創(chuàng)傷性腦損傷后海馬區(qū)S1PR1表達(dá)與NSCs增殖的關(guān)系

葉玉勤 楊永祥 蘇鑫洪 何軍 陳曉燕 賀曉生

(1第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西 西安 710032; 2解放軍第163醫(yī)院神經(jīng)外科，湖南 長(zhǎng)沙 410000)

·神經(jīng)損傷研究·

創(chuàng)傷性腦損傷后海馬區(qū)S1PR1表達(dá)與NSCs增殖的關(guān)系

葉玉勤1, 2*楊永祥1蘇鑫洪1何軍1陳曉燕1賀曉生1*

(1第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西 西安 710032;2解放軍第163醫(yī)院神經(jīng)外科，湖南 長(zhǎng)沙 410000)

目的探討創(chuàng)傷性腦損傷(TBI)后大鼠海馬區(qū)1-磷酸鞘氨醇受體1(S1PR1)的表達(dá)變化特點(diǎn)及其與神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)增殖的關(guān)系。方法96只健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為TBI后1、3、7、14、21、28 d組(n=10)和各時(shí)點(diǎn)相應(yīng)的對(duì)照組(n=6)。采用控制性皮層損傷法建立大鼠TBI模型，5-溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)和性別決定相關(guān)基因簇2(Sox2)免疫熒光染色雙標(biāo)NSCs，觀察TBI后海馬區(qū)NSCs的增殖趨勢(shì)，Western Blot檢測(cè)和分析海馬區(qū)S1PR1的表達(dá)變化規(guī)律。結(jié)果與對(duì)照組相比，傷后第1天海馬區(qū)NSCs數(shù)量增多，第7天達(dá)到高峰，第14、21、28天逐漸減少(Plt;0.05)。海馬區(qū)S1PR1于傷后第1天表達(dá)顯著上調(diào)，高峰出現(xiàn)在傷后第7天，于第14、21、28天表達(dá)逐漸下調(diào)(Plt;0.05)。結(jié)論TBI后海馬區(qū)S1PR1表達(dá)變化與NSCs增殖趨勢(shì)在時(shí)程上一致，S1PR1可能在TBI后神經(jīng)再生與修復(fù)過程中具有重要調(diào)控作用。

創(chuàng)傷性腦損傷; 1-磷酸鞘氨醇受體1; 神經(jīng)干細(xì)胞; 海馬

創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury, TBI)是以高致殘率和致死率居于各類創(chuàng)傷之首，不僅可直接造成原發(fā)性腦組織損傷，還引發(fā)一系列繼發(fā)性病理生理改變導(dǎo)致級(jí)聯(lián)損傷效應(yīng),導(dǎo)致TBI的預(yù)后往往不理想。促進(jìn)神經(jīng)再生與功能修復(fù)是改善TBI預(yù)后的關(guān)鍵所在。近年來(lái)的研究表明，成年哺乳動(dòng)物的室管膜下區(qū)(subventricular zone, SVZ)和海馬齒狀回顆粒細(xì)胞層下區(qū)(subgranular zones, SGZ)存在大量?jī)?nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells, NSCs)。雖然TBI在一定程度上可激活這些處于靜息狀態(tài)的NSCs，參與神經(jīng)再生和功能修復(fù)。但腦損傷后NSCs自身的增殖能力有限，無(wú)法滿足修復(fù)損傷的實(shí)際需要[1-3]。因此，尋找能夠提高TBI后體內(nèi)NSCs增殖能力的突破點(diǎn)，是促進(jìn)腦損傷后神經(jīng)再生與修復(fù)亟待解決的問題。

磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate, S1P)是具有生物活性的鞘脂代謝產(chǎn)物，通過與特異性的G蛋白受體偶聯(lián)，廣泛參與調(diào)控多種生物功能[4]。目前已發(fā)現(xiàn)的S1P受體家族有5個(gè)成員，分別是1-磷酸鞘氨醇受體1(sphingosine-1-phosphate receptor 1, S1PR1)、S1PR2、S1PR3、S1PR4和S1PR5。其中，S1PR1和S1PR2在NSCs中呈特性高表達(dá)，兩者在體外培養(yǎng)的NSCs自我更新和遷移過程中具有重要調(diào)控作用[5-6]。新近的研究發(fā)現(xiàn)，S1PR1在海馬區(qū)廣泛表達(dá)，在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的過程中，參與調(diào)控神經(jīng)發(fā)生和新生血管生成等多種生物學(xué)過程[7]。然而，TBI后海馬區(qū)S1PR1的表達(dá)是否會(huì)發(fā)生變化，其改變有何特點(diǎn)，S1PR1的表達(dá)變化與海馬區(qū)NSCs的增殖潛能有無(wú)潛在聯(lián)系，目前尚不明確。本研究通過建立TBI動(dòng)物模型，檢測(cè)TBI后不同時(shí)點(diǎn)海馬區(qū)NSCs的增殖水平和S1PR1的表達(dá)變化特征，探討兩者之間的可能關(guān)系，為TBI后神經(jīng)再生與修復(fù)研究提供新思路。

材料與方法

一、主要實(shí)驗(yàn)試劑

5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-Bromo-2-deoxyUridine, BrdU)(B9285)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；山羊抗BrdU多克隆抗體(GTX21893)和兔抗大鼠性別決定相關(guān)基因簇2 (sex determining region Y-box 2, Sox2)多克隆抗體(GTX101507)，均購(gòu)自美國(guó)GeneTex公司；Alexa fluoro-488標(biāo)記的驢抗山羊抗體(A-11015)和Alexa fluoro-594標(biāo)記的驢抗兔抗體(A-11016)，均購(gòu)自美國(guó)Invitrogene公司；兔抗大鼠S1PR1多克隆抗體(4809)購(gòu)自美國(guó)Prosci公司；抗β-actin兔多克隆抗體(CW0097)購(gòu)自北京康為世紀(jì)公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔二抗(7074)購(gòu)自美國(guó)CST公司；蛋白定量試劑盒(P00 11)購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所。

二、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

96只健康雄性SD大鼠(250～300 g)由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，對(duì)所有大鼠進(jìn)行隨機(jī)編號(hào)，然后通過隨機(jī)數(shù)字表抽取數(shù)字，按照對(duì)應(yīng)的動(dòng)物編號(hào)進(jìn)行如下隨機(jī)分組。首先隨機(jī)分為對(duì)照組(n=36)和TBI組(n=60)。各組再均分為6個(gè)亞組，分別再 TBI后第1、3、7、14、21、28天處死，各亞組隨機(jī)選取半數(shù)(對(duì)照亞組n=3，TBI亞組n=5)做免疫熒光染色，觀察TBI后海馬區(qū)NSCs增殖變化情況。另一半用于Western Blot定量檢測(cè)，分析TBI后海馬區(qū)S1PR1的表達(dá)情況。

三、動(dòng)物TBI模型制備

根據(jù)控制性皮層損傷方法，應(yīng)用PinpointTMPCI 3000腦損傷儀器制備大鼠TBI模型。室溫條件下，2%戊巴比妥鈉60 mg/kg腹腔內(nèi)注射麻醉。麻醉成功后，無(wú)菌條件下切開頭皮，暴露右頂骨，于顱骨矢狀縫中點(diǎn)旁2 mm處，牙科鉆開直徑為3 mm圓形骨窗，暴露硬腦膜。設(shè)置致傷參數(shù)：打擊深度1.2 mm，打擊速度3.0 m/s和接觸時(shí)間100 ms，致傷后復(fù)位骨片，縫合頭皮。TBI組大鼠出現(xiàn)弓背、毛發(fā)豎立、呼吸淺慢和意識(shí)障礙，在致傷1 h后內(nèi)清醒，清醒后左側(cè)肢體癱瘓，向左側(cè)繞圈行走。對(duì)照組僅切開頭皮，暴露右側(cè)頂骨，不予打擊致傷。

四、腦組織取材

對(duì)做免疫熒光染色的動(dòng)物，各時(shí)間點(diǎn)處死前1 d腹腔注射BrdU，劑量按照50 mg/kg，共3次注射，間隔8 h。處死時(shí)先以2%戊巴比妥鈉麻醉，而后4%多聚甲醛灌注固定，整腦取出后在4%多聚甲醛液中(4 ℃)浸泡過夜。在前囟后3.3～4.5 mm之間冠狀切取整腦組織塊，常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋和連續(xù)冠狀切片。對(duì)做Western Blot檢測(cè)的大鼠，同上法麻醉后立即斷頭處死，取整腦，冰上迅速剝離海馬組織，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

