利用分子標記分析22種水稻10個抗稻瘟病基因的基因型

韓 笑, 賀葉晨星, 張 梅, 雷子伊, 張 濤, 李建粵

(上海師范大學 生命與環(huán)境科學學院 植物種質資源開發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心,上海 200234)

利用分子標記分析22種水稻10個抗稻瘟病基因的基因型

韓 笑, 賀葉晨星?, 張 梅?, 雷子伊?, 張 濤, 李建粵*

(上海師范大學 生命與環(huán)境科學學院 植物種質資源開發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心,上海 200234)

為了明確已克隆的部分稻瘟病抗性基因在上海市主栽水稻品種以及新培育的水稻品系中的分布,選取22份水稻為材料,利用分子標記檢測技術,對10個已被克隆的抗稻瘟病基因進行基因型鑒定及分析.結果表明,22種水稻均含Pi36、Pi37、Pi-d2、Pib抗性基因,而Pi-kh、Pi9、Pi2、Pi-ta、Pikm抗性基因在22種水稻中分布各有不同,所有被測水稻中均不攜帶Pi25抗性基因.

水稻; 分子標記; 稻瘟病抗性基因

稻瘟病是水稻重要的災害之一,嚴重時使水稻減產40%～50%以上,甚至絕收.實踐證明,利用水稻自身攜帶的抗病基因是控制稻瘟病害最經濟最有效的方法,可以有效地保證糧食安全,減少化學藥劑使用量,降低生產成本和保護環(huán)境[1].由于稻瘟病菌變異較快[2],一個水稻抗性品種連續(xù)多年種植后會使病原菌產生優(yōu)勢小種或新的變異.防治稻瘟病不僅需要發(fā)掘抗性持久、抗譜廣的基因作為抗源,選育出具有主效抗病基因水稻新品種,同時也可以通過多基因聚合的方式進一步提高水稻對不同稻瘟病生理小種的抵抗效果.

目前大約有100個稻瘟病抗性基因被定位到除 3號染色體外的其余 11條染色體上,其中27個稻瘟病抗性基因已被克隆[3].隨著分子生物學和生物技術的迅速發(fā)展,不少稻瘟病抗性基因相關的分子標記相繼被開發(fā)出來,并被用在含有多個抗性基因聚合的研究中.Hittalmani等[4]利用分子標記輔助選擇(MAS)技術將抗稻瘟病基因Pi1、Piz5和Pita聚合到水稻品系“BL125中”;Narayanan等[5]通過MAS技術將抗稻瘟病基因Pi1、Pi5和抗白葉枯病基因Xa21在水稻中進行聚合;陳紅旗等[6]將3個抗稻瘟病基因聚合到“金23B”水稻;倪大虎等[7]、陳健民等[8]分別將抗稻瘟病基因Pi9 導入不同水稻恢復系中.這些育成的改良品系經抗性鑒定,抗瘟性均得到顯著提高.越來越多的抗病基因被挖掘、定位和克隆為水稻抗稻瘟病育種提供了豐富的抗源,加上分子標記輔助選擇技術的發(fā)展,培育抗病水稻品種的周期縮短,效率提高.

明確上海市水稻品種中究竟具備了哪些抗稻瘟病基因,可為今后利用分子標記輔助在上海地區(qū)培育抗稻瘟病水稻新品種研究奠定基礎.本研究利用現(xiàn)有報道[9-14]已建立的分子標記,對22種目前上海市主栽的常規(guī)水稻和雜交水稻親本以及部分新培育的水稻新品系進行10個與稻瘟病抗性相關基因的基因型分析.研究結果可為今后利用分子標記輔助培育抗稻瘟病水稻新品種提供參考.

1 材料與方法

1.1水稻材料及基因組DNA提取

22種上海市主栽常規(guī)水稻、雜交稻親本水稻品種或新培育的水稻品系分別為:“嘉花1號”、“秀水123”、“秀水134”、“光明粳3號”(即“gm01”)、“寶農34”、“金豐”、“松早香1號”、“松香早粳”、“松香軟粳”、“香軟早粳”、“青香軟粳”、“嘉晚123”、“武運5103”、“8004”、“29185”、“光明粳2號”(即“銀香28”)、“上師大18號”、“上師大19號”、“香寶農34”、“R44”、“繁14”、“上師大5號”.

