發(fā)菜固氮酶nifH 基因克隆及其干旱脅迫下的差異表達(dá)

吳詩杰，王玲霞，劉 陽，嚴(yán)奉坤，丁苗苗，李曉旭，梁文裕

(寧夏大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，銀川 750021)

發(fā)菜固氮酶nifH 基因克隆及其干旱脅迫下的差異表達(dá)

吳詩杰，王玲霞，劉 陽，嚴(yán)奉坤，丁苗苗，李曉旭，梁文裕

(寧夏大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，銀川 750021)

通過對(duì)發(fā)菜固氮酶H亞基基因(nifH)全長(zhǎng)進(jìn)行克隆、原核表達(dá)和生物信息學(xué)分析，采用qRT-PCR技術(shù)，分析不同干旱脅迫下發(fā)菜固氮酶基因nifH在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)變化。結(jié)果表明，根據(jù)特異性引物克隆獲得長(zhǎng)度為894 bp的nifH，GenBank 登陸號(hào)為BankIt1901364(KU886163)。將nifH在大腸桿菌中表達(dá)，獲得約36 ku的外源蛋白。生物信息學(xué)分析表明，發(fā)菜nifH與已報(bào)道的多種藍(lán)藻的nifH及推導(dǎo)的氨基酸序列具有較高的相似性，nifH二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α螺旋、β-折疊、隨機(jī)卷曲和β-轉(zhuǎn)角構(gòu)成。隨藻體含水量的逐漸降低，發(fā)菜nifH在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)量逐漸增加，固氮酶活性呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)。研究結(jié)果為進(jìn)一步研究發(fā)菜固氮酶基因的分子結(jié)構(gòu)和發(fā)菜響應(yīng)干旱脅迫的固氮機(jī)制及氮代謝過程奠定基礎(chǔ)。

發(fā)菜；固氮酶；基因克??；生物信息學(xué)；差異表達(dá)

固氮酶在生物固氮過程中扮演著重要的角色。固氮酶由固氮基因nif編碼，不同物種間基因nif有較高的同源性[1-2]。在鉬鐵固氮酶系統(tǒng)中，nifH基因編碼鐵蛋白，還參與鐵鉬輔因子(FeMoco)生物合成并指導(dǎo)鐵鉬輔因子嵌入鉬鐵蛋白。nifH基因是所有生物固氮物種相對(duì)保守的功能基因，目前，已有較多研究通過nifH基因的遺傳多樣性來探討不同生境固氮微生物的群落結(jié)構(gòu)和多樣性，并發(fā)現(xiàn)在不同植被和地理?xiàng)l件下存在多樣的nifH基因[3-5]。而在研究固氮藍(lán)藻生物固氮分子機(jī)制及固氮基因遺傳多樣性等問題方面，固氮酶及其基因信息豐富程度是重要前提。

