張澤洲, 朱元元, 李 夢(mèng), 李 單, 侯遇珠, 袁林喜*, 尹雪斌
1.江蘇省硒生物工程技術(shù)研究中心, 江蘇 蘇州 215123;2.中國(guó)地質(zhì)大學(xué)(武漢), 生物地質(zhì)與環(huán)境地質(zhì)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430074;3.中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)蘇州研究院, 功能農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 江蘇 蘇州 215123
生物樣品中硒的形態(tài)分析方法研究進(jìn)展
張澤洲1,2, 朱元元1, 李 夢(mèng)1, 李 單1, 侯遇珠1, 袁林喜1*, 尹雪斌3*
1.江蘇省硒生物工程技術(shù)研究中心, 江蘇 蘇州 215123;2.中國(guó)地質(zhì)大學(xué)(武漢), 生物地質(zhì)與環(huán)境地質(zhì)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430074;3.中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)蘇州研究院, 功能農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 江蘇 蘇州 215123
對(duì)近年來(lái)關(guān)于生物樣品中微量元素硒的形態(tài)分析方法的研究成果進(jìn)行了綜述,總結(jié)了高硒生物樣品(>10 mg Se/kg)和低硒生物樣品(<1 mg Se/kg)的硒形態(tài)組分提取方法,以及利用液相色譜-原子熒光光譜(LC-AFS)、高效液相色譜與電感耦合等離子質(zhì)譜(HPLC-ICP-MS)等儀器聯(lián)用的方法分離、檢測(cè)硒的形態(tài)組分。此外,對(duì)利用同步輻射X射線微區(qū)分析方法(STXM)原位微區(qū)分析微生物樣品的硒形態(tài)及其分布進(jìn)行了綜述與展望。
硒形態(tài)分析;硒代氨基酸;液相色譜-原子熒光光譜(LC-AFS);高效液相色譜與電感耦合等離子質(zhì)譜(HPLC-ICP-MS);同步輻射X射線微區(qū)分析(STXM)
硒是人和動(dòng)物所必需的微量元素,具有提高免疫力、保護(hù)心臟等作用[1]。大量研究表明[2~7],硒的生理、毒理影響以及環(huán)境行為、生物利用度和遷移程度主要取決于其形態(tài)。目前的研究發(fā)現(xiàn)硒在環(huán)境介質(zhì)中主要以Se2-、Se0、Se4+、Se6+的形式存在,一般通過(guò)化學(xué)試劑連續(xù)提取的方法予以分析[8,9];硒在植物樣品中主要以硒代蛋氨酸(SeMet)、硒代胱氨酸(SeCys2)、硒甲基硒代半胱氨酸(SeMeCys)、Se4+、Se6+、納米硒等形式存在[4,10,11],而硒在動(dòng)物和微生物樣品中主要以硒代胱氨酸(SeCys2)的形式存在[12~16],一般采用液相色譜-原子熒光光譜(LC-AFS)、高效液相色譜與電感耦合等離子質(zhì)譜(HPLC-ICP-MS)等儀器聯(lián)用的方法予以分析。
本文綜述了近幾年來(lái)對(duì)不同基質(zhì)生物樣品中硒形態(tài)的提取方法,以及硒形態(tài)組分分離檢測(cè)方法的研究進(jìn)展,以期為生物樣品中硒形態(tài)的準(zhǔn)確分析提供參考。
在對(duì)生物樣品中硒的形態(tài)進(jìn)行分析時(shí),選擇恰當(dāng)?shù)臉悠非疤幚硖崛》椒ㄊ种匾?。目前?duì)生物樣品中硒形態(tài)組分的提取方法主要包括液相萃取、微波萃取、固相萃取和酶提法等技術(shù)[17],而酶提法因具有反應(yīng)條件溫和、產(chǎn)物不易變性和提取效率高等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用[4,13,18,19]。常規(guī)提取方法主要通過(guò)Tris-HCl緩沖液、結(jié)合纖維素酶(針對(duì)于谷物類、豆類及蔬菜類等植物類樣品)或脂肪酶(針對(duì)于肉類、蛋類等動(dòng)物類樣品)的預(yù)處理,利用蛋白酶K和蛋白酶XIV的連續(xù)酶解提取,從而獲得樣品的硒代氨基酸形態(tài)特征[20]。
