 菌24 h后的活菌數(shù)Fig.6 Viable bacterial cell count of lactobacillus cultured at different NaCl mass concentration for 24 h

2.3.3 耐藥性試驗結(jié)果分析 采用紙片擴散法進行試驗，結(jié)果以美國 NCCLS 文件為判斷標準(表5)。

圖7 不同pH培養(yǎng)乳酸菌24 h后的活菌數(shù)Fig.7 Viable bacterial cell count of lactobacillus cultured at different pH values for 24 h

從表 5可以看出，在對抗生素類、氟喹諾酮類、磺胺類、呋喃類、喹惡啉類等5類抗菌藥物的藥敏性試驗中，3株菌對大多數(shù)藥物具有較強的耐受性，其中菌株R09對所有抗菌藥物都具有很強的耐藥性，菌株R07僅對四環(huán)素、氯霉素、萬古霉素、氨芐青霉素、先鋒V和利福平6種藥物敏感，R02菌株的耐藥性相對較弱，因此在用于動物防病治病時應(yīng)注意避免將R02和R07菌株與少數(shù)敏感性抗生素同時使用。

3 討 論

目前，國內(nèi)外對乳酸菌作為青貯飼料發(fā)酵劑或微生態(tài)制劑的研究非常廣泛[16-20]，但對于高效穩(wěn)定的乳酸菌菌株的篩選和研究仍十分迫切。本試驗從生長性能、產(chǎn)酸性能和耐受性等方面出發(fā)，共篩選獲得3株同型發(fā)酵乳酸菌。與傳統(tǒng)的鑒定手段相比，本研究先從形態(tài)學(xué)特征和生理生化特性出發(fā)，對3株菌做初步鑒定，然后通過16S rDNA 序列分析方法進一步鑒定，提高了鑒定的準確率。結(jié)果表明，R02為植物乳桿菌，R07為糞腸球菌，R09為戊糖片球菌。

表4 有機酸質(zhì)量分數(shù)Table 4 Mass fraction of organic acids

注：不同字母表示差異顯著(Plt;0.05)。

Note：The different letter in the same column are significantly different(Plt;0.05).

表5 R02、R07和R09的藥敏性試驗結(jié)果Table 5 The result of antibiotic susceptibility test of R02, R07 and R09 strains

注：R表示耐藥；I表示中敏感；S表示敏感。

Note：R denotes resistance; I denotes intermediary ; S denotes sensitive.

乳酸菌作為微生態(tài)制劑以及飼料發(fā)酵劑直接作用于動物腸道，能產(chǎn)生大量有機酸類物質(zhì)，并可在動物腸道中形成一層菌膜，有效地抵抗病毒和病原微生物的侵襲，增強生物體對疾病的抵抗力[17-18]，可部分替代抗生素在畜牧業(yè)養(yǎng)殖中的使用。乳酸菌對溫度、pH值和鹽濃度的耐受性有效抑制了微生態(tài)制劑生產(chǎn)過程中活菌量的降低，也提高了乳酸菌進入動物腸道的定植能力；對抗菌藥物的耐受性能夠增強機體的免疫機能、防病治病、提高生產(chǎn)效益。本試驗研究結(jié)果表明，3株菌對溫度、pH和鹽濃度都具有較強的耐受能力，其中，R09可耐受0.12 g/mL的NaCl；R02可耐受55 ℃的高溫環(huán)境；R07在pH為3.0～9.5的條件下均可生長。另外，在對常用抗生素的耐受性方面，菌株R02和R07對抗菌藥物表現(xiàn)出較強的耐受性，而R09表現(xiàn)出極強的耐藥性，為微生態(tài)制劑開發(fā)提供優(yōu)良的菌株。