發(fā)菜(NostocflagelliformeBorn. et Flah.)是一種由念珠狀細(xì)胞包埋在公共膠質(zhì)鞘內(nèi)構(gòu)成絲狀藻體的陸生藍(lán)藻，生長(zhǎng)在氮素相當(dāng)缺乏的干旱、半干旱荒漠草原地區(qū)，具有較強(qiáng)的固氮能力[6]。發(fā)菜在濕潤(rùn)狀態(tài)下，短時(shí)間45 ℃易使固氮酶失去活性；在干燥和高溫55 ℃條件下，其固氮活性保持穩(wěn)定不變[7]。水分對(duì)固氮活性有重要的影響，吸水的發(fā)菜中固氮酶活性高于干燥的發(fā)菜固氮酶[8]。在“干燥-濕潤(rùn)”交替的生態(tài)條件下，發(fā)菜固氮酶活性逐步提高，抗旱能力明顯增強(qiáng)[7]。發(fā)菜日生長(zhǎng)周期固氮酶活性變化研究發(fā)現(xiàn)，在發(fā)菜適宜的生長(zhǎng)季節(jié)，早晨固氮酶活性處于較高水平，中午固氮酶活性急劇下降，傍晚固氮酶活性又逐漸提高[9]。因此，發(fā)菜固氮酶活性的變化與其分布區(qū)生態(tài)環(huán)境具有明顯的相關(guān)性，但目前發(fā)菜固氮酶的研究主要集中在環(huán)境條件與酶活性變化等方面[7-9]，固氮酶各亞基基因及固氮酶分子結(jié)構(gòu)信息相對(duì)缺乏，干旱脅迫下固氮酶基因的表達(dá)及相應(yīng)調(diào)控機(jī)制尚不清楚，制約了對(duì)發(fā)菜生物固氮分子機(jī)理的認(rèn)識(shí)。本研究對(duì)發(fā)菜固氮酶H亞基基因(nifH)全長(zhǎng)進(jìn)行克隆、表達(dá)和生物信息學(xué)分析，進(jìn)而分析干旱條件下發(fā)菜nifH的差異表達(dá)及固氮酶活性變化，為進(jìn)一步研究發(fā)菜固氮酶基因的分子結(jié)構(gòu)和發(fā)菜響應(yīng)干旱脅迫的固氮機(jī)理及氮代謝機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與處理

野生發(fā)菜采自寧夏賀蘭山發(fā)菜分布區(qū)。在溫度25 ℃、持續(xù)光照、光照度10 000 lx、無持續(xù)風(fēng)速、相對(duì)空氣濕度30%的條件下，模擬自然環(huán)境在培養(yǎng)床上對(duì)發(fā)菜進(jìn)行3種干旱脅迫處理，分別為A處理：發(fā)菜充分吸水并保持4 h的樣品(含水量800%±15%)，B處理：發(fā)菜充分吸水后自然失水6 h(含水量200%±8%)，C處理：發(fā)菜充分吸水后自然失水48 h(含水量15%±3%)(圖1)。每個(gè)樣品3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。將樣品用滅菌速凍的錫箔紙迅速包好放入液氮中冷凍，于-80 ℃冰箱保藏，備用。含水量計(jì)算公式為[(鮮質(zhì)量-干質(zhì)量)/干質(zhì)量]×100%。

圖1 干旱脅迫條件下發(fā)菜藻體Fig.1 Colonies of N.flagelliforme under different drought stress

1.2 方 法

1.2.1 發(fā)菜DNA提取及nifH的克隆 發(fā)菜基因組DNA提取參照梁文裕等[10]DNA提取方法。根據(jù)發(fā)菜同源性較高物種的nifH序列設(shè)計(jì)特異性引物P1和P2(表1)。按照94 ℃ 8 min；94 ℃ 45 s，50 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃，11 min的程序進(jìn)行PCR反應(yīng)。產(chǎn)物用TIANGEN DNA純化回收試劑盒回收純化，并和pMD18-T Vector在16 ℃連接12 h，反應(yīng)結(jié)束后，立即轉(zhuǎn)化和測(cè)序。測(cè)序結(jié)果提交NCBI，并應(yīng)用BLAST程序在GenBank上進(jìn)行相似性比較。

表1 nifH 擴(kuò)增、原核表達(dá)及qRT-PCR引物序列Table 1 Primer sequences of amplification, prokaryotic expression and qRT-PCR of nifH

1.2.2 發(fā)菜nifH的原核表達(dá) 根據(jù)發(fā)菜nifH的測(cè)序結(jié)果，設(shè)計(jì)擴(kuò)增nifH的特異性引物EP1和EP2，并在上、下游游引物5′末端分別添加限制性酶切位點(diǎn)BamHⅠ和XhoⅠ(單下劃線所示)，兩端加保護(hù)性堿基CGC和CCG(雙下劃線所示)(表1)。以含有nifH的陽性菌液為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增(94 ℃ 8 min；94 ℃ 45 s，50 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s 30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 11 min)。

