高產鐵載體根際菌的篩選鑒定及硒活化特性評價

龍云川, 陳 軒, 周少奇,3*

1.貴州科學院貴州省生物研究所, 貴陽 550009; 2.貴州大學資源與環(huán)境工程學院, 貴陽 550025; 3.華南理工大學環(huán)境與能源學院, 廣州 510006

高產鐵載體根際菌的篩選鑒定及硒活化特性評價

龍云川1,2, 陳 軒2, 周少奇1,2,3*

1.貴州科學院貴州省生物研究所, 貴陽 550009; 2.貴州大學資源與環(huán)境工程學院, 貴陽 550025; 3.華南理工大學環(huán)境與能源學院, 廣州 510006

通過對高產鐵載體根際菌的分離鑒定及其活化土壤硒的性能研究，揭示根際菌產鐵載體與活化硒素性能的相關性。利用鉻天青(chrome azural S，CAS)平板法從貴州開陽地區(qū)玉米根際土壤中篩選出產鐵載體菌株，而后定量檢測其產鐵載體能力,采用Salkowski比色法檢測其產吲哚乙酸能力,通過16S rRNA序列對其進行分析鑒定；另外，通過浸提劑提取的水溶態(tài)硒、有效硒含量高低反應菌株對土壤硒的活化能力。研究結果顯示：5株菌株具有較強的鐵載體分泌能力，其中菌株WD06鐵載體活性單位高達73%，達到產鐵載體能力較高級；各菌株均具有一定的產吲哚乙酸的能力；各菌株可對土壤中的硒起到較強的活化作用，將水溶態(tài)硒含量提高2.50～7.85倍、有效硒含量提高0.46～4.72倍；3株硒活化效果較好的菌株中，WD01經鑒定為Klebsiellamichiganensis,WD06為Serratiamarcescens,WD07為Enterobacterxiangfangensis。該研究結果為土壤硒微生物強化策略提供了一定的參考。

根際菌；鐵載體；生物強化策略；土壤硒

硒是生命體所必需的微量元素，有“生命火種”的美譽[1]。植物硒是人體攝入硒的主要來源，而土壤硒的生物有效性低是導致植物硒含量偏低的主要原因[2]。因此，提高土壤中硒的生物有效性具有重要的意義[3]。

土壤中硒的形態(tài)、遷移及生物有效性受環(huán)境中微生物的高度影響[4]。張如等[5]從湖北恩施富硒土壤中獲得1株耐硒內生菌，能將亞硒酸鈉轉化為硒代半胱氨酸，并能提高作物對硒的吸收和轉運能力。相關研究發(fā)現(xiàn)，在貧硒土壤中也含有大量的能耐受硒和具有硒代謝能力的可培養(yǎng)微生物[6]。Durán等[7]通過接種叢枝菌根真菌和根際菌(Enterobactersp. B16)，大幅提高了小麥谷粒中的硒含量。Acua等[6]發(fā)現(xiàn)硒活化菌能轉化50%～80%的硒，并且能幫助硒轉移進入小麥苗葉片內。這些研究表明：接種硒活化菌是一種硒生物強化(biofortification)的有效手段[3,7]。

鐵載體是微生物在缺鐵環(huán)境下分泌的一種可高效結合鐵并供給微生物細胞的小分子螯合物，能促進微生物對鐵元素的吸收[8]。鐵載體也可與Al3+、Cu2+、Cd2+、Pb2+等金屬形成可溶的金屬-鐵載體螯合物從而提高其溶解性，促進植物對金屬的富集[9,10]。產鐵載體根際菌(siderophore-producing rhizobacteria，SPR)在促進植物生長發(fā)育、增加作物產量、提高植物的抗逆性以及抑制根際有害菌群等方面也發(fā)揮著重要的作用[11,12]。這都預示著產鐵載體根際菌在促植物生長及活化元素方面所具有的巨大潛力。

