西藏青稞品種甘農(nóng)大7號白粉菌誘導早期應答基因SSH文庫的構建及分析

徐齊君，王玉林，原紅軍，曾興權，尼瑪扎西*

(1.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學院農(nóng)業(yè)研究所，西藏拉薩850002；

2.省部共建青稞和牦牛種質(zhì)資源與遺傳改良國家重點實驗室，西藏拉薩850002)

西藏青稞品種甘農(nóng)大7號白粉菌誘導早期應答基因SSH文庫的構建及分析

徐齊君1,2，王玉林1,2，原紅軍1,2，曾興權1,2，尼瑪扎西1,2*

(1.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學院農(nóng)業(yè)研究所，西藏拉薩850002；

2.省部共建青稞和牦牛種質(zhì)資源與遺傳改良國家重點實驗室，西藏拉薩850002)

以接種白粉菌后24 h甘農(nóng)大7號材料的葉片為實驗組（tester），未接種白粉菌材料的葉片為驅動組（driver），分別提取cDNA，利用抑制差減雜交技術，構建“甘農(nóng)大7號”白粉菌誘導早期應答基因差減文庫。對所獲得的EST序列去污染后，通過與核酸和蛋白數(shù)據(jù)庫進行序列同源性比對，發(fā)現(xiàn)其中有219條非重復序列與已知序列同源性較高。對這些序列進行GO和KEGG功能分析，發(fā)現(xiàn)這些注釋的基因主要在信號轉導、基礎物質(zhì)代謝等方面發(fā)揮作用。本結果為后續(xù)探究青稞品種甘農(nóng)大7號抗白粉病的分子機制提供了方向及理論依據(jù)。

青稞；甘農(nóng)大7號；白粉??；抑制差減雜交；EST

青稞（Hordeum vulgareL.var.nudumHook.f.）是禾本科大麥屬的一種禾谷類作物，是藏區(qū)人民的主要糧食之一，也是啤酒制造和工業(yè)飼料的重要原材料[1]。在大麥的生產(chǎn)過程中，病原菌的侵害是大麥產(chǎn)量下降的主要原因之一[2-4]。進行大麥白粉病抗病機制的基礎研究，發(fā)掘有效的抗性基因，探索大麥抗白粉病的抗病機制，可以有效地推動大麥的生產(chǎn)以及對大麥的分子育種提供指導。

大麥白粉病菌 [Blumeria graminisf.sp.Hordei（Bgh）]是一類?；缘幕铙w營養(yǎng)型寄生真菌，屬于布氏白粉菌屬、子囊菌亞門核菌綱白粉病目[5]。在長期的自然進化過程中，植物形成了一套自身獨特的“防御系統(tǒng)”，以免自身受到外界生物和非生物的侵害。其中，抗病基因是植物抵御病原菌侵害過程的重要組成部分[6-7]。對這些抗病基因進行分析和克隆，對培育抗白粉病的大麥新品種具有重要的意義。

生物的生長、發(fā)育、代謝、凋亡等生命活動都是由不同的基因表達來控制的?；虮磉_的差異是生物調(diào)節(jié)生命周期的核心，研究基因的差異表達，可探究生物細胞表型差異的遺傳機理，為生命過程研究提供基本信息。抑制差減雜交（suppression subtractive hybridization,SSH）是通過DNA差減雜交與抑制PCR技術相結合，能夠高效鑒定和分離克隆差異表達基因的一門技術[8-10]。本研究以篩選得到的抗白粉病青稞材料甘農(nóng)大7號為研究對象，利用抑制差減雜交技術，構建青稞接種白粉菌后24 h和未接種白粉菌材料的差減cDNA文庫，探究青稞材料甘農(nóng)大7號在接種白粉菌后相關基因的表達情況，為研究青稞抗病相關基因的分子機理奠定基礎[11]。

1 材料與方法

1.1 材料

對西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學院核心種質(zhì)資源庫330份青稞材料進行室外與室內(nèi)苗期白粉病感染鑒定，得到抗白粉病的材料，依次為甘農(nóng)7號、C280和甘農(nóng)大NFC。本研究選擇甘農(nóng)大7號。將青稞甘農(nóng)大7號播種于塑料盆缽（170 mm×220 mm）中，在溫室中生長至4葉期后，采用涂抹法接種白粉菌，作為實驗組，以不接種的材料為對照組。接種后，在同等條件下培養(yǎng)，在24 h時收取實驗組和對照組材料的葉片，并用于RNA的提取。

1.2 實驗方法

1.2.1 總RNA提取和mRNA純化。將甘農(nóng)大7號在溫室中生長至4葉期后，分別對實驗組和對照組材料提取總RNA，提取方法參照Trizol（TaKaRa）的操作方法，用紫外分光光度計檢測所提取總RNA的質(zhì)量和濃度，然后參照Oligotex（Qiagen）的操作方法，分離和純化mRNA。