37 ℃下將PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒pET28a(+)用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切2 h，回收目的片段，16 ℃連接12 h，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，Kan篩選陽性克隆子，37 ℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)后進(jìn)行PCR驗(yàn)證。將驗(yàn)證成功的陽性菌液培養(yǎng)12 h提取質(zhì)粒DNA，使用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ分別對(duì)pET28a質(zhì)粒和經(jīng)PCR擴(kuò)增得到nifH基因進(jìn)行雙酶切處理。雙酶切驗(yàn)證成功的陽性克隆菌液進(jìn)行測(cè)序。IPTG誘導(dǎo)表達(dá)和SDS-PAGE電泳檢測(cè)等參照梁文裕等[10]的方法。

1.2.3nifH誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的Western blotting 鑒定 SDS-PAGE后，用半干轉(zhuǎn)移儀將蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，20 mL 5 g/L (W/V)脫脂奶粉封閉。一抗為1∶2 000兔抗nifH多克隆抗體，二抗為1∶4 000羊抗兔IgG。用化學(xué)顯色蛋白免疫印跡法進(jìn)行Western blotting分析。

1.2.4 生物信息學(xué)分析方法 采用生物信息學(xué)分析方法對(duì)發(fā)菜nifH核苷酸序列及推譯的氨基酸序列進(jìn)行分析(表2)。

表2 生物信息學(xué)分析方法Table 2 Bioinformatics methods

1.2.5 發(fā)菜RNA反轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR反應(yīng) 按照TIANGEN多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取發(fā)菜總RNA。cDNA第一鏈的合成參照TaKaRa Super RT Kit說明書。經(jīng)檢測(cè)合格并定量的總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。設(shè)計(jì)qRT-PCR引物RT-PCR-P1和RT-PCR-P2，16S rRNA qRT-PCR引物16S rRNA-P1和16S rRNA-P2為內(nèi)標(biāo)引物(表1)，在BioRad icycler iQ熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增(95 ℃，10 min；94 ℃ 15 s，57 ℃ 15 s ，72 ℃ 25 s，35個(gè)循環(huán))。

1.2.6 干旱脅迫條件下發(fā)菜固氮酶活性檢測(cè) 參照Stewart等[11]的方法對(duì)發(fā)菜固氮酶活性進(jìn)行檢測(cè)。分別取不同干旱脅迫處理的0.2 g 發(fā)菜樣品置于50 mL玻璃瓶中，密閉后注入氬氣保持10～15 min，然后將樣品在25 ℃、40 μmol/(m2·s) 10% C2H2條件下孵育3 h，氣相色譜(HP-6890)檢測(cè)C2H4的生成量。固氮酶活性根據(jù)C2H4生成量換算。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理 采用Sigmaplot 12.5進(jìn)行方差分析，檢驗(yàn)數(shù)據(jù)的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)菜nifH 的克隆

以發(fā)菜基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增得到894 bp的目的條帶(圖2)。陽性單菌落PCR鑒定，擴(kuò)增產(chǎn)物在894 bp處出現(xiàn)特異性條帶(圖3)，表明外源目的片段已成功克隆。將測(cè)序結(jié)果提交NCBI，GenBank登錄號(hào)分別為：BankIt 1901364(KU886163)。

1.nifH ；M.DL2000

1.nifH陽性轉(zhuǎn)化子(DH5a)nifHpositive transformant(DH5a/nifH)；2.陰性對(duì)照 Negative control； M.DL2000

圖3nifH陽性轉(zhuǎn)化子(DH5a)的PCR檢測(cè)
Fig.3PCRidentifieationofpositivetransformant(DH5a/nifH)