張如等[21]從壺瓶碎米薺新鮮葉片中分離純化耐硒內(nèi)生菌株,并運(yùn)用上述常規(guī)酶提法研究?jī)?nèi)生菌株CSN-1對(duì)亞硒酸鈉的體外代謝特征,發(fā)現(xiàn)其可將亞硒酸鈉轉(zhuǎn)化為硒代胱氨酸。張濤等[22]采取多種非特異性蛋白酶分階段對(duì)大米樣品進(jìn)行硒形態(tài)提取,蛋白酶斷開蛋白鏈中的肽鍵,使之盡可能完全水解,并用色譜與質(zhì)譜聯(lián)用分析其中的含硒氨基酸,確定了富硒大米中的硒形態(tài)。Gergely等[23]利用常規(guī)酶提法分析了雙孢蘑菇中硒形態(tài)的分布,并對(duì)酶消解、Tris-HCl緩沖液、NaOH這3種提取方案的效果進(jìn)行比較,結(jié)果發(fā)現(xiàn)蛋白酶與Tris-HCl結(jié)合對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理的提取率較高。
盡管常規(guī)酶提取法能處理大部分常見的生物樣品,但是在實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中,對(duì)高硒含量和低硒含量的生物樣品、真菌類樣品均存在硒的提取率較低、代表性不足等問(wèn)題,下文針對(duì)這些特殊樣品提取方法的研究進(jìn)行了總結(jié)和歸納。
1.1高硒含量生物樣品中硒形態(tài)的提取
由于高硒含量(>10 mg Se/kg)的生物樣品(如高硒植物樣品、高硒動(dòng)物樣品)中游離硒代氨基酸的含量相對(duì)較高[24],可縮減提取過(guò)程中的酶解步驟,即可在Tris-HCl(pH 7.5)的緩沖條件下,僅加入蛋白酶XIV(植物樣品需同時(shí)加入纖維素酶,動(dòng)物樣品需同時(shí)加入脂肪酶)。相對(duì)于常規(guī)酶提法,此方法可以顯著縮短提取時(shí)間、提高檢測(cè)效率。Yuan等[4]利用上述改進(jìn)的提取方法對(duì)硒超累積植物壺瓶碎米薺(100~8 000 μg Se/kg)的根、莖、葉組織進(jìn)行了硒形態(tài)分析,發(fā)現(xiàn)硒的提取率高達(dá)80%以上,其主要硒形態(tài)為硒代胱氨酸,占總硒含量的74%~99%,顯著有別于沙漠王羽、雙鉤黃芪等硒超累積植物(主要硒形態(tài)為硒甲基硒代半胱氨酸)。Zhu等[12]利用上述方法對(duì)富硒雞蛋中硒的形態(tài)進(jìn)行了檢測(cè)分析,發(fā)現(xiàn)雞蛋中主要存在的硒形態(tài)為硒代蛋氨酸,占總硒的60%以上,此外,蛋黃中有部分硒代胱氨酸被檢出,而在蛋青中并沒(méi)有其他硒形態(tài)出現(xiàn)。
1.2低硒含量生物樣品中硒形態(tài)的提取
對(duì)于一些硒含量較低(<1 mg Se/kg)且難以酶解的生物樣品,若提取方法只是加酶水解后離心提取上清液進(jìn)行檢測(cè),樣品中各硒形態(tài)的含量不僅達(dá)不到儀器的檢測(cè)限,且樣品中復(fù)雜的基質(zhì)也會(huì)嚴(yán)重影響儀器的檢測(cè)結(jié)果,甚至對(duì)儀器造成損害。而且,這類樣品中硒代氨基酸多存在于多肽或硒蛋白中,水解過(guò)程較長(zhǎng)且提取效果不理想。因此,可以采用“蛋白酶XIV+超聲輔助(+加熱震蕩)+提純濃縮”的改進(jìn)方法,在此改進(jìn)方法中,甲醇-水相可以提高各硒形態(tài)的溶解度,以提高該方法的提取率;氯仿可萃取出脂溶性或非極性且較為復(fù)雜的基質(zhì),并且可以使未水解完全的蛋白質(zhì)變質(zhì)沉淀,以達(dá)到除雜的目的[5, 6]。
