bFGF基因轉(zhuǎn)染MSC目的基因檢測

王彥生 于寧

bFGF基因轉(zhuǎn)染MSC目的基因檢測

王彥生 于寧

【摘要】目的 探討堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）基因外源性轉(zhuǎn)染到MSC（骨髓間充質(zhì)細(xì)胞）后，bFGF基因的表達(dá)情況。方法 選取SD大鼠，獲取骨髓間充質(zhì)細(xì)胞，分為對照組、陰性對照組（轉(zhuǎn)染外源性GFP）和實(shí)驗(yàn)組（外源性bFGF轉(zhuǎn)染MSC），經(jīng)過體外培養(yǎng)后，應(yīng)用RT-PCR和ELISE法檢測各組MSC的bFGF基因陽性表達(dá)情況。結(jié)果 RT-PCR法顯示實(shí)驗(yàn)組bFGF基因表達(dá)量（0.73±0.15）高于對照組和陰性對照組（P＜0.05）。ELISA法顯示bFGF基因表達(dá)主要集中在胞漿，實(shí)驗(yàn)組bFGF基因表達(dá)量[上清為（5.38±0.45）ng/L，胞漿為（8.27±0.82）ng/L]高于其他兩組（P＜0.05）。結(jié)論 采用病毒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染技術(shù)能夠?qū)⑼庠葱詁FGF轉(zhuǎn)染至MSC，并能夠成功實(shí)現(xiàn)bFGF基因表達(dá)。

【關(guān)鍵詞】bFGF基因；骨髓間充質(zhì)細(xì)胞；細(xì)胞轉(zhuǎn)染

【

作者單位：110024 沈陽醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院手外科

Detection of bFGF Transfection on MSC Gene

WANG Yansheng YU Ning, Hand Surgery Department, Central Hospital Affiliated to Shenyang Medical College, Shenyang 110024, China

[Abstract]Objective To discuss the expression of bFGF gene, after basic fibroblast growth factor (bFGF) exogenous transfection to MSC (bone marrow cells). Methods SD rats were selected. The ectomesenchymal cells were obtained from bone marrow. They were divided into control group, negative control group (transfection exogenous GFP) and experimental group (exogenous bFGF transfection on MSC), in vitro culture, bFGF gene positive expression of MSC were detected by the method of RT-PCR and ELISE in each group. Results RT-PCR showed that bFGF gene expression quantity was (0.73±0.15) in experimental group, it was significantly higher than the control group and the negative control group (P<0.05). ELISA showed that bFGF gene expression was mainly in the cytoplasm, the experimental group bFGF gene expression quantity were [supernatant (5.38±0.45)ng/L, cytoplasm (8.27±0.82)ng/L], it was significantly higher than the other two groups (P<0.05). Conclusion The application of virus mediated gene transfection to transfect exogenous bFGF to MSC can successfully achieve bFGF gene expression.

[Key words]BFGF gene, Bone marrow mesenchymal cells, Cell transfection

bFGF具有諸多生物學(xué)功效,是形成新生血管的特異性促進(jìn)因子，而且能夠調(diào)控MSC增殖和定向分化[1]。本實(shí)驗(yàn)探討將病毒作載體，通過將外源性bFGF基因染入到MSC后，通過觀察bFGF基因的表達(dá)，為更為深入的研究bFGF提供相關(guān)動物實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1　材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

6只近交系SD大鼠均來源與中國醫(yī)科大學(xué)，體重為（160±10）g。

1.2 主要試劑及儀器

bFGF片段（武漢博士德生物）；DMEM液、乙二胺四乙酸、蛋白酶（美國GIBCO）；PCR儀（美國ABI公司）；核酸電泳儀（北京六一廠）；凝膠成像儀（美國 BIO公司），細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑盒、ELISA試劑盒(美國R&D公司)。