2.2 原核表達(dá)與驗(yàn)證

構(gòu)建的nifH表達(dá)載體pET28a-nifH雙酶切后，在894 bp處出現(xiàn)一條與預(yù)期片段大小一致的特異性條帶(圖4)，說明nifH表達(dá)載體構(gòu)建成功。將pET28a-nifH質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(Kan抗性)中，IPTG誘導(dǎo)nifH蛋白表達(dá)，SDS-PAGE 電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)有大量外源蛋白表達(dá)，分子質(zhì)量約為36 ku(圖5)，經(jīng)凝膠掃描測(cè)定，IPTG誘導(dǎo)5 h后外源蛋白約占細(xì)菌蛋白總量的45%。

M.DL15000+DL2 000；1.pET28a-nifH

圖4重組表達(dá)載體pET28a-nifH的酶切
Fig.4RestrictionanalysisofrecombinantplasmidpET28a-nifH

M. 蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) Protein marker；1. IPTG 誘導(dǎo)的空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子 IPTG induced negative transformant；2. 未誘導(dǎo)的空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子 IPTG uninduced negative transformant；3. 未誘導(dǎo)的陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子 IPTG uninduced positive transformant with pET28a-nifH；4. IPTG 誘導(dǎo) 1 h 的陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子 IPTG induced positive transformant with pET28a-nifHafter 1 h；5. IPTG 誘導(dǎo) 5 h 的陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子 IPTG induced positive transformant with pET28a-nifHafter 5 h；6. IPTG 誘導(dǎo) 3 h 的陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子 IPTG induced positive transformant with pET28a-nifHafter 3 h;圖6同 The same as fig.6

圖5nifH蛋白在大腸桿菌中表達(dá)的SDS-PAGE電泳圖譜
Fig.5SDS-PAGEimageofnifHexpressedinE.coli

應(yīng)用nifH蛋白多克隆抗體對(duì)克隆的nifH大腸桿菌表達(dá)產(chǎn)物的進(jìn)行Western blot檢測(cè)，轉(zhuǎn)入大腸桿菌的nifH在IPTG誘導(dǎo)后的細(xì)菌中有預(yù)期大小的顯色條帶(圖6)，證明表達(dá)的外源蛋白確實(shí)為nifH蛋白。

圖6 nifH蛋白Western blot 雜交圖譜Fig.6 Western blot profile of nifH expressed in E.coli

2.3 發(fā)菜nifH 基因生物信息學(xué)分析

用NCBI里OFR Finder分析結(jié)果表明，nifH具有完整的開放閱讀框(ORF)，其全長(zhǎng)894 bp，編碼297個(gè)氨基酸，等電點(diǎn)(pI)為4.56，起始氨基酸為甲硫氨酸，終止氨基酸為絲氨酸(圖7)。

發(fā)菜nifH CDS區(qū)包含19種氨基酸，谷氨酸(Glu)數(shù)目最多，為30個(gè)，占整個(gè)氨基酸組成的10.1%；組氨酸(His)和半胱氨酸(Cys)僅為3個(gè)，所占比例最低，為1.68%，不含色氨酸(圖8)。

對(duì)發(fā)菜nifH的核苷酸序列進(jìn)行同源性分析，發(fā)現(xiàn)發(fā)菜與點(diǎn)形念珠藻(NostocpunctiformePCC 73102)和地木耳(Nostoccommune)的相似性最高，分別為95%和94%，與靜水筒藻(CylindrospermumstagnalePCC 7417)為94%，與球形念珠藻(Nostocsp. PCC 7107)、球腥藻(Anabaenasp. L-31)和多變魚腥藻(AnabaenavariabilisATCC 29413)均為89%，與念珠藻(Nostocsp. PCC 7120)為88%，與池型念珠藻(NostocpiscinaleCENA21)僅為88%(圖9)。