在青貯飼料的發(fā)酵過程中應(yīng)用乳酸菌發(fā)酵劑可以迅速降低青貯物料的pH至3.8～4.2，抑制有害菌的生長，提高乳酸/乙酸的比例及飼料適口性，降低蛋白質(zhì)的分解率，提高干物質(zhì)的回收率，從而實現(xiàn)長期保存飼料及其營養(yǎng)物質(zhì)的目的[19-22]。用于青貯發(fā)酵的乳酸菌應(yīng)具有均一的發(fā)酵途徑，可快速發(fā)酵乳糖產(chǎn)生大量乳酸，因此作為飼料添加劑的乳酸菌的產(chǎn)酸能力、產(chǎn)酸速度以及產(chǎn)乳酸的比例直接影響青貯品質(zhì)。3株乳酸菌發(fā)酵24 h后的pH分別為3.62、3.63和3.77，且乳酸質(zhì)量分數(shù)均超過85%，其中菌株R02和R09的乳酸質(zhì)量分數(shù)超過95%，因此，3株菌均具有青貯的潛能。

綜上，本試驗篩選出3株優(yōu)良的同型發(fā)酵乳酸菌，均具有良好的產(chǎn)酸能力和抗逆性，并對常用抗菌藥物有很強的耐受能力和良好的生物學(xué)特性，為青貯飼料發(fā)酵劑和微生態(tài)制劑的制備提供優(yōu)良的出發(fā)菌株。

Reference：

[1] 田 木.益生菌復(fù)合微生態(tài)制劑的制備工藝及免疫功能研究[D].長春:吉林大學(xué),2015.

TIAN M.The research on processing technology and immunity function of composite probiotics[D].Changchun:Jilin University,2015(in Chinese with English abstract).

[2] 何明清,倪學(xué)勤.我國動物微生態(tài)制劑研究、開發(fā)和應(yīng)用動態(tài)[J].飼料廣角,2002(21):1-7，39.

HE M Q,NI X Q.Research,development and application of the animal probiotics in China[J].FeedChina,2002(21):1-7，39(in Chinese).

[3] 李新波.飼用乳酸菌制劑研究概述[J].飼料研究,2012,5(3):5-7，20.

LI X B.Overview of research onLactobacilluspreparation for feed [J].FeedResearch,2012,5(3):5-7,20(in Chinese).

[4] 黃滄海,譙仕彥,李德發(fā).飼用發(fā)酵乳酸桿菌(Lactobacillusfermentum)生物學(xué)特性的研究[J].江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2004,26(4):596-600.

HUANG C H,QIAO SH Y,LI D F.Study on the biological characteristics ofLactobacillusfermentum[J].ActaAgriculturaeUniversitisJiangxiensis,2004,26(4):596-600(in Chinese).

[5] 時建青,徐紅蕊,艾尼瓦爾·艾山.青貯飼料添加劑及其研究應(yīng)用現(xiàn)狀[J].現(xiàn)代畜牧獸醫(yī),2005(12):22-23.

SHI J Q,XU H R,Ainiwaer Aishan.Silage additives and their research and application[J].JournalofAnimalHusbandryandVeterinaryMedicine,2005(12):22-23(in Chinese).

[6] WEINBERG Z G,CHEN Y,GAMBURG M.The passage of lactic acid bacteria from silage into rumen fluid,in vitro studies[J].JournalDairyScience,2004,87(10):3386-3397.

[7] CAI Y M,KUMAI S,OGAWA M,etal.Characterization and identification of pediococcus species isolated from forage crops and their application for silage preparation[J].AppliedandEnvironmentalMicrobiology,1999,65(7):2901- 2906.

[8] 侯霞霞,來航線,韋小敏.青貯用乳酸菌的篩選及其生物學(xué)特性研究[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2015,43(1):183-192.

HOU X X,LAI H X,WEI X M.Screening of lactic acid bacteria strains and their biological characteristics[J].JournalofNorthwestAamp;FUniversity(NaturalScienceEdition),2015,43(1):183-192(in Chinese with English abstract).