利用光譜法、質(zhì)譜法等單一檢測(cè)方法分析硒形態(tài),雖然簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì),但干擾因素多且選擇性差。1980年,Hirschfeld[25]首次提出聯(lián)用技術(shù),推動(dòng)了儀器聯(lián)用技術(shù)的迅速發(fā)展和應(yīng)用。儀器聯(lián)用技術(shù)通常將高靈敏度的檢測(cè)技術(shù)與高選擇性的分離技術(shù)串聯(lián)在一起,利用該技術(shù)檢測(cè)硒形態(tài)具有靈敏度高、準(zhǔn)確度強(qiáng)和分析速度快等優(yōu)勢(shì)[26]。分離技術(shù)如氣相色譜、液相色譜以及毛細(xì)管電泳法等的迅速發(fā)展,檢測(cè)技術(shù)如原子熒光、原子吸收、等離子體質(zhì)譜等技術(shù)的更新,以及各種連接技術(shù)的陸續(xù)發(fā)現(xiàn),為硒的形態(tài)分析提供了技術(shù)支持。目前普遍運(yùn)用且較為成熟的聯(lián)用技術(shù)為液相色譜-原子熒光光譜[4,21,27,28]以及高效液相色譜與電感耦合等離子質(zhì)譜[5,6,29~31]。
2.1LC-AFS聯(lián)用
液相色譜-原子熒光光譜聯(lián)用技術(shù)采用液相色譜作為硒形態(tài)的分離系統(tǒng),同市面上的其他色譜聯(lián)用系統(tǒng)相比,原子熒光檢測(cè)器結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、價(jià)格便宜,更易于推廣應(yīng)用[32]。但該系統(tǒng)中的檢測(cè)器AFS相比ICP-MS,具有較高儀器檢測(cè)限,因此一些低硒樣品中各硒形態(tài)由于含量低于檢測(cè)限而無(wú)法進(jìn)行檢測(cè),進(jìn)而限制了檢測(cè)樣品類型的范圍。Yuan等[4]用LC-UV-AFS對(duì)壺瓶碎米薺進(jìn)行硒形態(tài)檢測(cè),其中液相色譜部分用Hamilton PRPX-100陰離子交換柱(4.1 mm×250 mm×10 μm),流動(dòng)相為40 mmoL/L的NH4H2PO4溶液(pH 6.0),流速為1 mL/min,并以UV-HG-AFS作為檢測(cè)器。結(jié)果檢測(cè)出硒代胱氨酸、硒代蛋氨酸、亞硒酸根及硒甲基半胱氨酸4種硒化合物。Zhu等[12]利用上述檢測(cè)方法快速分離檢測(cè)出了雞蛋中的硒形態(tài),4種硒形態(tài)在7 min內(nèi)均能良好分離。該硒形態(tài)分離檢測(cè)方法還成功應(yīng)用于食用菌[13,15]、植物內(nèi)生菌[21]及水稻[33]等作物。
2.2HPLC-ICP-MS聯(lián)用
高效液相色譜(HPLC)是利用各種色譜柱對(duì)不同種類樣品進(jìn)行分離的高效分離技術(shù),該分離技術(shù)尤為適用于熱穩(wěn)定性差且極性強(qiáng)的硒形態(tài)分析,而電感耦合等離子質(zhì)譜具有元素專一性且檢測(cè)限低等優(yōu)點(diǎn),將二者聯(lián)用可明顯提高檢測(cè)的靈敏度、準(zhǔn)確性以及分析速度,該聯(lián)用技術(shù)可用于多種生物樣品中硒等元素的形態(tài)定量分析[34]。
通常用于元素分析的高效液相分離技術(shù)包括:排阻色譜、手性色譜、反相色譜和陰離子交換色譜等。由于陰離子交換色譜具有固有的分離再現(xiàn)性和分離非揮發(fā)性硒化合物的優(yōu)勢(shì),常被用于分離硒形態(tài)[35~37]。基于PRP-X100型陰離子交換柱,采用不同的流動(dòng)相測(cè)定多種樣品中硒形態(tài)的研究方法被廣泛應(yīng)用。Sanchez等[38]以80 mmoL KH2PO4/K2HPO4(pH 6.0)作為流動(dòng)相檢測(cè)出水藻中硒的形態(tài)為無(wú)機(jī)硒和硒代氨基酸。Floor等[36]利用梯度洗脫的方法,采用pH為3.0~4.8、10~20 mmoL檸檬酸鹽作為流動(dòng)相測(cè)定酸性環(huán)境樣品中的硒形態(tài),但酸性環(huán)境樣品中溶酸性流動(dòng)相會(huì)形成沉淀?yè)p壞色譜柱。而銨鹽在等離子體條件下為揮發(fā)性物質(zhì),不會(huì)產(chǎn)生鹽沉淀,進(jìn)而保護(hù)霧化器以及避免對(duì)檢測(cè)過(guò)程造成干擾[39,40]。