所有水稻材料取幼嫩葉片進行基因組DNA的提取.

1.222種水稻稻瘟病抗性基因型分析

參考前人報道,分別合成能夠擴增Pi-kh、Pi9、Pi-ta、Pi2、Pi25、Pikm、Pi36、Pi37、Pi-d2、Pib共10個基因的引物序列(表1).引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成.

PCR反應為25 μL 體系,含2.5 μL 10×Buffer(含Mg2+),2.5 μL dNTP,每種引物各0.5 μL (2 mmol·L-1),0.3 μL Taq 酶(5 U·μL-1),1 μL DMSO,2.0 μL 模板DNA,用 ddH2O 補足至25 μL體系.不同基因聚合酶鏈式反應(PCR)擴增的程序,除了退火溫度和延伸時間有差異(表1),其他PCR參數(shù)均為:94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s,退火時間30 s,延伸溫度72 ℃,共 35 個循環(huán);最后72 ℃延伸10 min,于4 ℃放置3 min.Pi25基因PCR 產物在電泳檢測前需要先經HincⅡ內切酶酶切.酶切體系(15 μL):PCR產物8.0 μL,內切酶0.4 μL(10 U·μL-1),10 × Buffer 1.5 μL,ddH2O 5.1 μL,混勻后適宜溫度酶切2 h 左右.

反應產物經不同濃度的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測(表1),溴化乙啶染色,在紫外凝膠成像儀上觀察.

表1 稻瘟病相關基因基因型鑒定涉及的引物序列及相關信息

2 結果與分析

2.1Pi-kh基因型分析

稻瘟病抗病基因Pi-kh位于第11染色體,是Pi-k基因座上5個等位基因中的一個,是稻瘟病廣譜抗性基因,對許多中國稻瘟病生理小種有較強的、穩(wěn)定的抗性[15].與抗病基因相比,感病基因存在143個脫氧核苷酸插入、37個脫氧核苷酸缺失和38個單核苷酸多態(tài)性(SNP)[9].利用王軍等[9]根據(jù)感病基因序列存在143 bp插入的特征設計的InDel標記FM143可檢測Pi-kh基因.檢測結果顯示,“光明粳3號”、“金豐”、“松早香1號”、“松香軟粳”、“嘉晚123”、“29185”、“光明粳2號”、“上師大18號”、“繁14”、“上師大5號”水稻能擴增出258 bp的片段,屬于含有Pi-kh抗病基因的品種或品系,其余12種水稻都只能擴增出401 bp片段,判斷其為不含有Pi-kh抗病基因水稻品種或品系,如圖1(a)所示.

2.2Pi9基因型分析

Pi9是目前公認的優(yōu)良抗稻瘟病基因,該基因位于第6染色體近著絲粒部位,含有6個串聯(lián)排列的 NBS-LRR,至少對21 個稻瘟病菌小種具有抗性,是一個稻瘟病廣譜抗性基因[10].利用高利軍等[10]設計的分子標記M-Pi9檢測,如含有291 bp特異條帶的水稻對稻瘟病菌表現(xiàn)抗或中抗.22種水稻檢測結果顯示,“寶農34”、“松早香1號”、“松香早粳”、“松香軟粳”、“香軟早粳”、“青香軟粳”、“嘉晚123”、“武運5103”、“上師大19號”、“上師大5號”能擴增出291 bp片段,如圖1(b)所示,屬于含有Pi9抗性基因的水稻品種或品系,另外12種水稻擴增片段為397 bp,為不含有Pi9抗性基因.

