構巢曲霉錳過氧化物酶轉化子菌株對6種染料的脫色1)

張健 池玉杰 于存

(東北林業(yè)大學，哈爾濱，150040)

構巢曲霉錳過氧化物酶轉化子菌株對6種染料的脫色1)

張健 池玉杰 于存

(東北林業(yè)大學，哈爾濱，150040)

為了獲得構巢曲霉(Aspergillusnidulans)錳過氧化物酶轉化子菌株TN02A7-Lg-mnp2對不同染料的脫色效果。用分光光度法對酶活性檢測的丙二酸鈉緩沖溶液的pH進行了優(yōu)化篩選，用單因素和正交試驗對產酶條件進行了優(yōu)化；檢測了優(yōu)化后的酶液對達旦黃、孔雀石綠、中性紅、剛果紅、曲利本藍和結晶紫的脫色效果。菌株酶液對偶氮類的達旦黃、三苯基甲烷類的孔雀綠和雜環(huán)類的中性紅都有顯著的脫色效果，在1 h時脫色率分別為達94.41%、91.43%和90.00%，在16 h時脫色率分別為98.36%、100%和96.47%。酶液對雙偶氮的剛果紅和曲利本藍也有不錯的脫色效果，在16 h的脫色率分別為96.76%和89.39%。對三苯基甲烷類的結晶紫的脫色效果相對較弱，在16 h的脫色率為67.31%。最終結果表明，菌株TN02A7-Lg-mnp2的酶液對多種染料都有很強的脫色能力，在染料廢水處理方面具有極強的應用前景。

構巢曲霉；錳過氧化物酶；轉化子；染料脫色

染料廢水是主要的水體污染源和有害工業(yè)廢水之一，主要來源于染料及其中間體生產和紡織印染行業(yè)，由各種產品和中間體結晶的母液、生產過程中流失的物料及沖刷地面的污水等組成。根據化學結構的特征基團合成染料可分為偶氮、蒽醌、靛旋、酞菁、硫化、硝基和亞硝基、甲川、三芳基甲烷、雜環(huán)、二苯乙烯等類別。自1856年第一個合成染料“苯胺紫”問世以來，染料制備工業(yè)迅速發(fā)展，合成染料廣泛應用于紡織業(yè)、造紙業(yè)、食品、醫(yī)藥、化妝品、攝影、橡膠、涂料、油墨和制革等行業(yè)[1]。據統(tǒng)計合成染料在生產和使用過程中，約12%以廢水形式釋放到環(huán)境中[2-4]，其內含多種有毒物質，有色度高、成分復雜、化學需氧量高、化學性質穩(wěn)定、可生化性差、生物毒性大等特點，對人體和其他生物具有致畸、致癌、致突變等作用[5]，對生物的健康與生態(tài)環(huán)境造成了極大的威脅和嚴重危害。目前，世界上對染料廢水的處理方法主要有物理化學法、物理吸附法、化學法、生化法和生物法等[6]。其中生物法是利用微生物菌體的吸附作用和酶的降解作用從而凈化廢水中污染物的方法。生物法由于處理費用低、環(huán)境友好、無二次污染、操作簡單等優(yōu)點，受到了廣泛地關注，其中真菌對染料的脫色研究最為廣泛[7-8]。白腐真菌分泌的錳過氧化物酶(MnPs)對于木質素結構相似的染料等有機污染物具有降解能力，白腐菌的mnp2基因已轉入到了構巢曲霉尿嘧啶尿苷營養(yǎng)缺陷菌株TN02A7中，獲得了轉化子菌株TN02A7-Lg-mnp2。本研究在此基礎上先對該菌株的產酶條件進行了優(yōu)化篩選，然后用優(yōu)化后的酶液對達旦黃、孔雀石綠、中性紅、剛果紅、曲利本藍和結晶紫6種染料進行了脫色研究，目的是搞清構巢曲霉轉化子菌株TN02A7-Lg-mnp2的酶液對多種染料的脫色能力與該菌株在染料工業(yè)廢水脫色中的潛能。