五、免疫熒光染色

采用二步免疫熒光雙標(biāo)染色法，取相應(yīng)組別的腦組織切片，經(jīng)二甲苯梯度脫蠟和乙醇梯度水化，3%過氧化氫去離子水封閉10 min。磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline, PBS)洗片3遍，枸櫞酸緩沖液(pH=6.0)高溫高壓抗原修復(fù)5 min，室溫下自然冷卻。PBS洗片3遍，滴加BrdU(11∶200)和Sox2(11∶500)一抗，4 ℃過夜。PBS洗片3遍，滴加Alexa fluoro-488(1∶2000)和Alexa fluoro-594(11∶1000)二抗，室溫孵育2 h，PBS洗片3遍，甘油封片。取5張連續(xù)切片，熒光顯微鏡下高倍(400×)觀察海馬齒狀回，每張切片取5個(gè)非重復(fù)視野，拍照后采用IPP 6.0圖像分析軟件定量分析平均吸光度值，獲得每張切片BrdU/Sox2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算5張切片BrdU/Sox2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的均值，表示單只動(dòng)物的海馬區(qū)NSCs增殖水平。

六、Western Blot 檢測(cè)

取相應(yīng)組別的大鼠海馬組織，加入裂解液和蛋白酶抑制劑，充分研磨，12 000 r/min離心20 min，收集上清液，二辛可寧酸法蛋白定量，十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，置于40 mL含5%脫脂奶粉的等滲緩沖溶液中，室溫封閉1 h，與S1PR1(11∶500)與β-actin(11∶2000)抗體4 ℃孵育過夜，洗片10 min×3次，再與辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(11∶10 000)室溫孵育1 h，洗片10 min×3次，增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑顯色，暗室曝光，顯影，定影。以β-actin作為內(nèi)參照，用Gel-Pro Analyzer 4圖像分析系統(tǒng)測(cè)定條帶的灰度值，以S1PR1與β-actin的灰度值之比表示S1PR1蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

七、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、TBI后海馬區(qū)NSCs的增殖趨勢(shì)

在海馬齒狀回顆粒層下區(qū)，胞核內(nèi)綠色熒光代表BrdU陽(yáng)性，胞核內(nèi)紅色熒光代表Sox2陽(yáng)性，紅綠疊加為黃色熒光，代表BrdU/Sox2雙標(biāo)陽(yáng)性。NSCs呈胞核內(nèi)BrdU/Sox2雙標(biāo)陽(yáng)性染色(圖1)。與對(duì)照組相比，各TBI時(shí)點(diǎn)組的海馬區(qū)NSCs增殖水平顯著增強(qiáng)。于TBI后第1天，BrdU/Sox2雙標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量開始增多，7 d達(dá)到高峰，14、21、28 d逐漸減少，但仍高于對(duì)照組(Plt;0.05，表1)。

圖1 對(duì)照組和TBI后7 d組海馬區(qū)BrdU/Sox2免疫熒光染色 (×400)
Fig 1 The representative images of hippocampal BrdU/Sox2 immunofluorescence staining in control group and post-traumatic 7 d group (×400).

A～C: BrdU, Sox2 and BrdU/Sox2 staining of hippocampus in control group; D～E: More BrdU, Sox2 and BrdU/Sox2 positive cells in hippocampus were observed at 7 d after TBI.

Groupn1d3d7d14d21d28d TBI552．34±5．25a75．59±8．45a122．76±3．38ab101．27±6．13a87．23±4．90a64．15±3．44a Control323．38±4．4120．71±6．0324．23±3．9523．06±5．6422．95±6．8721．64±4．25

aPlt;0.05,vscontrol group;bPlt;0.05,vsother time-point TBI groups.

Groupn1d3d7d14d21d28d TBI51．10±0．17a1．36±0．16a1．99±0．19ab1．61±0．13a1．17±0．15a0．95±0．15a Control30．64±0．080．67±0．050．61±0．100．62±0．070．65±0．110．67±0．09

aPlt;0.05,vscontrol group;bPlt;0.05,vsother time-point TBI groups.

