偽狂犬病及其根除：美國經(jīng)歷的回顧—PRV控制方面的早期嘗試、疫苗及診斷方法

譯校│張淼潔 劉祥 張倩 楊文歡（中國動物疫病預(yù)防控制中心）

偽狂犬病及其根除：美國經(jīng)歷的回顧—PRV控制方面的早期嘗試、疫苗及診斷方法

譯校│張淼潔 劉祥 張倩 楊文歡（中國動物疫病預(yù)防控制中心）

一、PRV控制的早期嘗試

1.檢疫隔離。偽狂犬病毒（PRV）的暴發(fā)給美國愛荷華州、印第安納州和伊利諾伊州兩個相鄰的大型豬群造成了重大損失。這促使伊利諾伊州在1975年初成立特別工作組，并呼吁召開全國性的PRV研討會。PRV研討會于1975年春季在牲畜保護(hù)學(xué)會（現(xiàn)為美國國家畜牧業(yè)學(xué)會）年會之前召開，會議地點(diǎn)設(shè)在伊利諾伊州皮奧里亞市。與會人員報告，從伊利諾伊州牲畜屠宰加工廠采集的6200份血樣中，有139份血樣的PRV檢測結(jié)果呈陽性，陽性率為2%。這139份血樣來自43個豬群。共有150～200名豬肉生產(chǎn)商、獸醫(yī)和監(jiān)管官員參與了該次研討會。會上，豬肉生產(chǎn)商要求對發(fā)現(xiàn)的PRV感染豬群進(jìn)行檢疫隔離。伊州州級獸醫(yī)Paul Doby博士提醒來自其他州的監(jiān)管官員，應(yīng)注意隔離檢疫帶來的相關(guān)問題（尤其是缺乏解除檢疫的方法）。

伊利諾伊州豬肉生產(chǎn)商協(xié)會理事會于次日召開會議，呼吁開展PRV檢疫工作。Paul Doby博士宣布將啟動檢疫隔離項目。此外，伊利諾伊州的豬肉集團(tuán)請求牲畜保護(hù)學(xué)會成立PRV常務(wù)委員會。這一請求于次日獲得牲畜保護(hù)學(xué)會理事會的批準(zhǔn)。

2. 抗血清現(xiàn)場試驗(yàn)。

（1）伊利諾伊州。為制定措施以減少PRV所造成的損失，伊利諾伊州農(nóng)業(yè)部門和對生豬行業(yè)感興趣的人士采取了若干項行動，其中有一項行動是由伊利諾伊大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院提出的。該項行動基于這樣的設(shè)想：將從感染豬群采集的超免疫抗血清注射到出生時間不超過2天的仔豬體內(nèi)，可防止仔豬感染PRV。伊利諾伊大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院為相關(guān)項目制定了一套方案。若能籌集到資金，伊利諾伊州官員計劃探索建立PRV超免疫抗血清庫，提供可能的治療方法以減少PRV損失。

該項研究由伊利諾伊州豬肉生產(chǎn)商協(xié)會資助（25000美元）。協(xié)會與伊州卡里市的一家實(shí)驗(yàn)室簽訂了一份收集和處理血清的合同。該項研究利用來自伊州比爾茲敦市某個感染豬群的12頭母豬生產(chǎn)血清。

這一抗血清項目最終生產(chǎn)出了50升PRV超免疫抗血清。項目人員根據(jù)伊利諾伊大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院制定的方案開展現(xiàn)場試驗(yàn)：同一窩豬有一半以皮下方式注射5毫升超免疫抗血清，另一半作為空白對照。伊利諾伊州農(nóng)業(yè)廳人員花費(fèi)大量時間與生豬感染群的畜主共同開展抗血清試驗(yàn)和隔離、分配、注射、收集數(shù)據(jù)、制表等工作。該項研究證實(shí)，注射超免疫抗血清使豬的死亡率降低近28%，但在經(jīng)濟(jì)上缺乏可行性。

（2）愛荷華州?？寡逶赑RV暴發(fā)時仍能發(fā)揮作用，因此被視為抗擊PRV的一種手段。作為豬瘟抗血清來源的豬通常曾接觸過PRV（PRV以非臨床形式普遍存在于豬群中）。這一事實(shí)使得關(guān)于抗血清功效的現(xiàn)場報告更加合乎邏輯。

早期嘗試生產(chǎn)抗血清期間，伊利諾伊大學(xué)通過注射活病毒（3～4次）使母豬具備超免疫性，然后將母豬麻醉并抽血。通過簡單的凝血和離心操作獲得血清。若干家生產(chǎn)商為伊利諾伊大學(xué)開展的研究提供了少量資金。這些生產(chǎn)商的設(shè)施被作為試驗(yàn)現(xiàn)場。PRV暴發(fā)期間，在新生豬免疫處理方面開展的早期嘗試并未取得顯著的成功。一位經(jīng)驗(yàn)豐富的疫苗公司代表指出，一半的豬注射血清、另一半作為空白對照可能導(dǎo)致對照組出現(xiàn)病毒復(fù)制和排出現(xiàn)象，進(jìn)而導(dǎo)致注射超免血清豬體內(nèi)的抗血清失去防護(hù)作用。這一意見獲得了項目人員的認(rèn)可。不久之后，研究證實(shí)，如果同一窩的所有豬均注射抗血清（或者采取更好的做法——若干個相鄰豬窩的所有豬均注射抗血清），抗血清將發(fā)揮非常好的防護(hù)作用。