圖1 22種水稻10個稻瘟病基因型檢測.(a) Pi-kh基因；(b) Pi9基因；(c) Pi-ta基因；(d) Pi2基因；(e) Pi25基因；(f) Pikm1基因；(g) Pikm2基因；(h) Pi36基因；(i) Pi37基因；(j) Pi-d2基因；(k) Pib基因; m)100 bp DNA marker；1：嘉花1號；2：秀水123；3：秀水134；4：光明粳3號；5：寶農34；6：金豐；7：松早香1號；8：松香早粳；9：松香軟粳；10：香軟早粳；11：青香軟粳；12：嘉晚123；13：武運5103；14：8004；15：29185；16：光明粳2號；17：上師大18號；18：上師大19號；19：香寶農34；20：R44；21：繁14；22：上師大5號

2.3Pi-ta基因型檢測

Pi-ta是第2個被克隆的稻瘟病抗性基因,位于第12染色體近著絲粒部位.利用高利軍等[10]設計的分子標記M-Pita檢測Pi-ta基因,如含有467 bp特異性條帶的水稻均表現(xiàn)為抗稻瘟病類型,含850 bp的水稻均表現(xiàn)為感病類型.22種水稻檢測結果顯示,“嘉花1號”、“秀水123”、“秀水134”、“松早香1號”、“松香早粳”、“松香軟粳”、“香軟早粳”、“嘉晚123”能擴增出467 bp的片段,是含有Pi-ta抗性基因的水稻品種或品系,如圖1(c)所示,其他14種水稻只能擴增出850 bp條帶,屬于不含有Pi-ta抗性基因的水稻.

2.4Pi2基因型檢測

抗稻瘟病基因Pi2也位于第6染色體近著絲粒部位,與Pi9互為等位基因[16].Chen 等[17]研究發(fā)現(xiàn),中國792個稻瘟病菌中,只有7.55%的病菌能侵染攜帶Pi2 的親本“C101A51”.利用高利軍等[10]設計的分子標記M-Pi2檢測Pi2基因,如含有450 bp 特異條帶的水稻屬于含有Pi2抗病基因的品種或品系.22種水稻檢測結果顯示,只有“嘉花1號”、“秀水123”、“秀水134”、“繁14” 4種水稻能擴增出450 bp的片段,如圖1(d)所示.

2.5Pi25基因型檢測

抗稻瘟病基因Pi25也位于第6染色體.利用王惠梅等[11]設計的分子標記CAPS/HincⅡ檢測Pi25基因,能特異性識別并酶切抗性等位基因.檢測結果顯示,22種水稻擴增出的片段大小為406 bp,但均未被酶切.根據(jù)結果判斷這22個水稻品種或品系均不含Pi25抗性基因,如圖1(e)所示.

2.6Pikm基因型檢測

抗稻瘟病基因Pikm位于第11染色體長臂近末端區(qū).Pikm由2個緊密連鎖的具有獨立功能NBS-LRR類基因(Pikm1-TS和Pikm2-TS)組成,Pikm1-TS和Pikm2-TS的編碼產物均是NBS-LRR類抗病蛋白.利用范方軍等[12]設計的分子標記檢測Pikm,對2 個基因分別用Pi-km1 分子標記和Pi-km2分子標進行檢測,以2 對引物同時檢測到目的片段(Pikm1片段長度174 bp,Pikm2片段長度291 bp)為含有完整Pikm基因.

Pi-km1標記對22種水稻檢測結果顯示,22種水稻均能擴增出174 bp的片段,如圖1(f)所示,但是對于Pi-km-2標記檢測22種水稻,只有“秀水123”、“秀水134”、“光明粳3號”、“寶農34”、“金豐”、“松早香1號”、“松香軟粳”、“嘉晚123”、“武運5103”、“香寶農34”、“上師大5號”水稻能擴增出290 bp特異的抗性片段,如圖1(g)所示.由此表明,在這11種水稻中含有完整的Pikm抗性基因.

2.7Pi36基因型檢測

Pi36位于第8染色體.利用宋廣樹等設計的分子標記Pi-36檢測,如能夠擴增出628 bp的條帶表明含有Pi36抗性基因[13].對22種水稻基因組DNA的檢測結果發(fā)現(xiàn),22種水稻均擴增出628 bp片段,均含有抗性基因Pi36(圖1H).

2.8Pi37基因型檢測

Pi37位于第1染色體.利用宋廣樹等[13]設計的分子標記Pi-37檢測,含有抗性基因Pi37的水稻能擴增出716 bp條帶.對22種水稻基因組DNA檢測結果發(fā)現(xiàn),22種水稻均擴增出716 bp片段,均含有抗性基因Pi37,如圖1(i)所示.

