PSMA6/PSMC6/PSMA3基因多態(tài)性與系統(tǒng)性紅斑狼瘡發(fā)病的相關(guān)性

劉蘭婷 王 玉 宋繼權(quán) 裴 颯 歐運(yùn)超

·論著·

PSMA6/PSMC6/PSMA3基因多態(tài)性與系統(tǒng)性紅斑狼瘡發(fā)病的相關(guān)性

劉蘭婷1王 玉2宋繼權(quán)1裴 颯1歐運(yùn)超1

目的明確蛋白酶體(PSM)相關(guān)基因單核苷酸多態(tài)性與中國(guó)人群系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)的相關(guān)性。方法PCR擴(kuò)增101例SLE患者和143名正常對(duì)照者外周血目的基因片段,通過二代測(cè)序?qū)δ康幕蚱芜M(jìn)行測(cè)序檢測(cè)蛋白酶體20 s亞單位和相關(guān)ATP酶基因的4個(gè)目標(biāo)位點(diǎn)PSMA6(rs2277460)，PSMA3(rs2348071)，PSMC6(rs2295826，rs2295827)的基因型及等位基因頻率。結(jié)果SLE組及對(duì)照組中rs2277460(GG,GA、AA)基因型頻率分別為97.22%,1.85%%,0.93%和96.5%，3.5%，0；rs2348071AA，AG，GG分別為30.56%、53.7%、15.74%和33.57%、50.35%、16.08%；rs2295826AA，AG，GG分別為75.93%、24.07%、0和69.23%、29.37%、1.4%；rs2295827CC、CT、TT分別為78.7%、19.45%、1.85%和76.22%、20.98%、2.8%，均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Pgt;0.05)。結(jié)論P(yáng)SMA6/PSMC6/PSMA3 SNPs可能與SLE的發(fā)病無關(guān)。

系統(tǒng)性紅斑狼瘡； 蛋白酶體； ATP酶； 單核苷酸基因多態(tài)性

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus, SLE)是一種復(fù)雜的自身免疫性疾病，以產(chǎn)生非器官特異性的自身抗體，免疫復(fù)合物沉積及多系統(tǒng)損害為特征，具有多種臨床表現(xiàn)[1]。其發(fā)病率約為(7.4～159.4)/10萬人。該疾病常進(jìn)行性加重，不能根治，預(yù)后不良，是危害健康的重要公共衛(wèi)生問題，因此SLE發(fā)病機(jī)制的研究也是皮膚科疾病、代謝疾病、風(fēng)濕疾病等領(lǐng)域研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。

SLE是一種高度遺傳異質(zhì)性疾病，其發(fā)病機(jī)制可以涉及細(xì)胞與體液免疫多個(gè)環(huán)節(jié)的異常。有證據(jù)表明泛素化在免疫應(yīng)答的過程中發(fā)揮了重要作用[2]。在一些自身免疫性疾病及代謝性疾病中，均存在NF-kB通路的異常激活，以及前炎癥因子的轉(zhuǎn)錄異常，已知泛素化NF-kB轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的重要方式。其中，已證實(shí)編碼泛素蛋白連接酶的基因UBC2L3在SLE中存在基因多態(tài)性[3]。有研究報(bào)道編碼蛋白酶體的相關(guān)基因PSMA6/PSMA3/PSMC6與一些免疫性及代謝性疾病相關(guān)，例如多發(fā)性硬化(MS)、支氣管哮喘(BA)、1型糖尿病等[4]。Alireza等證實(shí)在多發(fā)性硬化的患者中，可測(cè)得循環(huán)中蛋白酶體濃度顯著升高[5]。但是目前尚沒有研究表明蛋白酶體相關(guān)的基因多態(tài)性與SLE發(fā)病之間存在相關(guān)性。本文主要研究中國(guó)地區(qū)人群泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(UPS)相關(guān)基因位點(diǎn)PSMA6(rs2277460)，PSMA3(rs2348071)，PSMC6(rs2295826，rs2295827)多態(tài)性與SLE的相關(guān)性，以探討UPS在SLE發(fā)病過程中可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 108例SLE女性患者資料均收集于2015年6月至2016年4月武漢大學(xué)中南醫(yī)院和武漢大學(xué)人民醫(yī)院門診和住院患者，年齡中位數(shù)為38.5歲。所有患者均符合1997年美國(guó)風(fēng)濕協(xié)會(huì)修訂的SLE診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]。對(duì)照組143名健康體檢者來自武漢大學(xué)中南醫(yī)院體檢中心，年齡中位數(shù)為41歲，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室檢查及問卷調(diào)查排除了SLE、干燥綜合征、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、皮肌炎等自身免疫性疾病，且一，二，三級(jí)親屬中無SLE患者。所有受試者間均無血緣關(guān)系，且兩組的年齡分布無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Pgt;0.05)。本次實(shí)驗(yàn)通過了武漢大學(xué)中南醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，所有實(shí)驗(yàn)受試者均簽署了知情同意書。