抗血清被證明是一種有效的預(yù)防性物質(zhì)，但它最終并未投入使用。導(dǎo)致這一結(jié)果至少有兩個原因：商業(yè)公司追求開發(fā)和生產(chǎn)過程的經(jīng)濟(jì)性，一般將重點(diǎn)放在疫苗開發(fā)活動上；批準(zhǔn)這種可能含有外來病毒的產(chǎn)品會引發(fā)廣泛的擔(dān)憂，且這種產(chǎn)品缺乏實(shí)用的消毒方法。

二、疫苗診斷方法及其許可

1.歷史。20世紀(jì)70年代初，獸醫(yī)學(xué)診斷專家利用當(dāng)時可用的試驗(yàn)手段，通過剖檢、鏡檢、病毒分離和組織熒光抗體試驗(yàn)檢測活病毒。

隨著PRV的擴(kuò)散，通過生物控制和診斷試驗(yàn)檢測抗原和抗體（特別是以診斷、監(jiān)管和根除為目的快速測試大量血清標(biāo)本）成為一項迫切的需求。血清病毒中和試驗(yàn)是當(dāng)時惟一可開展的血清學(xué)試驗(yàn)。該項試驗(yàn)從開始到結(jié)束，需要3天的時間。

血清學(xué)試驗(yàn)的首次改良是利用96孔板將血清病毒中和試驗(yàn)微型化。這次改良產(chǎn)生了一項金標(biāo)準(zhǔn)——微量滴定血清病毒中和試驗(yàn)。該試驗(yàn)被認(rèn)為擁有良好的敏感性和特異性，且能夠利用倍比稀釋方法對抗體進(jìn)行量化。但是，該試驗(yàn)同樣需要消耗大量的時間和人力，特別是需要通過顯微鏡對多次反應(yīng)進(jìn)行觀察。限制了每天可測試的樣本數(shù)量。

下一項重大改良是愛德士實(shí)驗(yàn)室有限公司（緬因州，韋斯特布魯克）于1986年獲得批準(zhǔn)的篩選試驗(yàn)——ELISA（HerdChek?Anti-PRV）。ELISA用于從大量血清標(biāo)本中篩選PRV抗體，在推出之后不久就取代了血清病毒中和試驗(yàn)。ELISA可大大縮短試驗(yàn)時間，大幅提升實(shí)驗(yàn)室的處理能力，因?yàn)樗恍枰獙ρ鍢?biāo)本進(jìn)行滴定，反應(yīng)速度快，試驗(yàn)結(jié)果通過機(jī)器讀取和解釋。

隨著PRV疫苗被開發(fā)并廣泛用于豬群，人們需要將接種PRV疫苗的豬與感染PRV的豬區(qū)分開。血清病毒中和試驗(yàn)和ELISA都可以檢測PRV抗體，但無法區(qū)分疫苗抗體和野毒感染抗體。診斷專家和監(jiān)管官員最初嘗試根據(jù)血清病毒中和試驗(yàn)的抗體滴度將接種疫苗的生豬與感染生豬區(qū)分開。這種嘗試所基于的假設(shè)是，相比接種疫苗，感染野毒能產(chǎn)生更強(qiáng)烈的體液反應(yīng)。該方法將抗體滴度≤（1∶16）視為接種疫苗的結(jié)果，而不是感染的結(jié)果。但是，在任一生物系統(tǒng)中，不同豬（尤其是多次接種疫苗的豬）的抗體反應(yīng)會呈現(xiàn)差異。這意味著，許多動物和畜群會被誤判為感染或未感染。該方法在臨床上多少能發(fā)揮一些作用，但不能作為監(jiān)管決策（例如關(guān)于生豬跨州運(yùn)輸和其他監(jiān)管問題的決策）的依據(jù)。

隨著PRV在美國豬群中的持續(xù)擴(kuò)散，生物控制成為首要的需求。諾登實(shí)驗(yàn)室（內(nèi)布拉斯加州，林肯）于1977年批準(zhǔn)了首個常規(guī)弱毒活疫苗和滅活PRV疫苗?？傮w而言，PRV弱毒活疫苗之所以得到廣泛的應(yīng)用，是因?yàn)樗拿庖叻磻?yīng)和所產(chǎn)生的防護(hù)作用優(yōu)于滅活PRV疫苗。