二、TBI后海馬區(qū)S1PR1蛋白表達(dá)水平

TBI后海馬區(qū)S1PR1蛋白的表達(dá)明顯上調(diào)，傷后1 d表達(dá)量開始增加，隨著損傷時(shí)間的延長(zhǎng)，高峰出現(xiàn)在TBI后第7天，傷后14、21、28 d表達(dá)呈恢復(fù)性下調(diào)，但仍高于對(duì)照組(Plt;0.05，圖2、表2)。

圖2 Western Blot檢測(cè)海馬區(qū)S1PR1蛋白的表達(dá)
Fig 2 The expression of S1PR1 protein in hippocampus was detected by Western Blot

討 論

近年來(lái)，雖然腦損傷后神經(jīng)再生與修復(fù)研究取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步，多種影響TBI后神經(jīng)再生與腦功能修復(fù)的因素得以揭示。但是，由于TBI后腦內(nèi)復(fù)雜多變的病理生理反應(yīng)，參與神經(jīng)再生和修復(fù)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)極為復(fù)雜，目前的研究仍面臨巨大挑戰(zhàn)。應(yīng)用干細(xì)胞修復(fù)組織損傷作為一種新興的途徑，被寄予厚望，尤其在腦損傷后神經(jīng)修復(fù)中，NSCs的研究方興未艾。NSCs是作為一類具有自我更新和多向分化潛能的細(xì)胞，可分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞等，具有修復(fù)神經(jīng)損傷的巨大潛能。NSCs移植是通過向神經(jīng)系統(tǒng)引入外源性細(xì)胞，替代喪失或損傷的神經(jīng)元，以達(dá)到修復(fù)神經(jīng)損傷的目的。但移植入體內(nèi)的NSCs增殖程度與分化方向難以控制，其安全性、穩(wěn)定性和倫理性等諸多問題不容忽視[8-9]。

近年來(lái)，激活內(nèi)源性NSCs修復(fù)自身的神經(jīng)損傷日益受到重視，相關(guān)的研究也取得了一定進(jìn)展[10-11]。研究表明，在生理狀態(tài)下，位于SVZ和SGZ的內(nèi)源性NSCs多處于靜息狀態(tài)，而在腦缺血、腦外傷等病理狀態(tài)下，內(nèi)源性NSCs可被激活，參與神經(jīng)再生和修復(fù)。但由于內(nèi)源性NSCs的激活、增殖、分化與遷徙受TBI后腦內(nèi)多種作用因素的影響，其增殖和向神經(jīng)元定向分化的能力不能滿足修復(fù)損傷的需要[12-13]。因此，研究影響內(nèi)源性NSCs增殖和分化的因素，明確相關(guān)作用分子和作用途徑，通過合理的干預(yù)措施，提高內(nèi)源性NSCs的增殖能力，促進(jìn)TBI后神經(jīng)修復(fù)，是目前神經(jīng)科學(xué)的研究熱點(diǎn)問題。

本研究在建立動(dòng)物TBI模型的基礎(chǔ)上，觀察到傷后1 d海馬區(qū)NSCs開始增多，7 d達(dá)到高峰，并持續(xù)到傷后28 d仍維持在較高的增殖水平，表明海馬區(qū)被激活的NSCs具有參與TBI后神經(jīng)再生和修復(fù)的巨大潛能。我們的這一結(jié)果與其他文獻(xiàn)報(bào)道基本一致，證實(shí)了內(nèi)源性NSCs的增殖高峰期在傷后7 d左右，這可能是干預(yù)NSCs增殖能力的最佳時(shí)間窗[2,18]。此外，另有學(xué)者報(bào)道，隨著NSCs的增殖、分化和向損傷區(qū)遷移，腦損傷造成的學(xué)習(xí)和記憶障礙也得到不同程度的改善[3,19]。