貴州具有典型的喀斯特山地地貌，當?shù)厮亮魇乐?、土壤貧瘠[13]。SPR植物促生作用將有助于作物生長以及生態(tài)恢復。硒是一種類金屬元素，其化學性質介于金屬和非金屬之間,且具有部分金屬性[13]。目前，尚無產鐵載體根際菌對硒活化的研究報道。但基于鐵載體對多種金屬元素的活化作用以及硒元素的類金屬性，可推測鐵載體對硒也具有一定的活化作用，本文將驗證并探究產鐵載體菌株對硒的活化能力和規(guī)律。

本研究以貴州省開陽地區(qū)玉米根際土壤為研究對象，利用CAS平板法篩選高產鐵載體根際菌株，并定量及定性檢測鐵載體，分析菌株生物學地位、產吲哚乙酸能力及鐵載體分泌規(guī)律，同時測定菌株對土壤中硒元素的活化能力，以期為在喀斯特地區(qū)富硒土壤上通過微生物強化技術充分利用土壤硒元素資源、生產富硒農產品提供參考。

1 材料與方法

1.1培養(yǎng)基及試劑

鉻天青(CAS)檢測平板，即鐵載體篩選培養(yǎng)基[14]：100 mL含10 mL純牛奶，0.2 g蔗糖，2 mL 1 mmol/L MgSO4，100 μL 1 mmol/L CaC12，1.8 g瓊脂，加熱，約60℃時緩慢加入CAS染液和磷酸鹽緩沖液各5 mL，即得CAS藍色檢測培養(yǎng)基。

CAS染液：1 mmol/L鉻天青，4 mmol/L十六烷基三甲基溴化銨，0.1 mmol/L FeCl3。

磷酸鹽緩沖液(pH 6.8)：每100 mL含Na2HPO4·12H2O 2.427 g，NaH2PO4·2H2O 0.590 5 g，KH2PO40.075 g，NH4Cl 0.250 g，NaCl 0.125 g。所有上述溶液均用去離子水配制。

KMB液體培養(yǎng)基：甘油 15 mL，酸水解酪蛋白 5 g，K2HPO42.5 g，MgSO41.0 g，去離子水定容至 1 000 mL，pH自然。

SMS液體培養(yǎng)基：1%蔗糖，0.1%(NH4)2SO4，2% K2HPO4，0.05% MgSO4，0.01% NaCl，0.05%酵母浸出物，pH 7.2。

LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，NaCl 1%，pH 7.2。

Salkowski試劑：0.5 mol/L FeCl32 mL，35% HClO498 mL。

1.2土樣的采集與梯度濃度馴化

在貴州省開陽縣玉米耕作地中，選取健壯的玉米植株，去除表層雜物和土壤，將玉米連根拔起，抖掉根系周圍的大顆粒及松散土壤，收集附著于根系上的細土于無菌采樣袋中，做好標記并帶回實驗室及時進行高產鐵載體根際菌的篩選。

我國土壤含硒量平均值為0.290 mg/kg；貴州土壤含硒量的平均值(0.369 mg/kg)高于全國其他地區(qū)；而開陽地區(qū)屬于貴州高硒區(qū)，土壤硒的平均含量為3.261 mg/kg[13]。本研究所采集的田間土壤全硒平均含量為1.42 mg/kg，屬于硒豐富土壤。

向SMS液體培養(yǎng)基中加入亞硒酸鈉，濃度逐步遞增，使Se4+濃度梯度分別為20 mg/L、40 mg/L、80 mg/L、120 mg/L、160 mg/L、200 mg/L、400 mg/L、600 mg/L、800 mg/L。稱取10 g土樣置于90 mL SMS液體培養(yǎng)基中，32℃，150 r/min培養(yǎng)18～24 h后，吸取10 mL培養(yǎng)液于上述含硒液體培養(yǎng)基中進行梯度馴化與富集。將富集后的菌液用稀釋涂布法進行分離、純化及菌種保藏。

