三維熒光光譜法和圓二色譜法研究氨基比林與牛血清白蛋白分子的相互作用

王曉霞，李松波，馬力通，郭貴寶，劉金彥，王正德，閆 慧

（內(nèi)蒙古科技大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014010）

三維熒光光譜法和圓二色譜法研究氨基比林與牛血清白蛋白分子的相互作用

王曉霞，李松波，馬力通，郭貴寶，劉金彥，王正德，閆 慧

（內(nèi)蒙古科技大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014010）

該文在模擬生理條件下，采用熒光光譜法、三維熒光光譜法以及圓二色譜法，研究氨基比林（PYM）與牛血清白蛋白（BSA）之間的相互作用。研究結(jié)果表明PYM對BSA有強烈的熒光猝滅作用，其熒光猝滅機制為靜態(tài)猝滅。由熱力學(xué)參數(shù)判定PYM和BSA的主要作用力為氫鍵和范德華力，并且相互作用是自發(fā)進(jìn)行的。根據(jù)F?rster的偶極-偶極非輻射能量轉(zhuǎn)移理論可以得出PYM與BSA之間的結(jié)合距離為2.09nm。利用三維熒光光譜和圓二色譜技術(shù)，分析PYM對BSA蛋白構(gòu)象的影響，表明PYM與BSA相互作用后使BSA的微環(huán)境和構(gòu)象發(fā)生改變。

氨基比林；牛血清白蛋白；熒光猝滅；三維熒光光譜；圓二色譜

0 引 言

氨基比林又名匹拉米洞（Pyramidon），為解熱鎮(zhèn)痛藥，其鎮(zhèn)痛作用強而持久，對胃腸道刺激性小[1]。血清白蛋白是血漿中最為豐富的蛋白質(zhì)，能與進(jìn)入血液中的藥物進(jìn)行可逆結(jié)合從而起到在體內(nèi)轉(zhuǎn)運的作用。因為結(jié)構(gòu)上和人血清白蛋白的相似性，牛血清白蛋白（BSA）被廣泛用于與藥物結(jié)合作用的研究[2]。BSA可運載不溶性藥物小分子，依靠的作用力有范德華力、靜電引力、氫鍵、疏水作用力等[3]。

血清白蛋白與各種藥物小分子的作用涉及很多領(lǐng)域與學(xué)科，關(guān)于這方面的研究一直沒有間斷過。Fang等[4]利用光譜研究白果酚與牛血清白蛋白之間的相互作用。張玉明等[5]利用熒光光譜研究桿菌肽與牛血清白蛋白相互作用。目前尚未見氨基比林與牛血清白蛋白間作用的熒光光譜法研究，本文主要在模擬生理狀況條件下，用熒光光譜法探討了氨基比林和牛血清蛋白結(jié)合的特征，確定了PYM與BSA作用力種類，分析PYM對BSA構(gòu)象的影響，以期為氨基比林的應(yīng)用和開發(fā)提供數(shù)據(jù)參考。

1 實驗部分

1.1 實驗儀器與試劑

熒光分光光度計（LS-55，美國PerkinElmer公司）；紫外分光光度計（SPECORD50，德國耶拿分析儀器股份公司）；數(shù)顯恒溫水浴振蕩器（SHA-B，金壇市醫(yī)療儀器廠）；圓二色光譜儀（Jasco-715，北京國嘉恒業(yè)科學(xué)儀器有限公司）；實驗室pH計（EL20，上海梅特勒-托利多公司）；電子天平（TP-114，北京丹佛儀器有限公司）。

無水乙醇（天津市光復(fù)科技有限發(fā)展公司）；HCl（北京化工廠，分析純）；NaCl（天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司，分析純）；氨基比林（Pyramidon，PYM，中國藥品生物制品檢定所，分析純）；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA，sigma 公司，分析純）；三（羥甲基）氨基甲烷（Tris，天津市華東試劑廠，分析純）；實驗所用試劑均為分析純，實驗用水均為二次去離子水。

1.2 溶液配制

0.1 mol/L 的 Tris-HCl緩沖液（pH 7.40）：稱取3.028 5 g三（羥甲基）氨基甲烷，用二次去離子水溶解，配制250 mL Tris溶液備用；將配好的Tris溶液取適量于500mL燒杯中，用鹽酸調(diào)節(jié)pH為7.40。

牛血清白蛋白溶液：準(zhǔn)確稱取0.6700g BSA用二次去離子水溶解，配置成100mL 1×10-4mol/L的BSA儲備溶液備用；取1×10-4mol/L BSA 5 mL于100mL容量瓶中，加入20mL 0.5mol/L的NaCl，用pH為7.40的Tris-HCl緩沖液定容，即可得到5×10-6mol/L的BSA溶液。