[9] 凌代文,東秀珠.乳酸細菌分類鑒定及實驗方法[M].北京:中國輕工業(yè)出版社,1999.

LING D W,DONG X ZH.Classification,Identification and Experimental Methods of Lactic Acid Bacteria[M].Beijing:China Light Industry Press,1999(in Chinese).

[10] 程麗娟,薛泉宏,來航線,等.微生物學(xué)實驗技術(shù)[M].西安:世界圖書出版公司,2012.

CHENG L J,XUE Q H,LAI H X,etal.Laboratory Manual of Microbiology[M].Xi’an:World Publishing Corporation,2012(in Chinese).

[11] 崔棹茗,郭 剛,原現(xiàn)軍,等.青稞秸稈青貯飼料中優(yōu)良乳酸菌的篩選及鑒定[J].草地學(xué)報,2015,23(3):607-615.

CUI ZH M,GUO G,YUAN X J,etal.Characterization and identification of high quality lactic acid bacteria from hulless barley straw silage[J].ActaAgrestiaSinica,2015,23(3):607-615(in Chinese with English abstract).

[12] 李 麗.鹽堿環(huán)境中放線菌多相分類及免培養(yǎng)研究[D]. 陜西楊凌:西北農(nóng)林科技大學(xué),2006.

LI L.Studies on polyphasic taxonomy and culture independent method of actinomycetes in saline environments[D].Yingling Shaanxi:Northwest Aamp;F University,2006(in Chinese with English abstract).

[13] CAI Y,SUYANANDANA P,SAMAN P,etal.Classification and characterization of lactic acid bacteria isolated from the intestines of common carp and freshwater prawns[J].JournalofGeneralandAppliedMicrobiology,1999,45(4):177- 184.

[14] 劉晨明,曹宏斌,曹俊雅,等.梯度洗脫高效液相色譜法快速檢測厭氧菌代謝物中的有機酸[J].分析化學(xué),2006,34(9):1231-1234.

LIU CH M,CAO H B,CAO J Y,etal.Rapid determination of organic acids in anaerobic metabolites by gradient elution high performance liquid chromatography[J].ChineseJournalofAnalyticalChemistry,2006,34(9):1231-1234(in Chinese).

[15] 封 曄.飼用微生態(tài)制劑優(yōu)良菌株鑒定及發(fā)酵工藝研究[D].陜西楊凌:西北農(nóng)林科技大學(xué),2007.

FENG Y.The idengtify of superior strains as animal microbiological agent and study on fermentation condition[D].Yingling Shaanxi:Northwest Aamp;F University,2007(in Chinese with English abstract).

[16] YANG J S,TAN H S,CAI Y M.Characteristics of lactic acid bacteria isolates and their effect on silage fermentation of fruit residues[J].JournalofDairyScience,2016,99(7):5325-5334.

[17] 楊汝德,陳 瓊,陳惠音.乳酸菌發(fā)酵制品研究的現(xiàn)狀與發(fā)展[J].廣州食品工業(yè)科技,2003,19(S1):79-83.

YANG R D,CHEN Q,CHEN H Y.Present situation and development of fermentation products of lactic acid bacteria[J].GuangzhouFoodScienceandTechnology,2003,19(S1):79-83(in Chinese).

[18] 陸克文.新型豬用復(fù)合益生菌制劑的研制與開發(fā)[D].南京:南京農(nóng)業(yè)大學(xué),2011.

LU K W.Development of new combined probiotics praeparatum used in swine[D].Nanjing:Nanjing Agricultural University,2011(in Chinese with English abstract).

[19] 李志成,張連斌,王碧德,等.發(fā)酵溫度對凍干乳酸菌發(fā)酵劑活菌數(shù)的影響[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報,2006,15(2):156-158.