1.2 儀器與試劑 5424臺(tái)式離心機(jī)(Eppendorf公司)；S1000 Thermal Cycler PCR儀(美國(guó)BIO-RAD公司)；DYY-6C電泳儀(北京六一儀器廠)；Tanon1600凝膠成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)；2xTsingKe Master Mix(北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司)；血液基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司，DP318；百泰克生物技術(shù)有限公司，DP6101)

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 (1)采集受試者外周靜脈血5 mL，保存于-4℃環(huán)境中。(2)采用血液DNA提取試劑盒提取DNA(苯酚-蛋白酶K法)，采用紫外分光光度法測(cè)定DNA濃度，A260/A280gt;1.8,于-20℃保存。(3)PCR擴(kuò)增目的基因，引物合成見表1。以下引物由武漢邦達(dá)生物科技有限公司合成。擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)35次，末次72℃延伸5 min。(4)瓊脂糖凝膠電泳：將擴(kuò)增的產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳，以驗(yàn)證擴(kuò)增結(jié)果(圖1)。(5)測(cè)序：由武漢邦達(dá)生物技術(shù)有限公司對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行二代測(cè)序。(6)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：根據(jù)二代測(cè)序結(jié)果，利用直接計(jì)數(shù)法對(duì)基因型與等位基因頻率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，利用SPSS 17.0對(duì)實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組基因型頻率及等位基因分布差異進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，當(dāng)Plt;0.05時(shí)，兩組頻數(shù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

圖1 rs2277460，rs2295826，rs2295827，rs2348071 (從左到右)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖

SNP位點(diǎn)上游引物下游引物rs22774605＇CTTTAAACACAATCCCTGGGC3＇5＇GCATGCAAGAGCGGAAGAA3＇rs23480715＇TTTCAGTCTAAGGCAGGGATG3＇5＇CTTACACCGAGCTTCCCCAG3＇rs22958265＇TTTTGTTGTTATACATGCCACC3＇5＇GTGTTTAAGTCGCTACGTCTCAC3＇rs22958275＇GTTGTTATACATGCCACCTACTCA3＇5＇CTGTAGGGCCTTCAGATCATTT3＇

2 結(jié)果

2.1 Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn) 分別對(duì)實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組各基因型的頻數(shù)及理論頻數(shù)進(jìn)行H-W平衡檢驗(yàn)，四個(gè)位點(diǎn)在兩組的分布均符合H-W平衡定律(Pgt;0.05)，表明所選取的樣品符合遺傳平衡定律，可以代表總體人群。

2.2 基因型頻率及等位基因頻率(表2) PSMA6(rs2277460)GG，GA，AA基因型頻率在SLE組與對(duì)照組中分別為97.22%，1.85%，0.93%和96.50%，3.50%，0，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pgt;0.05)，G，A等位基因頻率在SLE組與對(duì)照組中分別為98.15%，1.85%和98.25%，1.75%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pgt;0.05);PSMA3(rs2348071)AA，AG，GG基因型頻率在SLE組與對(duì)照組中分別為30.56%，53.70%，15.74%和33.57%，50.35%，16.08%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pgt;0.05)，A，G等位基因頻率在SLE組與對(duì)照組中分別為57.41%，42.59%和58.74%，41.26%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pgt;0.05);PSMC6(rs2295826)AA，AG，GG基因型頻率在SLE組與對(duì)照組中分別為75.93%，24.07%，0和69.23%，29.37%，1.4%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pgt;0.05)，A，G等位基因頻率在SLE組與對(duì)照組中分別為87.96%，12.04%和83.92%，16.08%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pgt;0.05)；PSMC6(rs2295827)CC，CT，TT基因型頻率在SLE組與對(duì)照組中分別為78.70%，19.45%，1.85%和76.22%，20.98%，2.8%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pgt;0.05)，C，T等位基因頻率在SLE組與對(duì)照組中分別為88.43%，11.57%和86.71%，13.29%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pgt;0.05)