PRV弱毒活疫苗和后續(xù)開發(fā)的二代基因缺失疫苗對于減少和防范PRV的臨床癥狀十分有效。接種PRV弱毒活疫苗的豬后續(xù)感染PRV野毒株時，病毒較少侵入組織，且妊娠母豬未將病毒傳播給胎豬。因此，該疫苗可防止流產(chǎn)。但是，接種PRV疫苗的豬感染PRV野毒株時至少排出成千的病毒，減少病毒的排出對于根除PRV至關(guān)重要。某些PRV弱毒活疫苗聚集在主要參與潛伏性感染的組織內(nèi)（三叉神經(jīng)節(jié)），進(jìn)而阻斷PRV野毒株通過重復(fù)感染實(shí)現(xiàn)潛伏的過程。

2. 疫苗和診斷方法的開發(fā)。私營企業(yè)曾針對豬群開發(fā)若干種基因缺失PRV疫苗。這些疫苗獲得了動植物檢疫署獸用生物制品中心的許可。首個基因缺失疫苗（含一套相應(yīng)的血清學(xué)鑒別診斷試驗(yàn)）在“國家PRV根除項目”啟動的前一年，即1988年獲得許可。該疫苗毒株缺失糖蛋白基因gX（gG），由SyntroVet有限公司（堪薩斯州，雷那克薩）制造。該疫苗配套的ELISA血清學(xué)鑒別診斷試驗(yàn)（HerdChek?Anti-PRV-gpX）由愛德士實(shí)驗(yàn)室有限公司開發(fā)。多家生產(chǎn)商表示，這一名為“Marker Blue”的疫苗注射到北卡羅來納州生豬密集區(qū)域的豬群體內(nèi)后產(chǎn)生了高度的防護(hù)作用。一年之后，普強(qiáng)公司（密歇根州，卡拉馬祖）獲批了一種缺失gG基因的疫苗（Tolvid?）（配套相應(yīng)的血清學(xué)鑒別診斷試驗(yàn)）。這兩種疫苗都很有效，但診斷試驗(yàn)的敏感性不夠理想。

表1列出了各類PRV疫苗、配套的鑒別診斷試驗(yàn)及其制造商和所采用的PRV毒株。

1990年，SyntroVet和IDEXX再次開展合作，推出了一種基于缺失糖蛋白基因gI（gE）的病毒開發(fā)出的新疫苗（SyntroVet PRV/Marker Gold?），含配套的ELISA血清學(xué)鑒別診斷試驗(yàn)（HerdChek?Anti-PRV-gl）。與首個基因缺失疫苗一樣，Marker Gold在實(shí)踐中表現(xiàn)出良好的功效。此外，血清學(xué)鑒別診斷試驗(yàn)的敏感性和特異性有顯著提升。

另外兩家生物制品公司也開發(fā)了缺失gE基因的疫苗。諾登實(shí)驗(yàn)室的PR-Vac?疫苗缺失天然gE基因。收購諾登實(shí)驗(yàn)室的史克必成公司于1990年開發(fā)并推出了一種血清學(xué)鑒別診斷試驗(yàn)——Clin- Ease-PRV?。勃林格殷格翰公司的PRV疫苗BioCeutic?與IDEXX開發(fā)的HerdChek?Anti-PRV-gI配套血清學(xué)鑒別診斷試驗(yàn)一起獲得許可。

PR-Vac和PRV/Marker Gold?是根除項目期間應(yīng)用最廣泛的PRV疫苗。同時，IDEXX開發(fā)的HerdChek?Anti-PRV-gI ELISA試驗(yàn)方法成為確定生豬或豬群是否接種PRV疫苗、是否感染PRV的“標(biāo)準(zhǔn)”血清學(xué)鑒別試驗(yàn)。Tolvid疫苗非常有效，但配套的gG血清學(xué)鑒別診斷試驗(yàn)缺乏敏感性，對其使用造成了限制。此外，由于行業(yè)當(dāng)時呈現(xiàn)明顯的gE基因缺失技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化的趨勢，缺失gG基因?qū)olvid疫苗而言是一種缺點(diǎn)。在豬群中同時使用gG基因缺失疫苗和gE基因缺失疫苗會造成混淆，因?yàn)榻臃NgG基因缺失疫苗的生豬會產(chǎn)生gE抗體，進(jìn)而導(dǎo)致gE血清試驗(yàn)期間接種疫苗的豬群被錯誤地認(rèn)定為感染豬群。反過來，利用gG ELISA對接種gE基因缺失疫苗的種豬進(jìn)行試驗(yàn)時，也會產(chǎn)生錯誤的診斷結(jié)果。因此，PRV根除項目要想獲得成功，必須為所有PRV疫苗確立統(tǒng)一的基因缺失標(biāo)準(zhǔn)。如果行業(yè)未能就PRV疫苗缺失哪種基因達(dá)成共識，將無法開展血清檢測。對基因缺失疫苗進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化（至少刪除表達(dá)gE的基因）的協(xié)議于1993年實(shí)施。