1.2.2 抑制差減雜交及PCR產(chǎn)物的克隆。根據(jù)SMART PCR cDNA Synthesis Kit(Clothtech)操作方法，將mRNA合成cDNA，然后對得到的cDNA進行純化，并在RsaⅠ酶切下產(chǎn)生比較短的平端片段，以便于下一步的接頭連接和2次的差減雜交，具體操作方法參考PCR-Select cDNA Subtraction Kit(Clothtech)說明書。分別以未接種白粉病的材料為驅動組、接種白粉病的材料為實驗組，以及以接種白粉病的材料為驅動組、未接種白粉病的材料為實驗組，進行2次差減雜交，將2種差減雜交的第2次PCR產(chǎn)物純化后，與 pMD-18T（Takara）連接，構建出 2個抑制差減cDNA文庫。將連接產(chǎn)物轉化感受態(tài)細胞DH5α，并涂布于含X-gal/IPTG和Amp的瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)過夜，隨機挑取白色克隆。

1.2.3 差減文庫cDNA片段大小檢測、測序和序列分析。將隨機挑取的200個白色克隆在37℃下培養(yǎng)5 h以上，取1 μL菌液作為模板，用Nested primer 1和Nested primer 2R為引物，進行PCR檢測，鑒定差減雜交cDNA片段。PCR反應條件如下：94 ℃、5 min；94 ℃、10 s，68 ℃、30 s，72 ℃、1.5 min，擴增30個循環(huán)。對其中的陽性克隆進行測序。

將上述測序得到的DNA片段，在美國生物信息中心網(wǎng)站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）的核酸數(shù)據(jù)庫（Blastn）和蛋白數(shù)據(jù)庫（Blastx）中，進行同源核苷酸和蛋白序列比對分析。最后，通過Blast2GO軟件，對所獲得的ESTs序列進行GO功能注釋。

2 結果與分析

2.1 總RNA和mRNA的質(zhì)量檢測

用Trizol提取常溫處理和低溫處理的甘農(nóng)大7號樣品總RNA后，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性。根據(jù)電泳條帶顯示，大部分RNA集中在18S和28S rRNA區(qū)域間，其中28S條帶的亮度約為18S條帶的1.5～2.0倍，說明提取的樣品總RNA完整性較好（圖1）。用紫外分光光度計檢測其OD260/OD280的比值均在1.85～2.10之間，說明所提取總RNA純度較高，可進一步用于提取mRNA。純化后的mRNA呈現(xiàn)彌散狀的亮帶，說明mRNA質(zhì)量較好，可用于下一步cDNA合成。

圖1 總RNA的電泳檢測

2.2 雙鏈cDNA的合成及RsaⅠ酶切消化

按照SMARTcDNA文庫合成的方法，將純化后的mRNA合成雙鏈cDNA。取5 μL雙鏈cDNA，進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示片段主要分布于200～5 000 bp之間。然后，用RsaⅠ酶切反應3 h后，產(chǎn)物主要集中在200～800 bp間（圖2），長片段得到有效的消化，說明酶切效果較好，可用于后續(xù)的實驗。

圖2 dscDNA酶解后電泳圖譜

2.3 差減文庫的構建及鑒定

將2次差減雜交得到的差異片段進行第2次PCR擴增后的產(chǎn)物，與pMD18-T連接，構建出2個抑制差減cDNA文庫。從每個差減cDNA文庫中隨機挑取200個克隆，用Nested primer 1和Nested primer 2R為引物，進行PCR鑒定，經(jīng)篩選，分別得到150和124個有效陽性克隆，插入片段長度主要分布在300～750 bp之間，隨機挑選了一些克隆PCR擴增結果如圖3。這些陽性克隆將有利于今后分離、鑒定與之相關的基因。

圖3 PCR檢測cDNA差減文庫克隆插入片段

2.4 ESTs序列分析

對274個陽性克隆進行測序，一共獲得233條高質(zhì)量的ESTs序列。將得到的233條ETSs序列與GenBank的非冗余核酸數(shù)據(jù)庫和非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫進行同源性比對分析。結果表明，其中14條序列無法比對到同源序列，可能是新基因；219條序列能夠在核酸和蛋白數(shù)據(jù)庫中有較高的同源性，其中，在大麥、高粱、蒺藜狀苜蓿、大豆、玉米、小麥等單子葉植物中具有較高的同源性（圖4）。