ICP-MS在分析檢測(cè)硒形態(tài)時(shí),在靈敏度、選擇性及專一性方面與其他檢測(cè)器相比具有明顯的優(yōu)勢(shì),但同時(shí)也存在較為明顯的多原子離子干擾(40Ar和36Ar+對(duì)77Se,40Ar和36Ar對(duì)76Se等)[41]。目前可以克服該問(wèn)題的方法為檢測(cè)樣品中硒的其他天然同位素,選擇盡可能不受干擾或干擾較小且豐度高的同位素。硒有6種天然同位素分別是74Se、76Se、77Se、78Se、80Se、82Se。同位素80Se(天然豐度最大,為49.61%)不能使用質(zhì)譜來(lái)檢測(cè),原因是氬的二聚物Ar2在質(zhì)荷比等于80處存在干擾峰;同位素74Se的豐度太小(天然豐度為0.89%),造成儀器的靈敏度響應(yīng)值低;同位素76Se(天然豐度為9.37%)受多原子離子40Ar、36Ar的干擾;同位素77Se(天然豐度為7.63%)和82Se(天然豐度為8.73%)的天然豐度無(wú)法滿足儀器的靈敏度檢測(cè)要求;而78Se具有相對(duì)較高的天然豐度值(23.77%),在ICP-MS的信號(hào)響應(yīng)高,因此,可以采用78Se作為監(jiān)測(cè)質(zhì)量數(shù)。另一種方法是利用碰撞反應(yīng)池技術(shù)(CCT)除去形成的多原子離子。羅樂(lè)等[42]利用HPLC-ICP-MS聯(lián)用技術(shù)分析了在工業(yè)廢渣中硒的形態(tài),結(jié)果證明CCT動(dòng)態(tài)反應(yīng)碰撞模式能有效降低多原子離子檢測(cè)的干擾,優(yōu)化ICP-MS檢測(cè)環(huán)境。
因此,本研究組建立了基于SHIMADZU LC-20AT-Thermo Fisher Series X2的HPLC-ICP-MS分離檢測(cè)方法:選用Hamilton PRPX-100陰離子交換柱(4.1 mm×250 mm×10 μm),以6 mmoL/L檸檬酸銨+2%甲醇溶液(pH 5.3)作為流動(dòng)相,流速為1 mL/min,選用78Se作為檢測(cè)質(zhì)量數(shù)對(duì)5種硒形態(tài)混標(biāo)進(jìn)行11次重復(fù)檢測(cè),得出該方法的儀器檢測(cè)限(LOD)及方法檢測(cè)限(LOQ)(數(shù)據(jù)未發(fā)表)。在該方法條件下,5種硒形態(tài)儀器檢測(cè)限為0.52~1.81 ng/g,方法檢測(cè)限為1.55~5.44 ng/g,且該方法具有良好重現(xiàn)性,RSD為0.85%~3.00%,故該HPLC-ICP-MS分離檢測(cè)方法可滿足大部分樣品的硒形態(tài)檢測(cè),甚至可檢出一些痕量硒化合物。
同步輻射X射線微區(qū)分析方法(scanning transmission X-ray microscope,STXM)因其具有能量高、穿透力強(qiáng)、檢測(cè)限低(mg/kg級(jí))、可進(jìn)行快速面掃描以及三維重構(gòu)、元素形態(tài)特征分析以及無(wú)損分析等獨(dú)特優(yōu)勢(shì),并對(duì)特定元素在生物體中的分布、成像、存在形式以及相互關(guān)系的研究中具有重要的地位,在微生物與元素的成礦作用、代謝作用等研究中具有巨大的應(yīng)用潛力[43]。Yoon等[44]用STXM C 1s譜峰獲得了Caulobactercrosentus生物膜中的蛋白和胞外聚合物的分布圖,隨后獲得了Al k邊成像特征,確定了Al在生物膜中的分布及其形態(tài)特征。Toner等[45]用STXM方法獲得了P.putida生物膜的分布特征,并觀察到發(fā)生在膜上的Mn(Ⅱ)通過(guò)酶催化氧化為Mn(Ⅲ)和Mn(Ⅳ)的動(dòng)態(tài)過(guò)程。2006年,Dynes等[46]極大地推進(jìn)了STXM方法的發(fā)展,他們通過(guò)C k和O k獲得一種細(xì)菌-藻類生物膜的細(xì)胞和胞外聚合物分布特征及其中的氧化物組成特征,并通過(guò)Fe L譜峰定量獲得Fe(Ⅱ)與Fe(Ⅲ)的比值,以及Mn、Ni的含量,從而獲得了高分辨的多元素化學(xué)形態(tài)成像。2011年,美國(guó)農(nóng)業(yè)部的Banuelos等[47]首次應(yīng)用斯坦福同步輻射加速器方法測(cè)試了1株耐旱、耐鹽、超累積硒的沙漠仙人掌中硒的分布及其形態(tài)特征,發(fā)現(xiàn)硒在該植物的葉面錐體、種子中極端富集硒,而且以硒代蛋氨酸的形式存在。在國(guó)內(nèi),中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心的朱永官團(tuán)隊(duì)借助上海光源的微束熒光法獲得了大米中硒(Se)和鋅(Zn)的二維分布圖,發(fā)現(xiàn)Se主要集中在大米的表面,Zn主要集中在大米的頂端,對(duì)營(yíng)養(yǎng)元素的遷移、轉(zhuǎn)化、富集機(jī)制提供了重要的信息[48]。