1.3高產鐵載體微生物的篩選與產鐵載體能力測試

產鐵載體根際菌的初步篩選采用CAS平板分析法。將抗硒菌株劃線接種于CAS檢測平板上，32℃培養(yǎng)24～48 h，根據平板上顏色的變化(由藍到橙)及光圈直徑大小初步篩選出產鐵載體菌株。

鐵載體定量檢測[15]：將菌株于KMB液體培養(yǎng)基中28℃培養(yǎng)24～48 h后，10 000 r/min離心10 min，將上清液稀釋10倍，加入等體積CAS檢測液并混合，靜置60 min后于630 nm檢測吸光度A。將培養(yǎng)基稀釋10倍后，與CAS等體積混勻測得吸光度Ar。依據相關文獻[16]對微生物產鐵載體的能力進行劃分，A/Ar從1.0～0之間以0.2為間隔，每減少0.2增加一個“+”。鐵載體活性單位[17](siderophore unit,SU)=[(Ar-A)/Ar]×100。

將分泌鐵載體能力較強的菌株接種于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，按以上方法進行鐵載體定量檢測，以探究培養(yǎng)基對菌株產鐵載體能力的影響。

1.4菌株特性研究

菌株生長規(guī)律及鐵載體分泌規(guī)律測定：將菌株以1%接種量接種于KMB液體培養(yǎng)基中，28℃，160 r/min振蕩培養(yǎng)，每隔2 h取樣，分光光度計檢測OD600值。同時，按步驟1.3進行鐵載體定量檢測，測定樣品OD630值，并計算SU。

菌株產吲哚乙酸測定：采用salkowski比色法[18]，將菌株接種于吲哚乙酸培養(yǎng)基中32℃培養(yǎng)48 h，取發(fā)酵液1 mL與2 mL Salkowski試劑充分混合，靜置30 min后，測定OD530值[12]。

1.5菌株對土壤硒的活化

利用浸提劑提取的化學有效性高低來反映土壤硒的生物有效性[19]。將所采集的田間土壤粉碎、混勻，部分土壤經180℃、4 h干熱滅菌；剩余土壤于室內自然風干。稱取20 g 土樣置于直徑為12 cm的無菌培養(yǎng)皿中，吸取5 mL 菌液(108cfu/mL)于上述干燥的土壤中(此時土壤濕度約為50%～60%)，室溫(20℃)培養(yǎng)10 d；吸取5 mL無菌水置于上述無菌培養(yǎng)皿土樣中，室溫培養(yǎng)10 d作為對照組。用超純水浸提土壤中水溶態(tài)硒[20]；用磷酸二氫鈉溶液浸提土壤中有效硒[19]。樣品經相關處理后，其硒含量用原子熒光光譜儀測定。

1.6菌株的鑒定

采用DNA抽提試劑盒(上海生工)提取基因組DNA，采用通用引物7F(5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′)和1540R(5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′)擴增菌株16S rRNA片段。PCR反應體系(25 μL)為：模板 0.5 μL，10×Buffer 2.5 μL，dNTP 1 μL，酶0.2 μL，引物各0.5 μL，加雙蒸水補足至25 μL。PCR 循環(huán)條件為：94℃預變性4 min；94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，共30 個循環(huán)；72℃延伸10 min。基因測序后序列結果與NCBI數(shù)據庫做Blast分析。采用Clustal X軟件將序列與標準菌株片段進行比對，運用Mega 5.2構建進化樹。

1.7數(shù)據處理

采用Microsoft Excel 2013軟件進行數(shù)據處理，用origin 8.5軟件進行圖表制作，通過SPSS 21.0軟件進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1鐵載體高產菌株的篩選