1×10-4mol/L氨基比林溶液：準(zhǔn)確稱取0.0023g氨基比林，二次去離子水溶解，配制成1×10-4mol/L的氨基比林溶液備用。

1.3 實驗方法

1.3.1 PYM與BSA的熒光光譜、同步光譜測定

向10mL具塞比色管分別加入1mL 5×10-6mol/L的BSA 溶液，然后分別加入0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5 mL 1×10-4mol/L PYM 溶液，二次去離子水定容，搖勻。分別在（299±0.1）K，（307±0.1）K，（315±0.1）K的恒溫水浴鍋中放置0.5 h，作為待測溶液。固定熒光激發(fā)波長280 nm，激發(fā)與發(fā)射狹縫9nm，掃描速度 1500nm/min，掃描290～550nm的發(fā)射光譜，每次記錄發(fā)射波長在345nm附近的熒光強度。在同步熒光光譜掃描中，掃描發(fā)射波長范圍為250～550nm的發(fā)射光譜，掃描速度1500nm/min，記錄Δλ=60nm和Δλ=15nm的熒光強度。

1.3.2 BSA、PYM-BSA的三維熒光光譜的測定

使用熒光儀測定溶液的三維熒光光譜。其參數(shù)設(shè)置為：發(fā)射波長200～500nm，激發(fā)波長200nm，狹縫寬度 9 nm，掃描速度 1 500 nm/min，組分?jǐn)?shù)30，激發(fā)波長間隔5nm。

1.3.3 PYM與BSA圓二色譜測定

測量時 BSA 與 PYM 的濃度比為 1∶0，1∶1，1∶5，并且以Tris-HCL緩沖液作為參比，所有數(shù)據(jù)經(jīng)過4次掃描取平均值，溶液中BSA樣品濃度為1.0×10-5mol/L，PYM 濃度為 1.0×10-5，5.0×10-5mol/L。掃描范圍為190～250nm，掃描時間為0.5s，石英樣品池的光程為0.1cm，掃描速度為3.3nm/s，靈敏度為2mdeg/cm，分辨率為0.1nm，光譜校正設(shè)為開啟以消除光柵和檢測器相應(yīng)的波長。

2 分析結(jié)果與討論

2.1 PYM與BSA相互作用的熒光光譜分析

測定 299，307，315 K 3個溫度下 BSA與 PYM的熒光光譜圖，如圖1所示，固定熒光激發(fā)波長為280 nm，BSA的最大發(fā)射熒光強度會出現(xiàn)在345 nm處，并且在BSA濃度不變的情況下，隨著PYM的不斷加入，BSA在345 nm附近的熒光強度明顯減弱，但最大熒光強度發(fā)射波長位置基本不變，表明PYM對BSA有熒光猝滅作用。

2.2 PYM與BSA猝滅作用機理的確定

PYM與BSA的相互作用屬于熒光猝滅，而已知的熒光猝滅分為靜態(tài)猝滅與動態(tài)猝滅兩種，均符合Stern-Volmer公式[6]：

圖1 不同溫度下PYM與BSA相互作用的熒光光譜圖

圖2 不同溫度下PYM對BSA的熒光猝滅Stern-Volmer曲線圖

式中：F0、F——未加入和加入PYM的BSA的熒光強度；

[Q]——PYM的摩爾濃度，mol/L；

KSV——動態(tài)猝滅常數(shù)，L/mol；

Kq——由擴散過程控制的雙分子動態(tài)猝滅速率常數(shù)，L/（mol·s）；

τ0——沒有PYM存在的情況下熒光分子平均壽命，通常τ0約為 10-8s[7]。

當(dāng)溫度不斷升高，動態(tài)猝滅常數(shù)會變大，但靜態(tài)猝滅常數(shù)會變小，可依據(jù)計算結(jié)果辨別出此反應(yīng)的熒光猝滅種類。

根據(jù) Stern-Volmer公式，以 F0/F對[Q]作圖，得到 299，307，315K 下的 Stern-Volmer曲線圖，如圖 2所示，線性方程與相關(guān)系數(shù)如表1所示。

表1 Stern-Volmer線性方程相關(guān)系數(shù)