2.3 PSMA6(rs2277460)，PSMA3(rs2348071)，PSMC6(rs2295826，rs2295827)位點(diǎn)基因測(cè)序圖 為進(jìn)一步驗(yàn)證二代測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性，隨機(jī)選擇SLE組4個(gè)位點(diǎn)的7各樣本進(jìn)行一代測(cè)序(圖2～5)。

表2 PSMA6/PSMC6/PSMA3基因多態(tài)性在SLE患者和對(duì)照組的分布

圖2 rs2277460位點(diǎn)，樣品32(含G/A等位基因)的基因擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序圖圖3 rs2348071位點(diǎn)，樣品46(含A/G等位基因)的基因擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序圖

圖4 rs2295826位點(diǎn)，樣品48(含A/G等位基因)的基因擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序圖圖5 rs2295827位點(diǎn)，樣品51(含C/T等位基因)的基因擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序

3 討論

SLE的發(fā)病機(jī)制目前尚未完全明確，隨著GWAS技術(shù)的發(fā)展，通過多個(gè)獨(dú)立大數(shù)據(jù)的全基因掃描的病例對(duì)照研究，為研究SLE的發(fā)病機(jī)制提供了重要線索[7]。其中I型干擾素(IFN)活化異常是一個(gè)很重要的方面。在toll樣受體介導(dǎo)下，激活NF-kB通路，進(jìn)而影響前炎癥因子的轉(zhuǎn)錄[8]。Lena等[9]在SLE血清引發(fā)的皮膚炎癥反應(yīng)組織中檢測(cè)到升高的炎癥因子TNFR1、NF-kB、MCP-1等。而在炎癥反應(yīng)的過程中，泛素-蛋白酶體系統(tǒng)是NF-kB通路主要的調(diào)節(jié)因子[10]。

UPS在免疫反應(yīng)及自身免疫性疾病發(fā)病機(jī)制中的作用被人們作關(guān)注。UPS由泛素(Ub)、泛素活化酶(E1)、泛素結(jié)合酶(E2s)泛素-蛋白連接酶(E3s)、26S蛋白酶體和泛素解離酶(DUBs)等組成，是主要的非溶酶體依賴的蛋白降解途徑，其對(duì)蛋白的降解受到基因與免疫信號(hào)的共同調(diào)控[11]。泛素化是NF-kB轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)的重要方式，有研究發(fā)現(xiàn)編碼泛素連接酶UbcH7的基因UBC2L3在歐洲，亞洲及非洲裔的SLE患者與正常對(duì)照組中均存在基因多態(tài)性[3],并且高表達(dá)的T基因型與抗dsDNA抗體陽性可能存在相關(guān)性，進(jìn)一步的研究表明在SLE患者群體中UbcH7在mRNA和蛋白質(zhì)水平均有顯著的高表達(dá)[12]，在SLE患者體內(nèi)，過度表達(dá)的UbcH7與其底物P105(NF-kB的前體蛋白)結(jié)合，增強(qiáng)了P105與蛋白酶體的結(jié)合與降解，使得其亞基P50二聚體增多并進(jìn)入細(xì)胞核參與免疫調(diào)控。此外，有研究表明SLE的相關(guān)基因TNFAIP3編碼的A20蛋白，為泛素酶的成分之一[13]，與SLE發(fā)病及其系統(tǒng)損害密切相關(guān)。目前關(guān)于蛋白酶體在SLE發(fā)病機(jī)制的作用研究較少，已知在SLE患者體內(nèi)同樣可以檢測(cè)到體內(nèi)可以檢測(cè)到針對(duì)泛素-蛋白酶體成分的抗體表達(dá)增強(qiáng):PA28α抗體[14](PA28α為一種蛋白酶體激活蛋白)，抗Ki抗體[15](Ki抗原是蛋白酶體11S調(diào)控因子的亞單位)，且這種表達(dá)與IFN通路的異?；罨嘁恢隆jowall等[16]應(yīng)用26s蛋白酶體抑制劑治療兩例活動(dòng)期SLE患者，經(jīng)治療后患者的病情得到明顯的緩解，其機(jī)制可能與NF-kB的抑制與基質(zhì)細(xì)胞的相互作用使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的錯(cuò)誤折疊蛋白累積凋亡有關(guān)。