在S1PRs家族中，S1PR1是中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)最多、活性最強(qiáng)的受體亞型，主要分布于大腦皮質(zhì)、小腦和邊緣系統(tǒng)等部位[7,14-15]。研究表明，S1PR1廣泛參與調(diào)控神經(jīng)元細(xì)胞凋亡、興奮性谷氨酸傳遞和線粒體功能等多種生物學(xué)效應(yīng)[15-16]。新近的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)NSCs內(nèi)特異性高表達(dá)的S1PR1被質(zhì)粒干擾下調(diào)時(shí),可導(dǎo)致移植入體內(nèi)的NSCs向脊髓損傷區(qū)域遷移的數(shù)量顯著減少[6]。此外，Harada等研究表明，在胚胎神經(jīng)發(fā)生的過程中，S1P對(duì)NSCs的增殖和形態(tài)變化具有重要調(diào)控作用，采用放射線自顯影技術(shù)對(duì)胎腦進(jìn)行顯像，發(fā)現(xiàn)介導(dǎo)S1P發(fā)揮調(diào)控作用的受體，很可能是與G蛋白Gi亞單位結(jié)合的S1PR1[17]。在本研究中，通過Western-Blot檢測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)成年大鼠的海馬組織也富含S1PR1,并在TBI后表達(dá)明顯上調(diào)，傷后第7天為表達(dá)高峰，到傷后28 d仍處于高表達(dá)狀態(tài)。有意義的是，S1PR1的這一變化規(guī)律與NSCs的增殖趨勢(shì)在時(shí)程上一致，提示S1PR1可能再TBI后NSCs的增殖過程中具有重要調(diào)控作用。

綜上所述，本研究分別從形態(tài)學(xué)和蛋白水平，在建立動(dòng)物TBI模型的基礎(chǔ)上，首次探討了TBI后海馬區(qū)S1PR1的表達(dá)變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)其時(shí)程變化特征與腦損傷后NSCs的增殖趨勢(shì)一致，為深入研究TBI后S1PR1在神經(jīng)再生與修復(fù)中的作用提供了初步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。合理干預(yù)S1PR1的表達(dá)可能有助于促進(jìn)TBI后神經(jīng)再生與修復(fù)，但其潛在作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

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Theassociationbetweenhippocampalsphingosine-1-phosphatereceptor1expressionandneuralstemcellsproliferationfollowingtraumaticbraininjury

YEYuqin1,2,YANGYongxiang1,SUXinhong1,HEJun1,CHENXiaoyan1,HEXiaosheng1

1DepartmentofNeurosurgery,XijingHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi'an710032;2DepartmentofNeurosurgery, 163rdHospitalofPLA,Changsha410000, China

ObjectiveThe potential association between hippocampal sphingosine-1-phosphate receptor 1 (S1PR1) expression and neural stem cells (NSCs) proliferation in a rat model of traumatic brain injury (TBI) was studied.MethodsNinety-six rats were randomly divided into TBI 1 d group, 3 d group, 7 d group, 14 d group, 21 d group, 28 d group (10 in each), and six control groups (6 in each). TBI model was induced by a controlled cortical injury device. NSCs were double-labeled by thymidine analog 5-Bromo-2-deoxyUridine (BrdU) and sex determining region Y-box 2 (Sox2) with immunofluorescence staining. The level of S1PR1 protein in hippocampus was detected by Western Blot at scheduled time-points after TBI.ResultsNSCs in hippocampus was activated at 1 d after TBI, reached the peak at 7 d, was followed by a decrease from 7 d to 28 d when maintained a higher level compared to control group (Plt;0.05). Hippocampal S1PR1 protein was increased from 1 d post trauma, and peaked around 7 d, decreased at 14 d, 21 d, and 28 d to a lower level but still higher than that of control group (Plt;0.05).ConclusionThe S1PR1 expression varies in a similar temporal pattern with NSCs proliferation in hippocampus, indicating that S1PR1 may be required for the neurogenesis after TBI.

Traumatic brain injury; Sphingosine-1-phosphate receptor 1; Neural stem cells; Hippocampus

1671-2897(2017)16-110-05

R 651.1

A

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81171155)

葉玉勤，博士研究生，主治醫(yī)師，E-mail: chinayeyuqin@163.com

*通訊作者： 賀曉生，教授、主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，E-mail: hexiaos@fmmu.edu.cn; 葉玉勤，博士研究生，主治醫(yī)師，E-mail: chinayeyuqin@163.com

2016-10-01；

2016-11-27)