1 材料與方法

1.1 菌種來源、培養(yǎng)基與菌種復壯

白腐菌mnp2基因的構巢曲霉轉化子菌株TN02A7-Lg-mnp2，由東北林業(yè)大學森林保護學科森林病蟲病理實驗室提供，于冰箱內4 ℃的MMPGRT固體平板培養(yǎng)基上保存。取出后，在室溫下靜置24 h，先接種在新鮮的MMPGRT平板培養(yǎng)基上，于37 ℃下培養(yǎng)，對菌株進行第1次復壯，然后再接種在MMPGRT平板培養(yǎng)基上進行第2次復壯，此時一般3～4 d即可長滿平板，菌種活力最強，為后續(xù)試驗菌株。

MMPGRT培養(yǎng)基：20×Salts(NaNO3120.0 g，KCl 10.4 g，KH2PO430.4 g，MgSO4·7H2O 10.4 g，蒸餾水定容至1 000 mL)50.0 mL，微量元素(ZnSO4·7H2O 22.0 g，H3BO311.0 g，MnCl2·4H2O 5.0 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 5.0 g，CoCl2·5H2O 1.6 g，CuSO4·5H2O 1.6 g，(NH4)6MO7O24·4H2O 1.1 g，EDTA 50.0 g，蒸餾水定容至1 000 mL)1.0 mL，100%甘油10.0 mL，吡哆醇0.5 mg，核黃素2.5 mg，蘇氨酸11.9 g，固體培養(yǎng)基需加入20.0 g·L-1瓊脂粉，調pH至6.5[9]。

1.2 初始培養(yǎng)與MnP活性檢測

在三角瓶(100 mL)中加入50 mL的MMPGRT培養(yǎng)液，產酶底物為青楊木屑2.0 g，pH=6.5，高壓滅菌20 min，將2個φ=10 mm菌塊接入，在37 ℃、220 r·min-1下?lián)u床培養(yǎng)，分別在0、24、48、72、96、120、144、168 h時提取培養(yǎng)液即酶液500 μL，6 000 r·min-1離心5 min，取上清液測酶活性。測定體系1 mL，其中丙二酸鈉緩沖液(50 mmol·L-1，pH=4.5)840 μL，MnSO4(10 mmol·L-1)50 μL，2,6-DMP(10 mmol·L-1)50 μL，酶液樣品50 μL，H2O2(10 mmol·L-1)10 μL，以1 000 μL去離子水作為對照，以470 nm處1 min內吸光度OD值的變化作為MnP活性值[10-11]。上述條件下，每分鐘催化1 μmol 2,6-DMP所需的酶量為一個酶活單位(U·L-1)。酶活計算公式，MnP活力=[106×V1×ΔA×N]/[V2×ε470×Δt]。式中：V1為反應總體積；V2為酶液的體積；N為酶液稀釋倍數；ε為摩爾消光系數，ε470=49 600 mol·L-1·cm-1；Δt為反應時間；ΔA為反應時間內吸光度的變化增量值。

1.3MnP活性檢測中丙二酸鈉緩沖液最適pH的篩選

在初始條件下對轉化子菌株進行培養(yǎng)，72 h后提取酶液。在酶活測定中，稱取一定量的丙二酸溶于去離子水中，然后用NaOH溶液來調節(jié)pH，配制一系列不同pH的50 mmol·L-1丙二酸鈉緩沖液，使其pH值分別為2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0。用這些緩沖液替代原來pH=4.5的緩沖液后測定酶活力，以pH為橫坐標，以相對酶活力為縱坐標作圖(以酶活最高者為100%)。每組做3次重復。從中篩選出酶活性最高的緩沖液pH。