編碼蛋白酶體的基因主要位于14號(hào)染色體長(zhǎng)臂，包括20s亞基的兩個(gè)a鏈(PSMA3和PSMA6)和兩個(gè)b鏈(PSMB5和PSMB11)，ATP酶(PSMC1和PSMC6)，11s非ATP酶催化劑(PSME1和PSME2)和PSMA3P假基因。有研究報(bào)道上述基因多態(tài)性與一些自身免疫性疾病及代謝性疾病相關(guān)，例如多發(fā)性硬化(MS)，支氣管哮喘(BA)，幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎(JIA)等[15]。Tatjana等[17]通過研究174例JIA患者與191名健康對(duì)照者，選擇蛋白酶體相關(guān)的六個(gè)SNP位點(diǎn)(rs2277460，rs1048990，rs2348071，rs11543947，rs2295826，rs2295827)進(jìn)行基因型及等位基因分析，發(fā)現(xiàn)位點(diǎn)rs2277460，rs234871，rs2295826，rs2295827可能與JIA發(fā)病和臨床表現(xiàn)相關(guān)。

本次研究，為探究蛋白酶體相關(guān)基因SNPs與中國(guó)人群系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)的相關(guān)性，我們通過觀察108例SLE患者和143名健康對(duì)照，選擇4個(gè)SNP位點(diǎn)(rs2277460，rs234871，rs2295826，rs2295827)，采用高通量基因分型對(duì)DNA樣本SNP位點(diǎn)進(jìn)行分析，結(jié)果示PSMA6(rs2277460)GG，GA，AA基因型頻率和G，A等位基因在SLE實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Pgt;0.05),PSMA3(rs2348071)AA，AG，GG基因型頻率和A，G等位基因在SLE實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Pgt;0.05),PSMC6(rs2295826)AA，AG，GG基因型頻率和A，G等位基因在SLE實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Pgt;0.05),PSMC6(rs2295827)CC，CT，TT基因型頻率和C，T等位基因在SLE實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Pgt;0.05)。上述四個(gè)SNP位點(diǎn)可能與SLE的發(fā)病機(jī)制無關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)首次探究蛋白酶體相關(guān)基因SNPs與中國(guó)漢族人群SLE之間的關(guān)聯(lián)，PSMA6/PSMC6/PSMA3 SNPs可能不是SLE的易感基因。一方面，本實(shí)驗(yàn)在編碼蛋白酶體結(jié)構(gòu)及相關(guān)酶蛋白的基因位點(diǎn)中僅選取了4個(gè)位點(diǎn)，不能排除其他SNPs在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中表達(dá)有差異的可能性，另一方面，患者循環(huán)中蛋白酶體濃度升高可能與轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控有關(guān)，已知編碼泛素連接酶(UbcH7)的基因UBC2L3為SLE的易感基因，UbcH7激活NF-kB通路可能參與了這一過程。同時(shí)本研究選取的樣本量小，人種單一，選取的位點(diǎn)不能代表蛋白酶體的全部結(jié)構(gòu)，因此，UPS在SLE中的作用還需要通過大樣本，多基因點(diǎn)，多地區(qū)的研究，同時(shí)蛋白酶體轉(zhuǎn)錄后調(diào)控在SLE發(fā)病中的作用也有待進(jìn)一步的研究。

[1] Tsokos GC. Systemic lupus erythematosus[J]. N Engl J Med,2011,365(22):2110-2121.

[2] Zinngrebe J, Montinaro A, Peltzer N, et al. Ubiquitin in the immune system[J]. Embo Reports,2014,15(1):28-45.

[3] Sandra A, Beverly SF, Akaash AK, et al. The autoimmune disease risk allele of UBE2L3 in african american patients with systemic lupus erythematosus: A recessive effect upon subphenotypes[J]. J Rheumatol,2012,39(1):73-78.

[4] Tatjana S, Natalia P, Kristine O, et al. Genetic variations in the PSMA3, PSMA6 and PSMC6 genes are associated with type 1 diabetes in Latvians and with expression level of number of UPS-related and T1DM-susceptible genes in HapMap individuals[J]. Mol Genet Genomics,2016,291(2):891-903.

[5] Alireza M, Wanlong M, Xi Z, et al. Plasma ubiquitin-proteasome system profile in patients with multiple sclerosis: correlation with clinical feature, neuroimaging, and treatment ith interferon-beta-1b[J]. Neurol Res,2012,64(6):49-58.

[6] Hochberg MC. Updating the american college of rheumatologyrevised criteria for the classification of systemic lupus erythematosus[J]. Arthritis Rheum,1997,40(9):1275.