2.1.1產鐵載體菌的定性篩選 土樣經梯度濃度馴化后用平板稀釋法分離，挑選出11株生長良好、菌落特征不同的單菌落菌株，依次命名為WD01～WD11。利用CAS平板法初步篩選，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)平板產生不同程度紫粉色，部分菌株的CAS檢測結果見圖1。其中菌株WD01、WD04、WD06、WD07、WD10和WD11(圖1)產生的紫粉色圈較大。根據相關文獻對產鐵載體陽性菌株篩選實驗現(xiàn)象[9]，認定以上菌株為產鐵載體陽性菌株。這些菌株在CAS平板上生長和出圈較快，培養(yǎng)約12 h便可形成產鐵載體圈，產鐵載體圈與菌落直徑比約2～6；培養(yǎng)時間越長菌圈越大，最終可使平板大半部分變?yōu)樽戏凵?；反復傳代后菌株產鐵載體能力也較穩(wěn)定。菌株WD09(圖1)顏色圈較弱，其產生鐵載體能力弱。綜上所述，菌株WD01、WD04、WD06、WD07、WD10和WD11有較強的鐵載體分泌能力。

圖1 CAS平板篩選產鐵載體細菌Fig.1 Isolating of siderophores-producing bacteria by CAS plates.

2.1.2產鐵載體能力定量檢測 對產鐵載體圈較大的菌株進行產鐵載體定量檢測。各菌株產鐵載體量以鐵載體活性單位(SU)表示，結果見表1。從表1中看到，菌株產鐵載體量在52.59%～65.34%之間；菌株WD01、WD06、WD11分泌鐵載體的能力為“++++”，為產鐵載體能力較強的菌株；其中，菌株WD06產鐵載體能力最強，SU達65.34%。

在本實驗過程中發(fā)現(xiàn)同種菌株在不同培養(yǎng)基產鐵載體量差別較大，如菌株WD01在LB液體培養(yǎng)基中，SU約為25.07%；在KMB液體培養(yǎng)基中，SU則高達63.55%(表1)。該實驗結果表明菌株分泌鐵載體受培養(yǎng)條件的影響。另一方面，在不同的培養(yǎng)條件下菌株均能產生一定量的鐵載體，可能預示其在復雜多變營養(yǎng)條件的自然環(huán)境中都能分泌鐵載體，保障菌株功能運行[9]。

表1 5株菌株產鐵載體量(以SU表示)Table 1 Siderophore unit of the 5 strains.

注：同列數(shù)據后不同小寫字母間差異顯著(P<0.05)。

2.2菌株特性研究

2.2.1菌株生長及鐵載體分泌規(guī)律 由于菌株WD06產鐵載體能力最強(SU達65.34%)，進一步探究菌株WD06的生長規(guī)律及鐵載體分泌規(guī)律，其結果見圖2。菌株的對數(shù)生長時期主要在6～22 h，在對數(shù)生長期前期(2～10 h)，鐵載體分泌量快速增加，10 h左右增到最高(SU=0.73，++++)。隨著菌體逐漸成熟及細菌數(shù)量的增加，對數(shù)生長后期SU值緩慢降低。結果表明菌株分泌鐵載體并不是簡單的累積效應，鐵載體的合成、分泌是與其生長狀態(tài)密切相關的；在菌體生長前期以分泌為主，生長后期為保障細菌功能運轉，以吸收為主[16]。

2.2.2菌株產吲哚乙酸能力 菌株產吲哚乙酸結果(圖3)顯示：各菌株均有一定的產IAA能力，其值在0.72～0.98 mg/L之間，其中菌株WD01產IAA能力最強(0.98 mg/L)，差異顯著。吲哚乙酸是植物中最為普遍的生長素類物質，其低水平可促進植物初生根的生長，而高濃度的可促進次生根和不定根的生長[12]。結果表明：本研究中的產鐵載體菌株具有一定的產IAA能力和促生長潛力。

2.3菌株對土壤硒活化能力

圖2 菌株WD06的生長曲線和鐵載體分泌曲線Fig.2 Growth curve and siderophore-producing curveof strain WD06.