為檢測PRV抗體，行業(yè)開發(fā)了其他若干種血清學(xué)試驗(yàn)方法。微粒濃縮熒光免疫分析和自動化乳膠凝集試驗(yàn)是兩種在高通量診斷實(shí)驗(yàn)室得到廣泛應(yīng)用的方法。與ELISA類似，這兩種試驗(yàn)以自動化方式開展，僅耗時2個小時，具有良好的敏感性和特異性。某些實(shí)驗(yàn)室持續(xù)將自動化乳膠凝集試驗(yàn)用于篩選PRV抗體。生物制品制造商還開發(fā)了補(bǔ)體結(jié)合、免疫擴(kuò)散、對流免疫電泳、間接免疫熒光等其他若干種血清學(xué)試驗(yàn)方法，但都存在敏感性有限、耗時過長或難以實(shí)施的問題。

2005年11月3日，獸用生物制品中心批準(zhǔn)了IDEXX基于gII（gB）糖蛋白開發(fā)的新型阻斷式ELISA-PRV篩選試驗(yàn)方法。據(jù)報道，該試驗(yàn)的敏感性和特異性高達(dá)99.5%，已經(jīng)取代了HerdChek Anti-PRV篩選試驗(yàn)。

PRV根除項目的成功很大程度上要?dú)w功于開發(fā)出高效PRV疫苗和配套血清學(xué)鑒別診斷試驗(yàn)方法的科學(xué)家和診斷專家。如果沒有這些技術(shù)，這一項目根本不會存在。

表1 PRV疫苗和伴隨診斷鑒別試驗(yàn)

3.技術(shù)的實(shí)際應(yīng)用。對于從事生豬藥物工作的獸醫(yī)而言，將鑒別試驗(yàn)投入實(shí)際應(yīng)用是一項高難度的教學(xué)和輔導(dǎo)活動。首先，獸醫(yī)們必須學(xué)習(xí)關(guān)于鑒別試驗(yàn)為什么具備可行性的基礎(chǔ)理論。其次，他們必須讓生產(chǎn)商相信這一新的測試?yán)砟钍怯行У?。以往的?jīng)驗(yàn)表明，當(dāng)前使用的大多數(shù)疫苗可有效防止生豬的臨床疾病。

在疫苗的研究、開發(fā)和專利申請領(lǐng)域，科學(xué)家和動物衛(wèi)生企業(yè)之間存在激烈的競爭。這種競爭促使多種基因缺失疫苗被批準(zhǔn)并投放市場。開發(fā)這些疫苗的企業(yè)必須與開展動物診斷試驗(yàn)的企業(yè)合作，因?yàn)橹挥袠O少數(shù)的疫苗開發(fā)企業(yè)同時擁有生產(chǎn)經(jīng)批準(zhǔn)的疫苗和開發(fā)配套診斷試驗(yàn)所需的商業(yè)資產(chǎn)。

PRV根除活動初期，一些獸醫(yī)在同一豬群中使用超過一種PRV疫苗。此外，某些PRV疫苗既不具備特異性，也未開發(fā)配套的試驗(yàn)方法。使用缺失不同基因的疫苗且未能充分保存記錄的畜主發(fā)現(xiàn)，他們無法準(zhǔn)確地解釋試驗(yàn)結(jié)果，因而無法了解其豬群的狀況。

最初，生產(chǎn)商和獸醫(yī)期望試劑盒的敏感性和特異性達(dá)到100%。但是，實(shí)地條件下的經(jīng)歷表明，這一期望落空了。此外，不同系列的試劑盒的試驗(yàn)結(jié)果之間存在一些差異，而非特異性反應(yīng)要在測試數(shù)千個樣本之后才能觀測到。當(dāng)時，診斷專家、執(zhí)業(yè)獸醫(yī)和監(jiān)管官員難以對造成試驗(yàn)結(jié)果沖突的眾多原因進(jìn)行分類。這些差異會造成一定的問題，少數(shù)生產(chǎn)商和獸醫(yī)最初以此為由拒絕全面采用這一新技術(shù)。

4.小步前進(jìn)。率先理解這一技術(shù)并將其成功運(yùn)用于豬群凈化方案的人士經(jīng)常受到批評。這些人通常擁有自己的豬群，并利用自己的豬群來證明相關(guān)疫苗及配套診斷試驗(yàn)的效果。在學(xué)習(xí)過程中，很多人都有過“前進(jìn)兩步、后退一步”的經(jīng)歷。生豬行業(yè)的領(lǐng)導(dǎo)者通過召開論壇，對該技術(shù)應(yīng)用的成敗進(jìn)行探討。存在競爭關(guān)系的科學(xué)家和動物衛(wèi)生公司的參與增加了這些討論活動的復(fù)雜性。他們每個人都在鼓吹自己的技術(shù)優(yōu)勢。論壇的參與者定期匯報田間案例，并對其進(jìn)行討論。