將nifH推譯的氨基酸序列與其他藻類進(jìn)行同源性比較，發(fā)現(xiàn)發(fā)菜和點(diǎn)形念珠藻(NostocpunctiformePCC 73102)的同源性最高，為99%，與地木耳(Nostoccommune)為97%，與靜水筒藻(CylindrospermumstagnalePCC 7417)為94%，與球形念珠藻(Nostocsp. PCC 7107)為91%，與池型念珠藻(NostocpiscinaleCENA21)、球腥藻(Anabaenasp. L-31)和多變魚腥藻(AnabaenavariabilisATCC 29413)均為89%，而與念珠藻(Nostocsp. PCC 7120)僅為87%(圖10)。

對(duì)nifH磷酸化位點(diǎn)分析表明，Ser有4個(gè)磷酸化位點(diǎn)，Thr有3個(gè)磷酸化位點(diǎn)，Tyr有2個(gè)磷酸化位點(diǎn)(圖11)。

圖7 發(fā)菜nifH 的核苷酸序列(上)和推導(dǎo)氨基酸序列(下)Fig.7 Nucleotide sequence(upper lines) and its deduced amino acid sequence(lower lines) of the nifH from N.flagelliforme

圖8 發(fā)菜nifH 氨基酸組成預(yù)測(cè)Fig.8 Putative amino acid composition of nifH from N.flagelliforme

圖9 發(fā)菜nifH 的核苷酸序列同源樹Fig.9 Homologous tree of nucleotide sequences of nifH from N.flagelliforme

圖10 發(fā)菜nifH 的氨基酸序列同源樹Fig.10 The homologous tree of amino acid sequences of nifH from N.flagelliforme

綠色代表絲氨酸 Green represent Serine;藍(lán)色代表蘇氨酸 Blue represent Threonine；粉色代表酪氨酸 Pink represent Tyrosine

圖11nifH蛋白磷酸化位點(diǎn)在序列中的位置
Fig.11PredictedphosphyorylationsitesinsequenceofnifHfromN.flagelliforme

對(duì)發(fā)菜nifH的氨基酸序列做疏水性分析，發(fā)現(xiàn)多肽鏈第240位的丙氨酸親水性最強(qiáng)，第273位的谷氨酸疏水性最強(qiáng)。

發(fā)菜nifH蛋白的氨基酸序列跨膜區(qū)分析表明，nifH為膜外蛋白(圖12)。

對(duì)發(fā)菜nifH 二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，表明發(fā)菜nifH 主要由α-螺旋、β-折疊、隨機(jī)卷曲和β-轉(zhuǎn)角構(gòu)成(表3)。運(yùn)用swissmodel服務(wù)器對(duì)發(fā)菜nifH進(jìn)行建模分析，并用PyMOL 軟件繪制蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)圖，顯示這些α-螺旋、β-折疊、隨機(jī)卷曲和β-轉(zhuǎn)角構(gòu)成通過延伸鏈連接折疊成不對(duì)稱的三維空間結(jié)構(gòu)(圖13)。

圖12 nifH 跨膜區(qū)分析Fig.12 The TMHMM posterior probabilities for sequence of nifH from N.flagelliforme

表3 發(fā)菜nifH 二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果Table 3 Secondary structure prediction of nifH from N.flagelliforme

注：# 氨基酸數(shù)目；## 占總氨基酸的百分比。

Note：# amount of amino acid; ## amino acid in total percentage.

2.4 發(fā)菜nifH qRT-PCR分析

提取的發(fā)菜總RNA經(jīng)檢測(cè)，OD260/OD280在1.9～2.0。qRT-PCR結(jié)果表明，在干旱脅迫條件下，發(fā)菜nifH在轉(zhuǎn)錄水平上呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)，B處理和C處理發(fā)菜nifH基因的表達(dá)量較對(duì)照組的nifH均表現(xiàn)為增加，且存在顯著差異(Plt;0.05)。其中，C處理的發(fā)菜nifH表達(dá)量為對(duì)照組(A)發(fā)菜的1.82倍(圖14)。

不同小寫字母表示差異顯著(Plt;0.05)。圖15同。

Different lowercase letters mean significant difference(Plt;0.05).The smae as fig.15.