一般來說，由于各種猝滅劑對生物大分子的最大擴散碰撞猝滅常數(shù)為 2.0×1010L/（mol·s）[8]，由表 1可以看出，PYM對BSA的動態(tài)熒光猝滅速率常數(shù)Kq遠(yuǎn)大于最大擴散碰撞猝滅常數(shù)，證明PYM對BSA的作用是靜態(tài)猝滅；并且隨著溫度升高，曲線斜率降低，而曲線斜率代表猝滅常數(shù)KSV，即猝滅常數(shù)KSV隨著溫度的升高而降低，進(jìn)一步證明了PYM對BSA的作用是靜態(tài)猝滅。

2.3 PYM與BSA結(jié)合常數(shù)及結(jié)合位點數(shù)的確定

當(dāng)小分子與大分子相互結(jié)合時結(jié)合位點數(shù)n和結(jié)合常數(shù)K[9]，可以由下式得出：

式中：K——PYM與BSA的結(jié)合常數(shù)，L/mol；

n——PYM與BSA的結(jié)合位點數(shù)。

分別做不同溫度下的 lg[（F0-F）/F]-lg[Q]的關(guān)系圖，根據(jù)式（2）得出不同狀態(tài)下的K和n，見表2。

表2 PYM對BSA反應(yīng)的結(jié)合常數(shù)K與結(jié)合位點數(shù)n

由表中可以看出PYM與BSA的結(jié)合常數(shù)都很大，而且由計算得出的結(jié)合位點數(shù)都接近1，由此可知PYM與BSA的結(jié)合很緊密，但是隨著溫度的升高，結(jié)合位點數(shù)與結(jié)合常數(shù)不斷減小，也進(jìn)一步佐證PYM與BSA的作用屬于靜態(tài)猝滅，與猝滅常數(shù)KSV的結(jié)論相吻合。

2.4 PYM和BSA結(jié)合作用的熱力學(xué)參數(shù)以及作用力的判定

分子間的作用力包括氫鍵、范德華力、靜電引力、疏水作用力等。當(dāng)溫度改變不大時，反應(yīng)的焓變ΔrHm相當(dāng)于一個常數(shù)[10]。根據(jù)文獻(xiàn)[11]，當(dāng) ΔH＞0，ΔS＞0時， 反應(yīng)主要為疏水作用力； 當(dāng) ΔS＜0，ΔH＜0時，作用力為氫鍵和范德華力；當(dāng) ΔH＜0，ΔS＞0 時，作用力為靜電引力。由熱力學(xué)公式：

式中：T——熱力學(xué)溫度，K；

K——PYM與BSA的結(jié)合常數(shù)，L/mol；

ΔrGm——吉布斯自由能，J/mol；

ΔrHm——反應(yīng)焓變，J/mol；

ΔrSm——反應(yīng)熵變，J/（mol·K）。

分別計算得出299，307，315K下PYM與BSA作用的自由能變ΔrGm、ΔrHm和ΔrSm結(jié)果如表3所示。

表3 PYM與BSA熱力學(xué)參數(shù)

由表可以看出，PYM與BSA的熱力學(xué)參數(shù)ΔrHm＜0和 ΔrSm＜0， 可以推斷出PYM與BSA之間的主要作用力是氫鍵和范德華力。而ΔrGm＜0，所以PYM與BSA的相互作用是自發(fā)進(jìn)行的。

圖3 PYM的紫外吸收光譜與BSA的熒光光譜

2.5 PYM與BSA的結(jié)合距離

F?rster的偶極-偶極非輻射能量轉(zhuǎn)移理論指出：當(dāng)供能體物質(zhì)發(fā)射熒光，供能體的熒光發(fā)射光譜與受能體的紫外吸收光譜有重疊，供能體與受能體足夠靠近，最大距離不超過7 nm時，會發(fā)生非輻射能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，導(dǎo)致熒光物質(zhì)的熒光強度猝滅[12]。實驗測出PYM的紫外可見吸收光譜與BSA的熒光發(fā)射光譜，發(fā)現(xiàn)兩光譜之間有一定的重疊，如圖3所示。

根據(jù)以下公式計算出PYM與BSA的結(jié)合距離：

式中R0是臨界距離（能量轉(zhuǎn)移效率為50%時）；r為供體-受體間的結(jié)合距離；K2為偶極空間取向因子（可取受能體和供能體各向隨機分布的平均值，即2/3）；N為介質(zhì)折射指數(shù)（一般取水和有機物折射指數(shù)的平均值，即1.336）；φ為供能體熒光量子產(chǎn)率（通常取蛋白質(zhì)中色氨酸的量子產(chǎn)率，即0.118）；J為供體（蛋白）熒光發(fā)射光譜與受體（藥物）吸收光譜間的光譜重疊部分；F（λ）為供能體在波長λ處的熒光強度；ε（λ）為受能體在波長λ時的紫外摩爾吸收系數(shù)；F 為 CBSA∶CPYM=1∶1 時 BSA 的熒光強度。