1.4 TN02A7-Lg-mnp2產MnP培養(yǎng)條件的優(yōu)化

1.4.1 最適產酶溫度的單因素試驗

為了確定產酶的最適培養(yǎng)溫度，在適于菌株生長和產酶的溫度范圍內選取27、32、37、42 ℃這4個溫度梯度在220 r·min-1下?lián)u床培養(yǎng)，分別在0、24、48、72、96、120、144、168 h時各提取500 μL培養(yǎng)液檢測酶活，對培養(yǎng)溫度進一步篩選驗證，明確菌株產酶量最高的培養(yǎng)溫度。

1.4.2 正交試驗

MnP活性受多種培養(yǎng)條件的影響，如進行多個單項單因素篩選工作量大且耗時長，所以選用正交試驗進行多因素的篩選。選取對產酶影響較大并易于控制的主要培養(yǎng)參數作為試驗因素，進行了4個培養(yǎng)因素[12-15]在3個水平下酶活性的檢測與篩選(表1)。每組試驗3個重復，在培養(yǎng)后的72 h檢測酶活值。

表1 菌株TN02A7-Lg-mnp2產MnP培養(yǎng)因素正交試驗設計

1.4.3 優(yōu)化培養(yǎng)驗證試驗

以所有優(yōu)化后的條件培養(yǎng)TN02A7-Lg-mnp2，以1.2中的初始條件培養(yǎng)作對照，3個重復，驗證優(yōu)化產酶條件的結果。

1.5TN02A7-Lg-mnp2胞外酶液對6種染料的脫色試驗

將6種染料(偶氮類的達旦黃、剛果紅和曲利本藍，雜環(huán)類的中性紅，三苯基甲烷類的孔雀綠和結晶紫)分別配制成質量濃度為50 mg·L-1的溶液，用紫外分光光度計在300～800 nm內掃描，得到吸收峰光譜圖，從中查找到最大吸收峰處的吸光值及對應的波長值，以去離子水為對照。將TN02A7-Lg-mnp2按照1.4中得到的優(yōu)化條件進行培養(yǎng)，提取72 h的培養(yǎng)液過濾掉菌絲得到胞外酶液，分設成6個試驗組和1個對照組，向試驗組的小管中先分別加入6種染料再加入酶液，使染料質量濃度均為50 mg·L-1，對照組不加任何染料只有酶液，每組3個重復，靜止，在5 min、1 h、4 h、8 h、12 h、16 h、20 h時，或達到最大脫色率為止[13]，在最大吸收峰處的波長值下測定各自染料的吸光值，取3組數據的平均值，以試驗組的吸光值減去對照組的吸光值記為Ai值，以含50 mg·L-1不同染料水溶液的吸光值減去對照組的吸光值記為A0值，以下述公式計算脫色率，脫色率=((A0-Ai)/A0)×100%。繪制6種染料脫色率隨時間的變化曲線[16]。

2 結果與分析

2.1 初始培養(yǎng)條件下MnP的活性

由圖1可知，在初始培養(yǎng)條件下，轉化子菌株TN02A7-Lg-mnp2產MnP的活性在24～72 h呈顯著升高的趨勢，72 h達到最高，為9.81 U·L-1，之后緩慢下降。

圖1 初始培養(yǎng)條件下TN02A7-Lg-mnp2的MnP活性

2.2 MnP活性檢測中丙二酸鈉緩沖液的最適pH

在不同pH的丙二酸鈉緩沖液下，菌株TN02A7-Lg-mnp2在初始條件培養(yǎng)72 h提取的相同酶液活性有顯著差異(圖2)，其中pH=3.5時酶活最高，為12.31 U·L-1(相對酶活為100%)，是最低酶活(pH=6.0)的30倍，是pH=4.5時酶活的8.3倍。因此，酶活性檢測中丙二酸鈉緩沖液的最適pH為3.5。pH=5.0～6.5酶活較低，而pH=7.0～12.0酶活略有回升。