圖3 菌株產吲哚乙酸能力Fig.3 The capacity of indole acetic acid for strains.注：不同小寫字母間差異顯著(P<0.05)。

圖4 土壤處理后水溶態(tài)硒和有效硒含量Fig.4 The concentration of water-soluble and available selenium in treated soil.注：CK:對照組；不同小寫字母間差異顯著(P<0.05)。

圖4中可以看到，土壤經各菌株制成的菌劑處理后，其水溶態(tài)硒和有效硒均有不同程度的提高。對照組土壤水溶性硒含量為0.026 mg/kg，有效硒含量為0.082 mg/kg；各菌株處理組的土壤水溶性硒含量提高至0.091～0.230 mg/kg，提高了2.50～7.85倍，土壤有效硒含量提高至0.120～0.469 mg/kg，提高了0.46～4.72倍；其中WD07菌株處理組均顯著提高了土壤水溶態(tài)硒和有效硒含量(P<0.05)。土壤中元素的化學有效性是其生物有效性的前提，是決定著食物鏈硒水平的關鍵因素[2,19]。因此，WD07菌株的高化學有效性預示著它在提高土壤硒生物有效性及促進植物吸收硒方面所具有的巨大潛力。

2.4菌株的分子鑒定

綜合菌株產鐵載體能力及活化土壤硒能力，挑選3株綜合效果較好的菌株(WD01、WD06、WD07)進行鑒定。3株菌株的16S rRNA測序結果顯示其基因片段長度約為1 400 bp。運用MEGA 5.2軟件Blast分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構建，各菌株的生物學分類地位如表2所示。WD01經鑒定為產酸克雷伯菌(Klebsiellamichiganensis)；WD06為粘質沙雷菌(Serratiamarcescens)；WD07為香坊腸桿菌(Enterobacterxiangfangensis)。

3 討論

表2 菌株的生物學分類地位Table 2 Taxonomic assignment of strains.

利用土壤中相關微生物對硒元素的活化作用是作物硒生物強化的新型策略。本試驗中篩選高產鐵載體根際菌，利用鐵載體對土壤中硒元素的活化作用提高元素硒的有效性，以期提高作物中硒含量；同時利用菌株分泌吲哚乙酸的能力，以期促進作物的生長。

本研究表明，菌株分泌鐵載體受培養(yǎng)條件、培養(yǎng)時間等因素影響。陳偉等[14]探究了培養(yǎng)條件對菌株鐵載體分泌的影響，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基碳源、氮源、pH、培養(yǎng)溫度等條件影響著鐵載體的合成。趙翔等[16]發(fā)現(xiàn)亞鐵離子可嚴格抑制熒光膿菌素的合成，但也可誘導兒茶酚胺類鐵載體的分泌?？梢钥闯?，菌株分泌鐵載體受多因素影響，菌株產鐵載體調控機制還需進一步的研究。本研究中，若能優(yōu)化菌株培養(yǎng)條件，其產鐵載體能力可能將會更高。

各菌株產鐵載體能力相當(產鐵載體量均高于50%，菌株WD06最高，達73%)，但對土壤硒的活化效果則差異較大。這表明菌株對土壤硒的活化能力除與產鐵載體能力有關外，還受其他因素影響。影響因素可能包括：菌株種類、菌體產鐵載體種類及濃度、菌液pH、菌體其他分泌物(有機酸等)以及土壤的礦物組成、有機組成、pH等。鐵載體類型可分為兒茶酚型、異羥肟酸型、羥基羧酸型，其中兒茶酚型螯合能力最強、羥基羧酸最弱[8]。另有研究發(fā)現(xiàn)，一些菌株能分泌有機酸降低土壤pH以活化金屬元素；或分泌胞外磷酸酶溶解土壤中難溶性無機磷酸鹽，磷元素釋放的同時與之伴生的(類)金屬元素元素亦被活化[21]。硒活化機理的相關研究還需進一步加強。

大量研究報道了Klebsiellasp.、Serratiasp.及Enterobactersp.作為根際促生菌耐受鎘等重金屬，并強化受重金屬污染土壤的植物修復[21]。也有相關文獻報道Klebsiellasp.、Enterobactersp.對土壤硒的活化及促進其向作物轉移的作用[6,7,22]；而Serratiasp.為首次報道土壤硒活化功能及應用。同時，關于Klebsiellasp.、Serratiasp.及Enterobactersp.在固氮、溶磷、IAA分泌等方面的大量報道[12,20,21]預示著WD01、WD06、WD07在促進植物生長方面的巨大潛力。