由式（8）采用矩形分割法能夠求出圖中PYM與BSA兩光譜陰影部分面積積分值 J=9.18×10-15L/（mol·cm3），由 K2=2/3、N=1.336、φ=0.118 并利用式（7）可計算出臨界距離R0=2.235 nm，根據(jù)式（6）求得能量轉(zhuǎn)移效率E=0.6580，進(jìn)而由R0和E求出供體-受體間的結(jié)合距離r=2.09nm。本實驗計算求得PYM與BSA中色氨酸殘基（Trp）之間的距離明顯小于7 nm，表明PYM與BSA之間能發(fā)生非輻射能量轉(zhuǎn)移。

圖4 PYM-BSA的同步熒光光譜圖

2.6 PYM與BSA的同步熒光光譜圖

當(dāng)Δλ=15nm時同步熒光光譜僅僅表示酪氨酸殘基的熒光信息，當(dāng)Δλ=60nm時同步熒光光譜只表示色氨酸殘基的熒光信息。因為蛋白質(zhì)中氨基酸殘基的最大發(fā)射波長與它所存在環(huán)境的極性和疏水性有關(guān)，所以由發(fā)射波長的變化可判斷蛋白質(zhì)構(gòu)象變化，若體系的極性增大，則會發(fā)生紅移，疏水性增大則會發(fā)生藍(lán)移[13]，圖 4為 Δλ=15nm，Δλ=60nm 的熒光光譜圖。

由圖可知Δλ=60nm時，隨著PYM濃度的逐漸變大，PYM-BSA體系的最大發(fā)射波長出現(xiàn)紅移，表明色氨酸殘基存在的環(huán)境極性變強。當(dāng)Δλ=15nm時PYM 對 BSA 的猝滅作用較弱（KSV=2.68×104L/mol），而 Δλ=60nm 時的猝滅作用較強（KSV=3.16×104L/mol），色氨酸殘基對BSA熒光猝滅的貢獻(xiàn)高于酪氨酸殘基，由此可判斷PYM主要結(jié)合在BSA中的色氨酸殘基上。

2.7 三維熒光光譜圖

為進(jìn)一步考查樣品的分布情況和構(gòu)型變化，測得三維熒光光譜圖，如圖5、圖6所示。

由圖5、圖6可以看出三維熒光光譜圖主要有兩種峰，一種是“山脊”狀的瑞麗散射峰如峰a和峰b，另一種是類似“駝峰”的典型熒光峰如峰1和峰2。從圖中可以看出加入PYM溶液后，熒光峰1和2的強度有所降低，單獨BSA的峰1相對應(yīng)的峰頂坐標(biāo)和熒光強度（λex/λem，F(xiàn)）為（280/334，184.95），峰 2相對應(yīng)的峰頂坐標(biāo)和熒光強度（λex/λem，F(xiàn)）為（225/336，423.36）；當(dāng)加入PYM之后峰1相對應(yīng)的峰頂坐標(biāo)和熒光強度（λex/λem，F(xiàn)）為（280/338，151.19），峰 2 相對應(yīng)的峰頂坐標(biāo)和熒光強度（λex/λem，F(xiàn)）為（225/340，346.83）。從數(shù)據(jù)中可以明顯的看出熒光峰的強度降低。峰1，峰2的發(fā)射波長均紅移了4 nm。這表明PYM與BSA相互作用之后使得體系所處的微環(huán)境的極性增強，由此說明加入PYM之后BSA的構(gòu)象發(fā)生了改變。

圖5 1×10-7mol/L BSA溶液的三維熒光光譜及等高線圖

圖6 PYM+BSA溶液的三維熒光光譜及等高線圖

表4 三維激發(fā)發(fā)射熒光光譜特征參數(shù)

圖7 BSA與PYM相互作用的CD譜圖

2.8 PYM與BSA的圓二色譜分析

為了進(jìn)一步研究PYM對BSA構(gòu)象的影響，運用圓二色譜進(jìn)行分析，PYM與BSA相互作用的結(jié)果如圖7所示。從圖9的結(jié)果可知：BSA分子的CD譜分別在208nm和222nm處具有雙負(fù)峰形，這是典型的α-螺旋結(jié)構(gòu)，隨著PYM加入到BSA中的比例增大，BSA分子在208 nm和222 nm這兩處的負(fù)峰所表示的摩爾橢圓率顯著降低，但是光譜的峰位置并沒有改變，CD的測量結(jié)果用平均摩爾橢圓率（mean residue ellipticity，MRE）表示，單位是 deg·cm2/dmol，α-螺旋結(jié)構(gòu)的含量用下列方程根據(jù)在208 nm處的MRE 值（MRE208）[14]計算，公式如下：