關(guān)于成功案例的報告開始在生豬行業(yè)內(nèi)傳播，批評者甚至也開始注意到該技術(shù)在應(yīng)用方面所取得的進(jìn)展。隨著試驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展及各種試驗(yàn)方法的敏感性和特異性的提高，評估豬群凈化方案的能力也有所提升。隨著實(shí)踐中應(yīng)用數(shù)量的增加，這些產(chǎn)品開始證明哪些技術(shù)實(shí)現(xiàn)了疾病防控（疫苗）和實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性（診斷方法）的最佳結(jié)合。這些“優(yōu)勝”的技術(shù)逐漸成為生豬行業(yè)的首選。

5.逐個完成。完成豬群凈化活動的例子有很多。將完成此類活動所需的各個步驟整理成名為“豬群凈化方案”的書面材料是一種普遍的做法。通過研究凈化感染豬群的實(shí)例，可以更好地理解這一過程。

（1）初步聯(lián)系。豬群的主治獸醫(yī)聯(lián)系疫苗公司的技術(shù)服務(wù)獸醫(yī)前往某個PRV凈化進(jìn)度不如預(yù)期的豬群進(jìn)行調(diào)查，并開展合作。

（2）現(xiàn)場訪問。技術(shù)服務(wù)獸醫(yī)和主治獸醫(yī)審核驗(yàn)血結(jié)果和該豬群使用的PRV疫苗的品牌名稱。

（3）分析。技術(shù)服務(wù)獸醫(yī)和主治獸醫(yī)確認(rèn)，該豬群過去4年使用了兩個品牌、缺失不同基因的PRV疫苗，其中一些年齡較大的生豬這兩種疫苗都使用過；該豬群過去2年只使用了一種疫苗；盡管使用了疫苗，該豬群仍存在感染PRV的情況。

（4）養(yǎng)殖場訪問。訪問養(yǎng)殖場期間，技術(shù)服務(wù)獸醫(yī)和主治獸醫(yī)對畜主當(dāng)前的操作方法進(jìn)行觀察。此外，他們還檢查了疫苗接種記錄和動物標(biāo)識的完整性。

（5）初步行動計劃。豬群管理人員識別出所有年齡大于2周歲的生豬，并在下一窩豬斷奶之后將這些生豬出售，供宰殺。

（6）豬群重新接種疫苗。對整個豬群進(jìn)行評估，確保所有生豬在過去90天均已接種疫苗。管理人員將沒有標(biāo)識的生豬出售，供宰殺。

（7）檢測并挑選結(jié)果呈陰性的動物。對所有年齡小于2周歲、大于3個月的生豬進(jìn)行檢測，以確定野毒感染的血清學(xué)狀況。如果某一豬只的測試結(jié)果呈陽性，該豬只將被盡快出售，供宰殺。血清反應(yīng)呈陽性的豬只不會被用來交配。管理人員采取較為激進(jìn)的措施清除曾注射兩種不同品牌的基因缺失疫苗、感染PRV以及年齡較大的豬只。

（8）隔離。技術(shù)服務(wù)獸醫(yī)和主治獸醫(yī)建議，將年齡較大的豬只與年齡較小的豬只隔離。

（9）選擇并使用同一品牌的疫苗。技術(shù)服務(wù)獸醫(yī)和主治獸醫(yī)提倡利用缺失同一種基因的疫苗產(chǎn)品繼續(xù)開展疫苗接種工作。此外，這些咨詢?nèi)藛T還建議，每90天對所有豬只開展一次疫苗接種工作，以盡量提高免疫性、盡量減少病毒的排出量。

（10）跟蹤計劃。在開展豬群凈化90天后對年齡較小的豬只進(jìn)行統(tǒng)計抽樣，并在咨詢?nèi)藛T的建議下開展分析工作，旨在更好地評估病毒在年齡較小、易受影響、接種疫苗的豬只之間的傳播情況。這種分析還被用于向畜主證實(shí)凈化項目已取得的進(jìn)展。

（11）評估。如統(tǒng)計樣本對野毒抗體的反應(yīng)呈陰性，豬群凈化方案不作變更。如任一樣本的血清反應(yīng)呈陽性，咨詢?nèi)藛T將對豬群凈化方案進(jìn)行二次評估，明確方案的缺點(diǎn)并進(jìn)行相應(yīng)調(diào)整。

（12）區(qū)域評估。技術(shù)服務(wù)獸醫(yī)和主治獸醫(yī)對區(qū)域內(nèi)的豬群密度進(jìn)行評估，以確定豬群接觸來自相鄰豬群的PRV的風(fēng)險。地區(qū)監(jiān)管官員也參與決策過程，并為地區(qū)風(fēng)險評估提供協(xié)助。

（13）完成。PRV通常在豬群凈化方案啟動兩年內(nèi)被清除。

每個豬群都面臨著一系列挑戰(zhàn)。某些時候，管理方法必須接受評估并進(jìn)行多次變更。養(yǎng)殖場的雇員必須就如何實(shí)施各豬群凈化方案的各個步驟接受教育和輔導(dǎo)。畜主對成功實(shí)施豬群凈化方案的積極性存在差異。一位成功的獸醫(yī)能了解所有這些不斷變化的挑戰(zhàn)。