圖14干旱脅迫下nifH相對(duì)表達(dá)量
Fig.14RelativeexpressionofnifHrelativegeneinN.flagelliformeunderdroughtstress

2.5 干旱脅迫下發(fā)菜固氮酶活性的變化

發(fā)菜在充分吸水條件下(A)，固氮酶活性達(dá)7.5 μmol/(g·h)，當(dāng)干燥失水6 h(B)時(shí)，固氮酶活性顯著高于充分吸水時(shí)固氮酶活性(Plt;0.05)，而失水干燥48 h時(shí)(C)，固氮酶活性降低，小于充分吸水和干燥失水6 h(B)時(shí)固氮酶活性(Plt;0.05)(圖15)。

圖15 干旱脅迫下發(fā)菜固氮酶活性的變化Fig.15 Changes of nitrogenase activities in N.flagelliforme under drought stress

3 討論與結(jié)論

目前，藍(lán)藻固氮酶基因信息尚不豐富，NCBI數(shù)據(jù)庫中具有固氮酶基因信息的藍(lán)藻主要為水生種類，而陸生耐旱藍(lán)藻由于其對(duì)分布區(qū)具有重要的拓荒固氮的生態(tài)作用，基因分子信息的豐富程度對(duì)認(rèn)識(shí)其由水生到陸生再到干旱的荒漠草原環(huán)境的進(jìn)化及其生物固氮機(jī)制具有重要意義。本研究通過特異性引物克隆獲得全長(zhǎng)為894 bp的發(fā)菜nifH基因信息及原核表達(dá)產(chǎn)物，這為認(rèn)識(shí)發(fā)菜進(jìn)化機(jī)制及其響應(yīng)干旱脅迫的固氮機(jī)理和氮代謝機(jī)理提供信息及試驗(yàn)基礎(chǔ)。此外，Gao等[12]對(duì)發(fā)菜與幾種藍(lán)藻的分子水平檢測(cè)后認(rèn)為，發(fā)菜與點(diǎn)形念珠藻具有很近的親緣關(guān)系。本研究通過核苷酸和氨基酸序列同源比對(duì)，表明發(fā)菜與已知其他藍(lán)藻一致性都在88%以上，表明發(fā)菜nifH和nifH均較保守。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果表明，發(fā)菜nifH和nifH最先與點(diǎn)形念珠藻聚類，其次與地木耳、靜水筒藻等物種聚類合并，這也進(jìn)一步證明了發(fā)菜與點(diǎn)形念珠藻親緣關(guān)系較近。

固氮酶是生物固氮的關(guān)鍵酶。一般認(rèn)為，固氮酶的基因表達(dá)水平受到外界復(fù)雜的環(huán)境因素影響[13]。在海洋環(huán)境中，單細(xì)胞固氮藍(lán)藻nifH基因的表達(dá)水平隨晝夜光照和水體鹽分含量的變化而變化，但在土壤環(huán)境中，土壤中肥料的含量和晝夜光照變化對(duì)固氮群落中nifH的表達(dá)水平無顯著影響[14]。本研究結(jié)果表明，發(fā)菜nifH基因在轉(zhuǎn)錄水平隨藻體水分散失程度的加深而增加，說明干旱脅迫可能誘導(dǎo)nifH基因表達(dá)水平增加。Liang等[8]研究表明，與充分吸收水分的發(fā)菜藻體相比，失水48 h的發(fā)菜其nifH蛋白表達(dá)量和固氮酶活性均下降，但NH3含量卻逐漸增加。本研究表明，隨著發(fā)菜干旱脅迫程度的增加，固氮酶活性呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)。分析認(rèn)為，從基因到蛋白的生物學(xué)過程受到轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控和翻譯水平的調(diào)控等諸多水平的精確調(diào)控和影響，僅僅轉(zhuǎn)錄水平的上調(diào)還不能直接導(dǎo)致翻譯的蛋白表達(dá)量增加。同時(shí)，理論上固氮酶活性強(qiáng)，促進(jìn)固氮反應(yīng)；固氮酶活性下降，固氮反應(yīng)減弱，然而固氮酶活性受多種因素綜合調(diào)控[15]，尤其nifM是調(diào)節(jié)固氮酶活性的重要基因，其產(chǎn)物構(gòu)成固氮酶活性中心的一部分，并調(diào)節(jié)nifD和nifK的活性，而nifM和nifS產(chǎn)物調(diào)節(jié)nifH的活性[16-17]。因此，在干旱脅迫條件下發(fā)菜nifH表達(dá)調(diào)控機(jī)制以及nifM和nifS是如何調(diào)節(jié)nifH的表達(dá)尚需進(jìn)一步研究。