本研究組在上海同步輻射光源利用STXM線站對(duì)湖北恩施硒礦區(qū)分離的嗜菌微生物開展了原位分析,獲得了有效的硒原位分布(圖1)及形態(tài)數(shù)據(jù)(表1)。從硒形態(tài)的空間分布來(lái)看(圖1),硒的賦存均發(fā)生在微生物的表面,尤其是微生物聚集的地方;各硒形態(tài)分布的位置相對(duì)統(tǒng)一,但各分布位置中硒形態(tài)占比差異較大(表1),主要的形態(tài)為Se4+(56.87%),且硒代胱氨酸占比最少(0.40%);Se0難溶于水,傳統(tǒng)的間接化學(xué)提取方法無(wú)法檢測(cè),而同步輻射這類分析方法可以做到非破壞性的直接物理分析,結(jié)果顯示Se0占總硒的10.63%(未發(fā)表數(shù)據(jù))。
圖1 湖北恩施硒礦區(qū)礦坑排水體系中嗜硒細(xì)菌的STXM分析Fig.1 STXM analysis of bacterial products isolated from selenium mine-drainage area in Enshi, Hubei.注:A:亞硒酸鈉Na2SeO3;B:硒酸鈉Na2SeO4;C:?jiǎn)钨|(zhì)硒Se;D:硒代蛋氨酸SeMet;E:硒甲基半胱氨酸SeMeCys;F:硒代胱氨酸SeCys2。
特征峰最小值計(jì)數(shù)最大值計(jì)數(shù)質(zhì)量總量占比(%)Na2SeO31413.27.433×10-64.8430×10-5163.31256.87Na2SeO41416.26.636×10-64.2323×10-576.87026.77Se1408.43.798×10-61.3073×10-530.52710.63SeMet1409.62.648×10-61.1593×10-512.9504.51SeMeCys1410.03.283×10-61.1783×10-52.3900.83SeCys21410.43.096×10-61.0830×10-51.4140.40
注:分析條件為雙能量掃描(dual energy scan),參數(shù):背景能量為1 405 eV, 10 mm×7.5 mm, 步長(zhǎng)0.03 mm,停留時(shí)間5 ms; 數(shù)據(jù)處理:SSRF-STXM雙能元素分布軟件。
硒在毒理學(xué)、生理學(xué)及環(huán)境科學(xué)上的重要性愈來(lái)愈為人們所重視,硒的測(cè)定方法研究從痕量和超痕量向有機(jī)硒化合物的方向發(fā)展。然而高效液相色譜與電感耦合等離子質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)并不能提供化合物分子結(jié)構(gòu),所以無(wú)法對(duì)多數(shù)痕量元素形態(tài)進(jìn)行定性分析。對(duì)于缺乏標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的硒形態(tài)檢測(cè),需要其他儀器對(duì)硒形態(tài)分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定。由于硒形態(tài)穩(wěn)定性較差,在前處理過(guò)程中極易被氧化或相互轉(zhuǎn)化,進(jìn)而對(duì)定性定量工作造成很大困擾。因此,對(duì)樣品分析前的干燥處理應(yīng)使用冷凍干燥,避免高溫烘干,凍干樣品的粉碎應(yīng)在液氮保護(hù)下進(jìn)行。
硒元素形態(tài)體系的分析(包括無(wú)機(jī)硒、硒代氨基酸、硒多糖、硒核酸、納米硒等)可為硒與重金屬(汞、鎘、砷、鉛等)、主要營(yíng)養(yǎng)成分(鈣、鐵、鋅、維生素等)之間關(guān)系提供分析基礎(chǔ)以及鑒定標(biāo)準(zhǔn)。含有某些微量營(yíng)養(yǎng)元素的功能食品已得到初步的發(fā)展,但這類食品中的微量元素形態(tài)分析方法仍有待完善。