LI ZH CH,ZHANG L B,WANG B D,etal.Effect of fermented temperature on the viable bacteria counts of freeze-dried starter[J].ActaAgriculturaeBoreali-occidentalisSinica,2006,15(2):156-158(in Chinese with English abstract).

[20] WEINBERG Z G,SZAKDCS G.The effect of temperature on the ensiling process of corn and wheat[J].JournalofAppliedMicrobiology,2001,90(4):561-566.

[21] 張慧杰,玉 柱,王 林,等.青貯飼料中乳酸菌的分離鑒定及優(yōu)良菌株篩選[J].草地學(xué)報,2011,19(1):137-141.

ZHANG H J,YU ZH,WANG L,etal.Isolation and identification of lactic acid bacteria from silage and filtering of excellent strains [J].ActaAgrestiaSinica,2011,19(1):137-141(in Chinese with English abstract).

[22] 馬治宇,趙獻軍,張曉慶,等.乳酸菌及其培養(yǎng)液對肉雞盲腸菌群的影響[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報,2008,17(3):33-36.

MA ZH Y,ZHAO X J,ZHANG X Q,etal.Effects of lactobacillus and its culture fluid on cecum microflora of broilers[J].ActaAgriculturaeBoreali-occidentalisSinica,2008,17(3):33-36(in Chinese with English abstract).

CorrespondingauthorLAI Hangxian,male,associate professor,doctoral supervisor.Research area:microbial resources and utilization. E-mail:laihangxian @163.com

(責任編輯：史亞歌Responsibleeditor:SHIYage)

ScreeningandCharacteristicsofExcellentLacticAcidBacteriaforSilageAdditiveandProbiotics

LI Xiao, LI Haiyang, FANG Yanhua, LAI Hangxian, WEI Xiaomin and LOU Yi

(College of Resource and Environment Science, Northwest Aamp;F University, Yangling Shaanxi 712100, China)

The study was conducted to screen the excellent lactic acid bacteria for both silage additive and probiotics based on acid and biogas yield tests, growth rate and rates of acid producing tests, and the isolated strains were identified by morphological observation, physiological and biochemical tests, and sequence analysis of the 16S rDNA gene. Furthermore, other biological characteristics of excellent lactic acid bacteria, such as salt, acid and alkalis solvent tolerance, temperature resistance, the organic acid of lactic acid bacteria fermenting liquid composition and drug sensitivity were investigated. The result showed that three strains of lactic acid bacteria ,R02(Lactobacillusplantarum), R07(Enterococcusfaecalis) and R09(Pediococcuspentosaceus) were screened. R09 has the fastest growth rate and the strongest ability of producing acid. The proportion of lactic acid is the highest in liquid cultures of R09, accounting for 95.45% of the total acid content. Additionally, R09 can survive in 0.12 g/mL NaCl solution. R02 has the strongest tolerance to temperature, which grows well below 55 ℃. R07 has a strong resistance to acid and alkali, which can grow and survive within a wide pH range(3.0 to 9.5). R02, R07 and R09 strains characterized with such as high acids-producing capacity and high tolerance to acid, have a potentiality of using as silage additive and probioties.

Silage; Probiotics; Lactic acid bacteria; Tolerance; Antibiotic susceptibility test

2016-12-20

2017-01-18

Projects in the National Science amp; Technology Pillar Program During the Twelfth Five-Year Plan Period(No.2012BAD14B11).

LI Xiao, female,master student.Research area:microbial resources and utilization.E-mail:xiaolivjiayou@sina.com

日期：2017-11-17

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20171117.1101.024.html

2016-12-20

2017-01-18

“十二五”國家科技支撐計劃(2012BAD14B11)。

李 肖，女，碩士研究生，研究方向為微生物資源與利用。E-mail:xiaolivjiayou@sina.com

來航線，男，副教授，博士生導(dǎo)師，研究方向為微生物資源與利用。E-mail:laihangxian@163.com

Q939.96

A

1004-1389(2017)11-1655-09