圖2丙二酸鈉緩沖液pH對TN02A7-Lg-mnp2 MnP活性的影響

2.3 TN02A7-Lg-mnp2產MnP的優(yōu)化培養(yǎng)

2.3.1 最適產酶培養(yǎng)溫度

TN02A7-Lg-mnp2在27、32、37、42 ℃培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)液的MnP活性隨時間的變化見圖3。由圖3可知，在4個溫度梯度下產酶活性的規(guī)律相近，培養(yǎng)48～144 h都是在37 ℃下酶活最高；27、32、37 ℃酶活最高峰均出現(xiàn)在72 h，只有42 ℃酶活最高峰出現(xiàn)在96～120 h。溫度篩選結果表明，37 ℃時的酶活性整體高于其他溫度，所以37 ℃為TN02A7-Lg-mnp2產MnP的最適培養(yǎng)溫度。

圖3 TN02A7-Lg-mnp2在4種溫度下的MnP活性

2.3.2 正交試驗篩選結果

構巢曲霉轉化子菌株72 h MnP活性的9組試驗結果分別為63.51、62.10、60.69、62.10、86.09、83.27、53.63、43.75、69.15 U·L-1。由表2可知，最適培養(yǎng)條件是A2B3C3D1，即培養(yǎng)基的pH為6.5、Mn2+的濃度為267.0 μmol·L-1、搖床的轉速為220 r·min-1、血紅素質量濃度為0.05 g·L-1。極差分析表明，影響構巢曲霉轉化子菌株產MnP活性的因素由強到弱依次為培養(yǎng)液的pH、血紅素質量濃度、Mn2+的濃度和轉速。

表2 構巢曲霉轉化子菌株產MnP正交試驗結果極差分析 U·L-1

2.3.3 優(yōu)化培養(yǎng)驗證試驗結果

在優(yōu)化的培養(yǎng)條件下，即在100 mL三角瓶中加入50 mL的MMPGRT培養(yǎng)液，加入2.0 g青楊木屑作為產酶底物，0.05 g·L-1血紅素、267.0 μmol·L-1MnSO4、調節(jié)培養(yǎng)液pH到6.5、在220 r·min-1的搖床轉速下于37 ℃進行72 h培養(yǎng)，此時檢測MnP活性為91.80 U·L-1，是初始培養(yǎng)條件下MnP活性值(9.81 U·L-1)的9.36倍。

2.4 染料的脫色

利用紫外分光光度計在波長300～800 nm的區(qū)間內進行掃描，得到6種染料在最大吸收峰處的波長值分別為：達旦黃405 nm(Abs=1.212)、孔雀石綠605 nm(Abs=1.931)、中性紅529 nm(Abs=1.928)、剛果紅507 nm(Abs=2.199)、曲利本藍579 nm(Abs=0.844)、結晶紫529 nm(Abs=1.560)。在菌株TN02A7-Lg-mnp2產MnP酶量最高的72 h時提取培養(yǎng)液，對6種染料進行脫色。6種染料溶液中加入酶液的染料脫色直觀結果見圖4，染料脫色率隨時間變化結果見圖5。從圖4和圖5可見，TN02A7-Lg-mnp2的培養(yǎng)液對前5種染料都有很大程度的脫色作用，尤其對偶氮類的達旦黃、三苯基甲烷類的孔雀石綠和雜環(huán)類的中性紅脫色效果顯著，在1 h時，脫色率分別為94.41%、91.43%和90.00%，在16 h時脫色率分別為98.36%、100%和96.47%。酶液對雙偶氮的剛果紅和曲利本藍也有不錯的脫色效果，在16 h的脫色率分別為96.76%和89.39%。在20 h，酶液對達旦黃、剛果紅、中性紅和曲利本藍的脫色率分別為99.53%、99.43%、96.63%和95.19%，都在95%以上。酶液只對三苯基甲烷類的結晶紫脫色效果相對較弱，在8 h的脫色率為63.18%，在16 h的脫色率為67.31%，在20 h的脫色率為67.36%。