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ProgressonSeleniumSpeciationAnalysisinBiologicalSamples
ZHANG Zezhou1,2, ZHU Yuanyuan1, LI Meng1, LI Dan1, HOU Yuzhu1, YUAN Linxi1*, YIN Xuebin3*
1.JiangsuBio-engineeringResearchCentreofSelenium,JiangsuSuzhou215123,China; 2.StateKeyLaboratoryofBiogeologyandEnvironmentalGeology,ChinaUniversityofGeosciences,Wuhan430074,China; 3.KeyLaboratoryofFunctionalAgriculture,SuzhouInstituteforAdvancedStudy,UniversityofScienceandTechnologyofChina,JiangsuSuzhou215123,China
Based on recent researches on selenium (Se) speciation analysis on biological samples, the modified extraction methods on Se speciation and composition from high Se contents samples (>10 mg Se/kg) and low Se contents samples (<1 mg Se/kg) were summarized, respectively. The liquid chromatography-atomic fluorescence spectrometry (LC-AFS) and high performance liquid chromatography-inductively coupled plasma-mass spectrometry (HPLC-ICP-MS) employed to separate and determine the Se speciation and composition were discussed. Furthermore, the synchrotron radiation scanning transmission X-ray microscopy (STXM) method was reviewed and prospected on total Se and Se speciation distributionsinsituon bacteria samples.
selenium speciation analysis; selenoaminoacid; liquid chromatography-atomic fluorescence spectrometry (LC-AFS); high performance liquid chromatography-inductively coupled plasma-mass spectrometry (HPLC-ICP-MS); synchrotron radiation scanning transmission X-ray microscopy (STXM)
2017-08-02;接受日期2017-08-29
國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31400091)資助。
張澤洲,博士研究生,研究方向?yàn)槲⒘吭胤治雠c應(yīng)用。E-mail:280602128@qq.com。*通信作者:袁林喜,研究員,博士,研究方向?yàn)樯餇I(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化。E-mail:yuanlinxi001@gmail.com;尹雪斌,副教授,博士,研究方向?yàn)楣δ苻r(nóng)業(yè)。E-mail:xbyin@ustc.edu.cn
10.19586/j.2095-2341.2017.0106