1.3 研究方法

1.3.1 細(xì)胞傳代培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 斷頸處死SD大鼠后，消毒，取股骨和脛骨，去掉骨表面軟組織，完全顯現(xiàn)骨髓腔，用DMEM液沖洗髓腔后，抽取骨髓并制成細(xì)胞懸液，離心去除上清，添加完全培養(yǎng)液，細(xì)胞重懸后，用培養(yǎng)瓶接種細(xì)胞懸液，室溫下放置到CO2培養(yǎng)箱中，每72 h換液1次，至細(xì)胞融合超過80%后，添加乙二胺四乙

酸、胰蛋白酶消化后，進(jìn)行傳代培養(yǎng)（1∶3）。取3代細(xì)胞，分為對照組、陰性對照組和實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞懸液，滴加到培養(yǎng)孔中后，加入bFGF純化液和培養(yǎng)液轉(zhuǎn)染2 h后進(jìn)行48 h細(xì)胞培養(yǎng)，每24 h更換1次培養(yǎng)基。對照組僅使用培養(yǎng)液，陰性對照組添加純化GFP液和培養(yǎng)液。

1.3.3 檢測指標(biāo)及方法 應(yīng)用RT-PCR和ELISA法檢測MSC細(xì)胞中bFGF基因的表達(dá)情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 15.0軟件，組間計(jì)量數(shù)據(jù)比較用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)對照組bFGF基因表達(dá)量為（0.34±0.11）ng/L，陰性對照組表達(dá)量為（0.33±0.12）ng/L，實(shí)驗(yàn)組表達(dá)量為（0.73±0.15）ng/L，實(shí)驗(yàn)組bFGF陽性表達(dá)量高于其兩組（P＜0.05）。ELISA法檢測顯示對照組上清中bFGF基因表達(dá)量為（0.18±0.07）ng/L，胞漿表達(dá)量為（0.21±0.10）ng/L，陰性對照組bFGF基因表達(dá)量為（0.21±0.09）ng/L，胞漿表達(dá)量為（0.29±0.10）ng/L，實(shí)驗(yàn)組bFGF基因表達(dá)量為（5.38±0.45）ng/L，胞漿表達(dá)量為（8.27±0.82）ng/L，實(shí)驗(yàn)組bFGF基因表達(dá)量高于另外兩組（P＜0.05）。

3　討論

bFGF血管形成的重要誘導(dǎo)因子之一，其對于血管生成的作用備受關(guān)注[2]。本實(shí)驗(yàn)通過病毒載體將外源性bFGF基因成功轉(zhuǎn)入到MSC內(nèi)，通過RT-PCR及ELISE檢測證實(shí)，轉(zhuǎn)染細(xì)胞能夠bFGF基因陽性部位為細(xì)胞漿，MSC轉(zhuǎn)染后其細(xì)胞內(nèi)外均可出現(xiàn)bFGF蛋白陽性表達(dá)，并且其bFGF陽性表達(dá)量高于對照組及陰性對照組（P＜0.05），提示外源性bFGF基因轉(zhuǎn)染大鼠MSC后，能夠得到目的基因表達(dá)，且能夠保有生物學(xué)活性，促進(jìn)細(xì)胞自身增殖。綜上所述，病毒載體基因轉(zhuǎn)染法能夠?qū)FGF基因?qū)氲組SC中，使轉(zhuǎn)染MSC中bFGF基因持續(xù)高表達(dá)。

參考文獻(xiàn)

[1]張金池，吳明祥，王玉龍，等. 人堿性成纖維細(xì)胞生長因子基因轉(zhuǎn)染大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的研究[J]. 中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2010，27(10)：1436-1438.

[2]蔡弢藝，陳雄生，賈連順，等. 堿性成纖維細(xì)胞生長因子重組腺病毒轉(zhuǎn)染兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的表型變化[J]. 中國組織工程研究，2014，19(23)：3727-3731.

·研究分析·

項(xiàng)目基金：遼寧省科學(xué)技術(shù)計(jì)劃項(xiàng)目（編號：2012020120-217）

doi：10.3969/j.issn.1674-9308.2015.18.035

【文章編號】1674-9308（2015）18-0055-02

文獻(xiàn)標(biāo)識碼】B

【中圖分類號】R394.3