圖4 注釋序列在數(shù)據(jù)庫中物種同源性分布

根據(jù)在Nr數(shù)據(jù)庫的比對結果，對成功注釋的219條ESTs序列進行GO功能注釋。結果發(fā)現(xiàn)，這些序列主要在生物學過程、細胞組成及分子功能這3大類功能中被注釋，如在生物學過程中，主要在生物調(diào)節(jié)、生物的代謝過程及組織信號傳遞過程中發(fā)揮作用；在細胞組成這一大類中，主要參與構成一些細胞、大分子復合物、生物膜等；同時，在一些蛋白的綁定、轉錄因子的激活以及酶活性調(diào)控等分子功能中發(fā)揮作用，具體被注釋的序列功能，詳見圖5。

通過與KEGG數(shù)據(jù)庫的比對，可以分析被注釋的ESTs序列在青稞代謝途徑中的富集情況。利用KEGG數(shù)據(jù)庫的分類，可以簡單地將被注釋的219條ESTs序列歸類到全部的7大類代謝通路中的4類（詳見圖6），其中被注釋到蛋白質(zhì)翻譯過程和新陳代謝的ESTs序列較多，分別有13和8條。對注釋到4大類代謝通路的序列作進一步分析發(fā)現(xiàn)，其中參與能量代謝、蛋白折疊修飾、碳水化合物代謝的ESTs序列占據(jù)主導地位，分別有5、4、2條。對這些結果與GO功能注釋的結果比較分析發(fā)現(xiàn)，參與基礎代謝的這些序列在功能上具有一定相關性，并再次證明注釋結果的準確性。GO功能和KEGG代謝通路的分析表明，植物對外界環(huán)境的適應過程是一個由多系統(tǒng)調(diào)控的生物過程。通過這些被注釋的基因，將有助于對青稞病原互作過程中的分子機理的深入研究，并為培育青稞抗白粉病材料作出應有的貢獻。

3 討論

植物在生長發(fā)育過程中，經(jīng)常會受到多種病原物如細菌、真菌、病毒等的侵染。在此過程中，植物進化形成了一套獨特的針對病原物侵染的防衛(wèi)機制[12]。在對植物與病原物之間相互協(xié)同進化關系的研究過程中，F(xiàn)lor在1971年提出了“基因對基因”假說[13]。該假說認為，病原菌攜帶的毒性基因（Vir）/無毒基因（avr）和植物體內(nèi)的感病基因（r）/抗性基因（R）之間存在對應關系，只有當病原菌遇到無毒基因（avr）與寄主的抗病基因（R）互作時，植物寄主才表現(xiàn)出抗病性，“基因對基因”假說的提出能夠解釋大多數(shù)小種?；涂剐?，也適用于其他多種類型的病原菌，如病毒、細菌、真菌等[14-15]。

圖5 GO功能分析的結果

1：生物調(diào)節(jié)；2：組織或生物起源細胞組件；3：細胞過程；4：定位；5：代謝過程；6：多有機體生物進程；7：正調(diào)控生物過程；8：生物過程調(diào)控；9：應激反應；10：信號傳導；11：單一有機體生物進程；12：細胞；13：細胞組分；14：大分子復合物；15：細胞膜；16：膜組成；17：細胞器；18：細胞器組成；19：綁定；20：催化活性；21：分子功能調(diào)控；22：核結合轉錄因子激活；23：分子結構活性；24：轉運活性。

圖6 青稞白粉病差減文庫中注釋基因的代謝途徑分析

植物抵御病原物侵染，激發(fā)防衛(wèi)機制，一般需要經(jīng)過3個過程：信號識別，信號傳導，防衛(wèi)基因激活和表達[16]。植物R基因表達產(chǎn)物與病原物的avr基因產(chǎn)物相互識別并產(chǎn)生信號分子，信號分子通過信號傳導系統(tǒng)傳遞到寄主細胞、組織、器官，乃至整個植株，激活植物的防衛(wèi)反應相關基因，從而抑制病原物的侵入或擴展而表現(xiàn)為抗病性[17-18]。有研究報道，在植物與病原菌互作過程中，通常會有水楊酸（SA）、茉莉酸（JA）、乙烯（ET）、脫落酸（ABA）以及赤霉素（GA）等植物激素作為信號分子，參與抗病信號的傳遞，使寄主植物產(chǎn)生防衛(wèi)反應[19-20]。同時，也有研究表明，植物細胞的多糖物質(zhì)如細胞壁、木質(zhì)素、纖維素等在植物抵御外源病原物的過程中，也發(fā)揮重要作用。這種在病菌微生物侵染后，由植物細胞壁的化學組成產(chǎn)生的變化或物理結構修飾所介導的抗性，稱為細胞壁抗性[21]。細胞壁是植物抵御外源病原物侵染的第一道屏障，是植物防御系統(tǒng)中的重要組成部分。當病原物侵染時，植物會通過對細胞壁組成成分的改變、細胞膜通透性的變化等方式，如木質(zhì)素的積累、胼體質(zhì)的增加、細胞過氧化物酶的合成等來抵御病原物的入侵[22-23]。而白粉病菌作為一類真菌性病害，植物細胞壁是其侵染寄主細胞所必需要面對的阻礙之一[24-25]。在我們所注釋的結果中，發(fā)現(xiàn)一些基因在多糖類代謝過程、過氧化物合成以及信號傳導過程等都發(fā)揮作用，這些結果在后續(xù)深入研究青稞抗白粉病的分子機理方面將提供指導和方向。