2.9Pi-d2基因型檢測

利用宋廣樹等[13]設計的分子標記Pi-d2檢測,含有抗性基因Pi-d2的水稻能擴增出779 bp條帶.對22種水稻基因組DNA檢測結果發(fā)現(xiàn),22種水稻均擴增出779 bp片段,均含有抗性基因Pi-d2,如圖1(j)所示.

2.10Pib基因型檢測

Pib基因是第一個被克隆的水稻稻瘟病抗性基因,位于第2染色體上.根據(jù)劉洋等[14]建立的檢測感病等位基因pib的顯性標記Lys145和檢測抗病等位基因Pib的顯性標記Pibdom 組成一套水稻抗稻瘟病基因Pib顯性分子標記.抗病性顯性分子標記Pibdom 能特異性擴增出一條365 bp 片段,感病性顯性分子標記Lys145 能特異性擴增出一條803 bp 的片段.22種水稻檢測結果顯示,Pibdom均能被檢測出365 bp大小的片段,如圖1(k)所示,而Lys145檢測結果多次重復均無目標條帶形成.由此表明22種水稻材料均含有Pib抗性基因.

2.1110個抗性基因在22種水稻中分布匯總

匯總10個抗性基因在22種水稻中的分布,并計算每個抗性基因在22種水稻中出現(xiàn)的頻率.

22種水稻都含有多個稻瘟病抗性基因,但數(shù)量不同,其中“松早香1號”和“松香軟粳”含有抗性基因多達8個,其次是“秀水123”、“秀水134”、“上師大5號”,都含有7個抗性基因.“8004”和“R44”兩種水稻在22種水稻中含有的抗性基因數(shù)量最少,都僅有4個(表2).

表2 10個稻瘟病抗性基因在22種水稻中出現(xiàn)次數(shù)匯總

注:表示含有抗性基因

在上海市目前主裁的常規(guī)水稻和雜交稻親本及最近培育的22種水稻中,對于Pi36、Pi37、Pi-d2、Pib4個基因出現(xiàn)的頻率較高,都到達100%出現(xiàn)次數(shù).Pi25基因出現(xiàn)次數(shù)為0,頻率最低.其次是Pi2基因,只出現(xiàn)了4次,出現(xiàn)頻率為18.2%(圖2).

圖2 10個稻瘟病基因型在22種水稻中出現(xiàn)的頻率

3 討 論

傳統(tǒng)的水稻抗病育種主要依靠田間抗病性考察對目標植株進行篩選.這種育種方法既耗時耗力,同時因為太受環(huán)境條件影響也很難達到理想的效果.分子標記輔助選擇技術作為隨著分子生物學及生物信息學技術發(fā)展而產生的新選擇手段,因其具有準確、快速,且不受環(huán)境影響等優(yōu)點,已經廣泛應用于作物育種實踐.實踐證明,將多個抗菌譜不同的抗稻瘟病基因聚合到同一個水稻品種中,是培育廣譜持久抗稻瘟病品種、應對稻瘟病菌高度易變性的有效策略.

本研究利用已經克隆的10個稻瘟病抗性基因建立的特異性分子標記,對上海市目前主要推廣及新培育的22種水稻品種或品系進行檢測.結果表明,這22種水稻均含Pi36、Pi37、Pi-d2、Pib4個抗性基因;Pi-kh、Pi9、Pi2、Pi-ta、Pikm抗性基因在22 種水稻中各有不同類型;所有檢測品種或品系中均不具有Pi25抗性基因;而且Pi2基因在上海市22種水稻中出現(xiàn)的頻率也比較低.由此建議可通過分子標記輔助方法將Pi25基因引入上海市水稻品種或品系,以及將Pi2基因更多地引入上海市水稻品種或品系,可以更全面地提高上海市水稻對不同稻瘟病生理小種的抗性效果.

稻瘟病基因Pi54,最初被命名為Pi-kh[12],因此Pi54和Pi-kh屬同一抗病基因.現(xiàn)有報道顯示,目前已克隆的較多稻瘟病抗性基因,不僅有較多基因會成簇分布在一個染色體的特定區(qū)域,每個基因位點還有較多的等位形式.如Pi9、Pi2、Pi50、Pigm、Piz、Piz-t同為Piz位點上的復等位基因,Pikh、Pikm、Pikp、Piks、Pikg與Pik也是互為等位基因[16].本研究中,對于有些水稻在Pi2基因和Pigm基因的檢測中呈現(xiàn)雜合狀態(tài),也可能是存在有不同的等位形式所致.