豬群有時會出現(xiàn)意想不到的問題。管理人員在評估和監(jiān)督過程中發(fā)現(xiàn)許多令人瞠目結(jié)舌的事件，例如心懷不滿的雇員將疫苗倒入糞池。分析發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)殖場的自來水中含有高濃度的氯，用這些自來水清洗注射器導(dǎo)致弱毒活疫苗失去活性。這些事件使人們關(guān)注到所有細(xì)節(jié)的重要性。

此外，試驗(yàn)期間偶爾會發(fā)現(xiàn)某一豬群只有一頭豬的試驗(yàn)結(jié)果呈陽性（又稱“個例”）。 有時對處死的豬只進(jìn)行組織分析，發(fā)現(xiàn)其并未感染PRV。類似的意料之外的結(jié)果很少出現(xiàn)，但提醒人們：不同豬只之間的生物差異性也需要納入考慮范疇。

6.基因缺失疫苗和診斷試劑盒的許可。PRV疫苗和診斷試劑盒在美國是依據(jù)《病毒-血清-毒素法案》（1913）（1985年修訂版）接受監(jiān)管的獸用生物產(chǎn)品。該法案規(guī)定，出售無效、受污染、危險或有害的獸用生物制品屬非法行為，在美國境內(nèi)或從美國運(yùn)輸?shù)墨F用生物制品必須是在經(jīng)批準(zhǔn)的設(shè)施內(nèi)按美國農(nóng)業(yè)部法規(guī)制備的產(chǎn)品。將這些產(chǎn)品投放美國市場之前，企業(yè)必須為其生產(chǎn)設(shè)施獲取“美國獸用生物制品公司許可證”，并為其生產(chǎn)的每一種產(chǎn)品獲取“美國獸用生物產(chǎn)品許可證”。

（1）疫苗的通用許可要求。某一經(jīng)批準(zhǔn)的獸用生物制品公司如想為某個PRV弱毒活疫苗獲取獸用生物產(chǎn)品生產(chǎn)許可證，必須向動植物檢疫署獸用生物制品中心提交獸用生物產(chǎn)品許可證申請，并出示生產(chǎn)數(shù)據(jù)和支持性數(shù)據(jù)為產(chǎn)品申請?zhí)峁┲С?。生產(chǎn)大綱是產(chǎn)品制造和試驗(yàn)所依據(jù)的具體方案。

申請企業(yè)必須根據(jù)生產(chǎn)大綱提供數(shù)據(jù)證明產(chǎn)品的純度、安全性和功效。將主毒種作為疫苗生產(chǎn)所用的所有毒種的來源有助于保持生產(chǎn)活動的統(tǒng)一性。主毒種連續(xù)傳代的限定次數(shù)為5次。獸用生物制品中心的人員負(fù)責(zé)確保主毒種、主細(xì)胞庫、原代細(xì)胞、動物源性成分和最終產(chǎn)品根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)程序接受測試。產(chǎn)品的免疫原性必須通過具有統(tǒng)計有效性的動物疫苗接種和攻毒試驗(yàn)（通常采用20頭接種疫苗的生豬和5頭對照組生豬）予以證明。疫苗接種必須在生產(chǎn)大綱規(guī)定的年齡最小的動物身上實(shí)施，并采用最低數(shù)量的抗原。產(chǎn)品應(yīng)采用主毒種繁殖的最高代次的毒種生產(chǎn)。申請企業(yè)必須確定產(chǎn)品標(biāo)簽顯示的各個成分的功效。具體的攻毒方法和作用確定保護(hù)力的標(biāo)準(zhǔn)隨免疫原的變化而變化。每一系列產(chǎn)品被許可之前，獸用生物制品中心的人員還會要求測定產(chǎn)品的效價。

安全測試結(jié)合了一系列研究工作。產(chǎn)品一般以10倍劑量在動物宿主體內(nèi)使用以接受評估?；钜呙绠a(chǎn)品必須進(jìn)行特征化處理，以確定其是否有能力從宿主體內(nèi)排出，進(jìn)而傳播至與宿主接觸的動物體內(nèi)。為了解遺傳穩(wěn)定性及實(shí)踐中疫苗注入動物體內(nèi)的預(yù)期結(jié)果，需開展直腸研究。

表2 獲得許可的基因改造PRV疫苗

一旦實(shí)驗(yàn)室完成特征化研究，即可以獲得額外的安全數(shù)據(jù)為目的開展田間試驗(yàn)。田間安全試驗(yàn)的設(shè)計目的是檢測產(chǎn)品開發(fā)期間未觀察到的意外反應(yīng)。相關(guān)試驗(yàn)在動物宿主體內(nèi)開展，分布在各類場所，使用大量易感的動物。試驗(yàn)動物應(yīng)能代表擬使用相關(guān)產(chǎn)品的所有年齡階層和飼養(yǎng)方法。