抑制差減雜交是研究真核生物基因差異表達常用的方法之一，將不同的mRNA逆轉錄成cDNA，以cDNA為對象研究基因的差異表達。在前人的研究基礎上，本試驗以篩選得到的青稞抗白粉病材料甘農(nóng)大7號為研究對象，構建差減雜交文庫，并分析文庫涉及到的相關表達基因。這可為后期研究青稞抗白粉病的抗病機制提供優(yōu)良的材料和基因資源，為深入探討青稞的抗病機制打下基礎，并對用分子育種方法培育優(yōu)良抗白粉病大麥材料提供幫助和指導。

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本刊常用計量單位符號簡介

為執(zhí)行國務院發(fā)布的《關于在我國統(tǒng)一實行法定計量單位的命令》的規(guī)定,根據(jù)中華人民共和國國家標準(GB310-3102-93)《量和單位》，現(xiàn)將本刊常用的計量單位符號介紹如下，希廣大作者遵照執(zhí)行。

時間：日(天)-d；表格(月 /日)應用(月 - 日)，如 2/30 應用 02-30；時 -h；分 -min；秒 -s；質(zhì)量：噸 -t；公斤(千克)-kg；克 -g；毫克 -mg；微克 -μg；納克 -ng；體積：升 -L；毫升 -mL；微升 -μL；濃度：克分子濃度(M):廢用，改為摩爾每升mol/L；當量濃度(N):廢用，換算成相應的mol/L；ppm換算為相應的mg/kg、μL/L、μmol/mol等；壓強:帕(斯卡)-Pa；面積：畝 -667m2，萬畝換算為萬 hm2。

Construction and Analysis of SSH Library of the Tibetan Hull-less Barley(Hordeum vulagareL.var.nudumHK.f.)Variety Gannong Da 7 in Response toErysiphe graminis

XU Qi-jun1.2,WANG Yu-lin1.2,YUAN Hong-jun1.2,ZENG Xing-quan1.2,NYIMA Tashi1.2
(1.Tibet Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences,Lhasa 850002,China 2.State Key Laboratory of Barley and Yak Germplasm Resources and Genetic Improvement,Lhasa 850002,China)

We used the leaves of the Tibetan hull-less barley (Hordeum vulagareL.var.nudumHK.f.)variety Gannong Da 7 inoculated with powdery mildew for 24 h as the experimental group (tester),while the non-inoculated leaves served as the driver(control).Then we extracted cDNAs from the two material groups to construct Gannong Da 7 SSH library by using suppression subtractive hybridization technology.The obtained cDNA sequences in this library were compared with those in GenBank.We randomly selected 274 positive clones for sequencing,resulting in 233 high quality ESTs.The analyses of Blast2 GO and KEGG revealed that these genes function in constituting cellular components,photosynthesis,and signal transduction.This work sheds new lights on the direction of our future research,and builds a theoretical basis on further studying the molecular mechanisms of the resistance to powdery mildew in the highland barley variety Gannong Da 7.

Hull-less Barley;Gannong Da 7;Erysiphe graminis;SSH;EST

S512.3；S432.4

A

1673-6486-20170366

徐齊君,王玉林,原紅軍,曾興權,尼瑪扎西.西藏青稞品種“甘農(nóng)大7號”白粉菌誘導早期應答基因SSH文庫的構建及分析[J/OL].大麥與谷類科學,2017,34(5):8-12，17[2017-10-15].http://kns.cnki.net/kcms/detail/32.1769.S.20171015.1740.002.html.

2017-05-31

西藏科技重大專項（Z2016B01N01）；西藏財政專項（2017 CZZX001/02）；西藏自治區(qū)自然基金（2016ZR-15-47）。

徐齊君（1984—），女，碩士，助理研究員，主要從事青稞遺傳育種研究。E-mail:xuqijun_1314@163.com。

*通訊作者：尼瑪扎西（1966—），男，博士，研究員，主要從事青稞遺傳育種研究。E-mail:nima_zhaxi@sina.com。