王忠華等[18]認為,是否存在Pi-ta抗病基因與田間抗性相吻合.楊杰等[19]報道發(fā)現(xiàn),曾經和目前在上海市主栽的一些“秀水”系列水稻,如“嘉花1號”、“秀水123”、“秀水134”都同時含有Pib、Pi-ta兩個抗性基因,并認為由此賦予這些水稻具有較強抗稻瘟病表型.這與本研究檢測結果相同.根據(jù)田間分析發(fā)現(xiàn),含有Pi-ta抗病基因與水稻抗穗瘟之間存在極顯著相關性,并且比Pib、Pikm和Pi54抗性基因具有相對更強的抗病效果[12].在本研究檢測的22種水稻中,只有8種水稻含有Pi-ta抗病基因.為了使更多上海市水稻品種及品系能夠具備抵抗穗瘟效果,可以利用分子標記輔助技術將Pi-ta抗病基因進行導入操作.

李洪亮等[20]研究認為,Pi2基因對稻瘟病抗性略強于Pi1基因,但兩者單獨存在時的水稻抗病效果都不是很理想,而對于同時含有Pi1和Pi2兩個基因的水稻,對稻瘟病的抗性效果明顯好于Pi1或Pi2單獨存在的水稻.含有Pi2抗性基因對稻瘟病的抗性效果也好于Pitz抗性基因[10].張羽等[21]研究發(fā)現(xiàn),Pi9、Pi-ta、Pikm、Pib、Piz-t這5個抗性基因位點對水稻的抗病影響力基本一致,并且可能都屬于微效基因,它們各自單獨存在時,對稻瘟病抗性效果都較弱,但是,隨著抗性基因位點數(shù)量的增多,品種的抗病性呈上升趨勢.由此表明,對于高抗稻瘟病水稻育種,有必要將多個抗性基因聚合到一個水稻品種中.

本研究檢測結果表明,上海市大多主推水稻品種或一些新培育的水稻品系,都具有較多種抗稻瘟病基因,這可能從一定程度上反映出這些水稻品種或品系具有較好的稻瘟病抗性水平,但這些水稻的實際抗病效果還需要通過田間檢測進行驗證.開展本研究,也為今后利用分子標記輔助更進一步在上海市水稻品種或品系中聚合更多的稻瘟病抗性基因研究奠定了基礎.

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(責任編輯：顧浩然,郁 慧)

Genotypingof10blastresistancegenesin22ricevarietiesbymolecularmarker

Han Xiao, Heye Chenxing?, Zhang Mei?, Lei Ziyi?, Zhang Tao, Li Jianyue*

(Development Center of Plant Germplasm Resources,College of Life and Environmental Sciences,Shanghai Normal University,Shanghai 200234,China)

Genotyping of 10 blast resistance genes,which were cloned from 22 leading rice cultivars or new bred rice strains grown mainly in Shanghai,was carried out by using molecular marker detection technology for clearing these genes′ distribution in the 22 rice cultivars or strains.The results showed that 22 rice cultivars or strains all contained rice blast resistance genesPi36、Pi37、Pi-d2 andPib,while the distributions ofPi-kh、Pi9、Pi2、Pi-taandPikmwere different in above different rice cultivars or strains.And all the rice samples detected did not containPi25.

rice; molecular marker; blast resistance gene

Q 75

A

1000-5137(2017)05-0654-08

2017-08-23

上海市科委現(xiàn)代農業(yè)科技創(chuàng)新項目(16391900800);上海植物種質資源工程技術研究中心項目(17DZ2252700)

韓 笑(1996-),女,在讀本科生.

導師簡介: 李建粵(1958-),女,教授,主要從事植物分子遺傳學方面的研究.E-mail:lijianyue01@shnu.edu.cn

*

?在完成本研究試驗操作過程具有同等貢獻,并列第二作者.