圖4 TN02A7-Lg-mnp2的胞外酶液對6種染料脫色的直觀效果

圖5 TN02A7-Lg-mnp2的胞外酶液對6種染料的脫色效果

3 結論與討論

本研究結果表明，優(yōu)化的培養(yǎng)條件對已轉入白腐菌L.gibbosamnp2基因的構巢曲霉轉化子菌株TN02A7-Lg-mnp2 MnP的產酶量有顯著的提高作用。TN02A7-Lg-mnp2的酶液對偶氮類的達旦黃、剛果紅和曲利本藍，三苯基甲烷類的孔雀石綠和雜環(huán)類的中性紅等多種染料都有很強的脫色能力，因此，在工業(yè)染料廢水的處理中具有極廣的應用前景。

構巢曲霉菌絲生長的最適溫度是37 ℃。最適產酶培養(yǎng)溫度試驗表明，TN02A7-Lg-mnp2產MnP的最適溫度也是37 ℃，符合轉化原理。TN02A7-Lg-mnp2酶活高峰比一般白腐菌出現(xiàn)的早，可縮短菌株培養(yǎng)時間而大大提高生產應用效率。

很多白腐菌及其產生的其他酶也具有脫色效果，不同的酶作用于不同染料脫色效果不盡相同。本研究是對構巢曲霉白腐菌mnp基因重組的菌株進行產MnP條件優(yōu)化，用其含有MnP的培養(yǎng)液進行6種不同結構染料的脫色研究，排除了白腐菌所產生的其他酶對染料的脫色作用，目的是精確地研究MnP對染料的脫色作用。

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DecolorationofSixDyesbyAspergillusnidulansManganesePeroxidaseTransformantTN02A7-Lg-mnp2//

Zhang Jian, Chi Yujie, Yu Cun

(Northeast Forestry University, Harbin 150040, P. R.China)//

Aspergillusnidulans; Manganese peroxidase; Transformant; Dye decolorization

1)黑龍江省自然科學基金面上項目(C2016006)；東北林業(yè)大學博士研究生自主創(chuàng)新基金項目(2572015AA32)。

張健，女，1992年3月生，東北林業(yè)大學林學院，碩士研究生。E-mail:1475731922@qq.com。

池玉杰，東北林業(yè)大學林學院，教授。E-mail:chiyujienefu@126.com。

2017年3月7日。

責任編輯：程 紅。

S718.81

Journal of Northeast Forestry University，2017,45(11)：99-103.

In order to find out the dye decolorization effect ofAspergillusnidulansmanganese peroxidase tranformant stain TN02A7-Lg-mnp2 which produces manganese preoxidase (MnP), the pH value of sodium malonate buffer used for enzyme activity determination was screened by spectrophotometry. The optimal culture conditions to produce MnP were optimized by single factor and orthogonal test. The decolorizing capacity of optimized culture solutions to six kinds of dyes, thiazol yellow G, malachite green, neutral red, congo red, trypan blue and crystal violet were determined by the absorbance value. The optimized extracellular MnP solution had a significant decolorizing effect to azo dye thiazol yellow G, triphenylmethane malachite green, and heterocyclic neutral red, the decolorization rate at 1 h was 94.41%, 91.43% and 90.00%, respectively, and at 16 h was 98.36%, 100%, and 96.47%, respectively. The MnP solution also had a rather good decolorizing effect to double azo dyes Congo red and trypan blue, the decolorization rate at 16 h was 96.76% and 89.39%, respectively. But the MnP solution had a relatively weaker decolorizing effect to triphenylmethane crystal violet, the decolorization rate at 16 h was 67.31%. The enzyme solution of strain TN02A7-Lg-mnp2 had strongly decoloring ability to several kinds of dyes with strong application prospect for dye wastewater treatment.