綜上所述，發(fā)菜nifH基因全長(zhǎng)為894 bp，與已報(bào)道的多種藍(lán)藻的nifH及推導(dǎo)的氨基酸序列具有較高的相似性，nifH二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋、β-折疊、隨機(jī)卷曲和β-轉(zhuǎn)角構(gòu)成。干旱脅迫導(dǎo)致發(fā)菜nifH差異表達(dá)和固氮酶活性的變化。

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CorrespondingauthorLIANG Wenyu,male,Ph.D,professor. Research area:environmental botany and protection and utilization of plant resources.E-mail：liangwy2009@163.com

(責(zé)任編輯：史亞歌Responsibleeditor:SHIYage)

CloningofnifHfromN.flagelliformeandItsDifferentialExpressionPatternunderDroughtStress

WU Shijie, WANG Lingxia, LIU Yang, YAN Fengkun, DING Miaomiao, LI Xiaoxu and LIANG Wenyu

(School of Life Sciences, Ningxia University, Yinchuan 750021, China)

N.flagelliformeis a kind of terrestrial nitrogen-fixing cyanobacterium, which is distribute in arid or semiarid steppes and has important ecological value. Full length ofnifHwas cloned by specific primer,nifHwas expressed inE.coli, DNA sequence and its encoded protein was analyzed by bioinformatics methods, differential expression in transcriptional level was also tested by qRT-PCR. The results indicated that full length ofnifHis 894 bp (GenBank access number is BankIt1901364 (KU886163). Heterologous protein (36 ku) was expressed inE.coli.The nucleotide sequence and the encoded amino acid sequence ofnifHwere highly homologous to other cyanobacteria species. The secondary structure and tertiary structure were made up ofα-helix,β-sheet, random coil andβ-turn. In addition, expression level ofnifHgradually increased in transcriptional level with the decrease of water content in colonies ofN.flagelliforme, and changes of nitrogenase activities incresed firstly and then decreased under drought stress. The results laid a foundation for further research on structure of nitrogenase gene and molecular mechanism of nitrogen-fixing forN.flagelliformein response for drought stress.

N.flagelliforme; Nitrogenase; Gene cloning; Bioinformatics; Differential expression

2017-01-11

2017-02-21

Natural Science Grant of Ningxia(No.NZ1608).

WU Shijie, female,master student.Research area:environmental botany.E-mail：398538403@qq.com

日期：2017-11-17

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20171117.1101.012.html

2017-01-11

2017-02-21

寧夏自然科學(xué)基金(NZ1608)。

吳詩杰，女，碩士研究生，研究方向?yàn)榄h(huán)境植物學(xué)。E-mail：398538403@qq.com

梁文裕，男，博士，教授，研究方向?yàn)榄h(huán)境植物學(xué)及植物資源保護(hù)和利用。E-mail：liangwy2009@163.com

Q78

A

1004-1389(2017)11-1639-09