[7] Han JW, Zheng HF, Cui Y, et al. Genome-wide association study in a Chinese han population identifies nine new susceptibility loci for systemic lupus erythematosus[J]. Nat Genet,2009,41(11):1234-1237.

[8] Gianchecchi E, Fierabracci A. Gene/environment interactions in the pathogenesis of autoimmunity：New insights on the role of Toll-like receptors[J]. Autoimmun Rev,2015,14(11):971-983.

[9] Liu L, Xu G, Dou H, et al. The feature of skin inflammation induced by lupus serum[J]. Clin Immun,2016,165:4-11.

[10] Skaug B, Jiang X, Chen ZJ. The role of ubiquitin in NF-kappaB regulayory pathways[J]. Annu Rev Biochem,2009,78(78):769-796.

[11] Eugen F, Gerd-Rudiger B, Elke K. The proteasome-victim or culprit in autoimmunity[J]. Clin Immun,2016,172:83-89.

[12] Shaofeng W, Indra A, Graham BW, et al. A functional haplotype of UBE2L3 confers risk for systemic lupus erythematosus[J]. Genes Immun,2012,13(5):380-387.

[13] Wang S, Wen F, Wiley GB, et al. An enhancer element harboring variants associated with systemic lupus erythematosus engages the TNFAIP3 promoter to influence A20 expression[J]. Plos Genetics,2013,9:e1003750.

[14] Matsushita M, Matsudaira R, Ikeda K, et al. Anti-proteasome activator 28alpha is a novel anti-cytoplasmic antibody in patients with systemic lupus erythematosus and sjogren's sydrome[J]. Mod Rheumatol,2009,19(6):622-628.

[15] Fredi M, Cavazzana I, Quinzanini M, et al. Rare autiantibodies to cellular antigens in systemic lupus erythematosus[J]. Lupius,2014,23(7):672-677.

[16] Sjowall C, Hjorth M, Eriksson P. Successful treatment of refractory systemic lupus erythematosus using proteasome inhibitor bortezomib followed by belimumab: description of two cases[J]. Lupus,2017,26(12):1333-1338.

[17] Tatjana S, Natalia P, Ingrida R, et al. Juvenile idiopathic arthritis subtype-and sex-specific associations with genetic variants in the PSMA6/PSMC6/PSMA3 gene cluster[J]. Pediatr Neunatol,2014,55(5):393-403.

(收稿：2017-06-18 修回：2017-07-31)

AssociationbetweenPSMA6/PSMA3/PSMC6genepolymorphismandsystemiclupuserythematosus

LIULanting1,WANGYu2,SONGJiquan1,PEISa1,OUYunchao1.

1.DepartmentofDermatologyZhongnanHospitalofWuhanUniversity,Wuhan430071,China; 2.DepartmentofDermatology,RenminHospitalHubeiUniversityofMedicine,Shiyan442000,China

SONGJiquan,E-mail:songjiq@126.com

Objective: To determine the association between the polymorphisms of proteasome (PSM) related genes and systemic lupus erythematosus (SLE).MethodsThe aim gene fragment extracted from the peripheral blood DNA of 101 SLE patients and 143 healthy controls was amplified by PCR. The single nucleotide polymorphisms of PSMA6 (rs2277460)，PSMA3 (rs2348071)，PSMC6 (rs2295826，rs2295827) alleles and the genotypes of proteasome 20 s subunit and related ATPase were detected by next generation sequencing technology.ResultsThe genotype frequencies of rs2277460 GG, GA, AA in the SLE patients and healthy controls were 30.56%, 53.7%, 15.74% and 33.57%, 50.35%, 16.08%, retrospectively. The genotype frequencies of rs2295826 AA, AG, GG were 75.93%, 24.07%, 0 and 69.23%, 29.37%, 1.4%. The genotype frequencies of rs2295827 CC, CT, TT were 78.7%, 19.45%, 1.85% and 76.22, 20.98%, 2.8%, with no significant differences between the two groups (Pgt;0.05).ConclusionThere may be no association between polymorphism of PSMA6/PSMC6/PSMA3 gene with SLE.

systemic lupus erythematosus (SLE); PSM; ATP ase; single nucleotide polymorphism

湖北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(編號(hào):2015CKC902)

1武漢大學(xué)中南醫(yī)院皮膚科,武漢，430071 2湖北醫(yī)學(xué)院附屬人民醫(yī)院，十堰，442000

宋繼權(quán),E-mail: songjiq@126.com