獲得生產(chǎn)許可證的企業(yè)需在其經(jīng)批準(zhǔn)的設(shè)施內(nèi)根據(jù)批準(zhǔn)的生產(chǎn)大綱連續(xù)生產(chǎn)3個批次符合要求的產(chǎn)品，并將主毒種、主細(xì)胞庫和這些批次產(chǎn)品的標(biāo)本發(fā)送給獸用生物制品中心的實(shí)驗(yàn)室以接受許可前測試，以確認(rèn)企業(yè)的試驗(yàn)結(jié)果。

申請企業(yè)滿足所有要求（包括標(biāo)簽、宣傳資料的審核和驗(yàn)收方面的要求）之后，獸用生物制品中心發(fā)放“美國獸用生物產(chǎn)品許可證”。

（2）基因缺失疫苗的其他要求。獸用生物制品中心認(rèn)為，重組體衍生的弱毒活疫苗與常規(guī)方法生成的疫苗之間沒有重大差異。因此，該中心認(rèn)為現(xiàn)有法律法規(guī)適用于新型基因改造PRV疫苗，并要求這些疫苗滿足上文描述的適用于常規(guī)疫苗的純度、安全性和功效許可標(biāo)準(zhǔn)。但是，《國家環(huán)境政策法案》則要求，為這些基因改造活疫苗申請許可證的企業(yè)在疫苗被放行之前開展研究工作，評估這些疫苗對人類環(huán)境可能產(chǎn)生的所有影響。需開展的調(diào)查活動包括通過研究描述重組微生物的生物化學(xué)特性，評估其在體內(nèi)外的遺傳穩(wěn)定性，檢查其在宿主體內(nèi)的組織嗜性或毒性是否有任何變化，評估其從宿主體內(nèi)排出并擴(kuò)散至靶宿主和非靶宿主的可能性，評估其在環(huán)境中持續(xù)生存的能力，檢查其與類似的微生物野毒株進(jìn)行重組的可能性。在產(chǎn)品投入現(xiàn)場試驗(yàn)或獲得許可證之前，獸用生物制品中心的人員利用來自這些研究活動的數(shù)據(jù)，根據(jù)《國家環(huán)境政策法案》開展風(fēng)險分析，為環(huán)境評估做準(zhǔn)備。《國家環(huán)境政策法案》的程序還要求，該中心通過《聯(lián)邦公報》公示其擬開展的所有重組體微生物許可。

針對首類基因改造疫苗（缺失PRV基因組中的兩個基因），企業(yè)在獲準(zhǔn)開展田間試驗(yàn)之前必須滿足《國家環(huán)境政策法案》的要求。為確定該基因?qū)θ祟惌h(huán)境的安全性，企業(yè)需通過開展研究工作證明：

①基因改造PRV活疫苗病毒無毒性，完全有能力引發(fā)使生豬免于感染PRV的免疫反應(yīng)，但無法誘導(dǎo)產(chǎn)生gG抗體。因此，感染生豬與接種疫苗的生豬之間存在血清學(xué)差異。②接種疫苗的生豬或哨兵動物的鼻拭子無法證明這種由重組體DNA技術(shù)產(chǎn)生的疫苗病毒發(fā)生了傳播。③接種重組疫苗可減少野毒株的復(fù)制和排出現(xiàn)象。因此，這種疫苗可減少烈性病毒在環(huán)境中的傳播。④缺失TK基因是疫苗病毒的一個穩(wěn)定特性，這種缺失出現(xiàn)逆轉(zhuǎn)的可能性基本為零。⑤PRV野毒株在自然界分布廣泛，且不含致癌基因或致癌物質(zhì)。由于不含任何新的遺傳信息，病毒所產(chǎn)生的重組體不可能具有致癌性。⑥PRV野毒株對人類無致病性。缺失兩個基因是重組體衍生的疫苗與PRV野毒株存在的惟一區(qū)別。因此，重組體衍生的疫苗也被認(rèn)為對人類無致病性。⑦生產(chǎn)該疫苗的企業(yè)制備并進(jìn)行特征化處理的主毒種與親株的生物性質(zhì)相同。向獸用生物制品中心提交的數(shù)據(jù)確立了用于制備實(shí)驗(yàn)疫苗的兩個病毒庫之間的相互關(guān)系。在此基礎(chǔ)上，獸用生物制品中心確定重組體衍生的活病毒疫苗的田間試驗(yàn)不會對人類環(huán)境產(chǎn)生重大影響。

除評估整體安全性之外，現(xiàn)場研究還包括評估該疫苗對公豬的精子質(zhì)量、母豬和幼年母豬的生殖能力及在自然環(huán)境下飼養(yǎng)的架子豬的感染率和長勢的影響?，F(xiàn)場研究結(jié)束且數(shù)據(jù)表明安全性符合要求之后，獸用生物制品中心在《聯(lián)邦公報》發(fā)布第二份公告，并在環(huán)境評估中考慮預(yù)示該產(chǎn)品將獲得許可證的田間試驗(yàn)結(jié)果。重組體后續(xù)衍生的PRV疫苗（見表2）的許可工作重復(fù)這一過程。通過選擇天然突變的病毒開發(fā)出的疫苗以常規(guī)疫苗的身份獲得許可。