式中：θ——CD譜測得的摩爾橢圓率，mdeg；

N——BSA中氨基酸殘基個數(shù)，583；

L——所用樣品池的光程，1mm；

C——蛋白質(zhì)的摩爾濃度，mol/L；

MRE208——208nm的平均摩爾橢圓率；

4000——β－折疊和無規(guī)卷曲構(gòu)象跨過208nm的MRE；

33000——純α-螺旋在208nm的MRE。

由式（9）與式（10）計算結(jié)果知，在游離態(tài)的BSA中，α-Helix含量為52.32%，當(dāng)BSA與PYM的濃度比為 1∶1 時，α-Helix含量為 45.22%，濃度比為 1∶5 時，α-Helix含量為 40.12%，在加入 PYM后 BSA的α-Helix含量均發(fā)生了降低。PYM與BSA之間結(jié)合主要是多肽鏈的氨基酸殘基相結(jié)合，結(jié)果說明PYM與BSA的結(jié)合破壞了原有的蛋白質(zhì)的氫鍵結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致疏水性降低，肽鏈伸展，使α-螺旋結(jié)構(gòu)含量降低。說明BSA在運輸PYM時不僅改變了氨基酸的微環(huán)境，還使BSA的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。

3 結(jié)束語

實驗表明：氨基比林對BSA的猝滅作用是靜態(tài)猝滅， 由熱力學(xué)公式得出的 ΔrHm＜0；ΔrSm＜0；ΔrGm＜0說明PYM與BSA之間的主要作用力是氫鍵和范德華力，而且是一個自發(fā)的過程。由同步熒光光譜圖以及三位熒光光譜圖可知，PYM對BSA的結(jié)合位點更接近于色氨酸殘基，而且隨著PYM的加入引起B(yǎng)SA中酪氨酸殘基、色氨酸殘基所處的環(huán)境極性增強，表明BSA的構(gòu)象發(fā)生改變。通過PYM與BSA圓二色譜分析得出在加入PYM后BSA的α-Helix含量均發(fā)生了降低，PYM與BSA之間結(jié)合主要是多肽鏈的氨基酸殘基相結(jié)合，結(jié)果說明PYM與BSA的結(jié)合破壞了原有的蛋白質(zhì)的氫鍵結(jié)構(gòu)。這些探索能夠幫助了解PYM的作用機理，PYM的毒副作用，為PYM的進(jìn)一步探索做了鋪墊。

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（編輯：莫婕）

Study on the interaction between aminopyrine and bovine serum albumin by three-dimensional fluorescence spectrometry and circular dichroism spectrum

WANG Xiaoxia， LI Songbo， MA Litong， GUO Guibao， LIU Jinyan， WANG Zhengde， YAN Hui
（School of Chemistry and Chemical Engineering，Inner Mongolia University of Science and Technology，Baotou 014010，China）

The interaction between aminopyrine （PYM） and bovine serum albumin （BSA）were investigated with fluorescence spectroscopy， three-dimensional fluorescence spectroscopy， circular dichroism （CD） spectrum and under imitated physiological conditions.The results show that PYM could strongly quenching the fluorescence of BSA and the quenching process is a static process.The thermoclynamic parameters demonstrated that PYM can spontaneously bind with BSA through hydrogen bonds and Van der Waals forces.The binding distance of 2.09 nm between PYM and BSA was obtained by the F?rster’s theory on resonance energy transfer.Three-dimensional fluorescence spectroscopy and circular dichroism （CD） spectrum show that PYM could change the miro-enviroment and conformation of BSA.

aminopyrine； bovine serum albumin； fluorescence quenching； three-dimensional fluorescence spectroscopy；circular dichroism spectrum

A

1674-5124（2017）09-0074-07

10.11857/j.issn.1674-5124.2017.09.014

2017-01-10；

2017-03-23

國家自然科學(xué)基金（21463016）；內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金（2013MS0209）；內(nèi)蒙古高等學(xué)?？茖W(xué)研究項目（NJZZ14160）

王曉霞（1984-），女，內(nèi)蒙古包頭市人，講師，碩士，研究方向為熒光光譜分析。