（3）診斷方法通用許可要求。診斷產(chǎn)品的許可在申請、證明材料和程序方面與上文針對常規(guī)疫苗描述的內(nèi)容一致，區(qū)別在于支持性數(shù)據(jù)必須涉及多項問題。診斷產(chǎn)品的數(shù)據(jù)必須證明產(chǎn)品的敏感性、特異性、耐用性、重復(fù)性、適用性及預(yù)測值。此類數(shù)據(jù)通過將新的診斷試驗(yàn)方法與當(dāng)前的“金標(biāo)準(zhǔn)”進(jìn)行對比來獲得對高度特征化的參考標(biāo)本（來自至少20只動物）進(jìn)行測試，標(biāo)本取自PRV測試結(jié)果呈陰性的動物（未被感染的動物）、PRV測試結(jié)果呈強(qiáng)陽性的動物、PRV測試結(jié)果呈弱陽性的動物、所產(chǎn)生的分析值在閾值周圍的標(biāo)本，對密切相關(guān)的抗原（可能是交叉反應(yīng)性抗原）有反應(yīng)的動物或接種疫苗的動物及只對多抗原反應(yīng)性檢測試劑盒中的某一個或某一組抗原有反應(yīng)的動物。

（4）PRV診斷試驗(yàn)的審批。隨著防止PRV擴(kuò)散的生豬跨州流動法規(guī)的發(fā)布，經(jīng)批準(zhǔn)的PRV診斷試驗(yàn)被要求只在經(jīng)批準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)開展。因此，獸用生物制品中心批準(zhǔn)某項PRV診斷試驗(yàn)方法并不會自動授權(quán)相關(guān)機(jī)構(gòu)在生豬跨州流動的官方測試中采用該方法。除獲得許可證之外，PRV診斷試驗(yàn)還需獲得動植物檢疫署國家獸醫(yī)服務(wù)實(shí)驗(yàn)室人員的審批推薦，并獲得動植物檢疫署國家動物衛(wèi)生項目中心的批準(zhǔn)，動植物檢疫署同時也是聯(lián)邦負(fù)責(zé)發(fā)布《州-聯(lián)邦-行業(yè)PRV根除項目標(biāo)準(zhǔn)》的機(jī)構(gòu)。

表3 20世紀(jì)90年代中期獲得許可的PRV鑒別試驗(yàn)方法

PRV診斷試驗(yàn)批準(zhǔn)程序的設(shè)計目的是為該試驗(yàn)的潛在用戶提供體驗(yàn)產(chǎn)品的機(jī)會，并使合作方能更可靠地確定疫苗產(chǎn)品能否按標(biāo)簽上描述的內(nèi)容發(fā)揮作用，并在各類指定現(xiàn)場條件下和不同實(shí)驗(yàn)室內(nèi)產(chǎn)生一致的、可再現(xiàn)的結(jié)果。為此，制造商負(fù)責(zé)開展田間試驗(yàn)，并將結(jié)果上報給美國獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室診斷專家協(xié)會、美國動物衛(wèi)生協(xié)會和國家獸醫(yī)服務(wù)實(shí)驗(yàn)室。同時，制造商要向至少3個位于美國不同地區(qū)的實(shí)驗(yàn)室提供試劑盒，比對金標(biāo)準(zhǔn)測試參考標(biāo)本和實(shí)地標(biāo)本。國家獸醫(yī)服務(wù)實(shí)驗(yàn)室、美國獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室診斷專家協(xié)會與國家動物衛(wèi)生項目中心、獸用生物制品中心共同審核這些實(shí)驗(yàn)室提供的與產(chǎn)品在PRV根除項目中的潛在用途有關(guān)的數(shù)據(jù)。如符合前述設(shè)計目的，相關(guān)試驗(yàn)方法將獲得審批推薦，國家動物衛(wèi)生項目中心將通過《聯(lián)邦公報》發(fā)布公告告知利益相關(guān)方：該方法被批準(zhǔn)用于經(jīng)批準(zhǔn)的PRV根除項目官方檢測實(shí)驗(yàn)室。

PRV鑒別試驗(yàn)的批準(zhǔn)程序還要求試驗(yàn)方法能將接種疫苗的生豬與感染野毒株的生豬區(qū)分開。此外，試驗(yàn)方法應(yīng)：僅用于接種相關(guān)官方批準(zhǔn)的基因改造疫苗的豬群；用于對豬群（而非單頭生豬）進(jìn)行診斷；在經(jīng)國家獸醫(yī)服務(wù)實(shí)驗(yàn)室批準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室實(shí)施。

首個PRV鑒別試驗(yàn)方法于1988年8月1日獲得批準(zhǔn)，并于1990年5月9日成為供PRV根除項目使用的“經(jīng)批準(zhǔn)的PRV鑒別試驗(yàn)方法”。截至20世紀(jì)90年代中期，已有5個PRV鑒別試劑盒獲得許可，其中2個PRV鑒別試劑盒獲得批準(zhǔn)用于根除項目（見表3）。