本試驗展示了產鐵載體根際菌具有較好的提高土壤硒有效性的潛力。諸旭東等[19]對田間土壤進行增施磷肥及外源補硒等處理，均提高了硒的化學有效性，最高增幅為52.5%。楊旎等[2]在田間試驗中，施加生物有機肥后，土壤中可溶態(tài)硒含量由32.67 mg/kg提高到95.05 mg/kg，提高了1.91倍。本試驗中各菌劑處理土壤后其水溶性硒含量提高了2.50～7.85倍；有效硒含量提高了0.46～4.72倍，屬較高水平。但也應看到，本試驗是在人為控制的實驗室條件下進行的，沒有在田間試驗中檢測菌株對土壤中硒的化學有效性、作物生長及作物吸收硒的效果。在田間實踐應用時，必然面臨功能菌株在復雜土壤及環(huán)境條件下的定植、生長及繁殖等問題[8]。此外，SPR影響植物吸收硒的相關研究還較少，相關機理也有待深入研究。本試驗今后將加強該菌株在田間土壤的定植、鐵載體活化土壤硒的機理與關鍵因素、硒在喀斯特土壤及經濟作物中的賦存形態(tài)、有效硒在土壤-作物界面及植物內部的轉移機制等方面的深入研究，以期為硒的微生物強化技術提供參考。

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周少奇教授團隊介紹

周少奇教授團隊主要從事水污染控制、環(huán)境微生物、特色植物栽培相關研究，已發(fā)表學術論文100余篇。團隊在硒學領域開展了土壤硒地球化學循環(huán)、硒微生物強化及富硒植物(茶)開發(fā)等研究。團隊有高級職稱2人、中級職稱2人、研究生若干。團隊負責人周少奇教授是國家“萬人計劃”科技創(chuàng)新領軍人才。

Isolation,IdentificationandAssessmentonSeleniumBiofortificationofSiderophore-producingRhizobacteria

LONG Yunchuan1,2, CHEN Xuan2, ZHOU Shaoqi1,2,3*

1.GuizhouInstituteofBiology,GuizhouAcademyofSciences,Guiyang550009,China; 2.CollegeofResourceandEnvironmentalEngineering,GuizhouUniversity,Guiyang550025,China; 3.SchoolofEnvironmentandEnergy,SouthChinaUniversityofTechnology,Guangzhou510006,China

The present study focused on revealing the correlation between the siderophore production by siderophore-producing rhizobacteria (SPR) and selenium (Se) bioavailability in the soils by isolating, identifying and assessing on Se biofortification of SPR. Siderophore-producing bacteria were isolated and quantitative detected using chrome azural S (CAS) plate method from Guizhou Kaiyang maize rhizosphere soils. The capacity of indoleacetic acid (IAA) was detected using Salkowski colorimetry, and the identification was taken by 16S rRNA gene sequence analysis. Moreover, the Se activation test of strains in soils were carried out in lab plates. The results showed that the 5 strains had strong siderophore production ability, among which the siderophore activity unit of WD06 reached up to 73%. All strains had a certain capacity of IAA production. Furthermore, all strains could improve the water-soluble Se contents with 2.50 to 7.85 times and the available Se contents with 0.46 to 4.72 times. Identification on the three best performance strains revealed that WD01 asKlebsiellamichiganensis, WD06 asSerratiamarcescensand WD07 asEnterobacterxiangfangensis. The present results were helpful for soil Se biofortification via microbial strategy.

rhizobacteria; siderophore; biofortification strategy; soil selenium

2017-06-05;接受日期2017-07-10

國家重點研發(fā)計劃項目(2016YFC0400702)；科技基礎性工作專項項目(2014FY120100)；貴州科學院青年基金項目(黔科院J合字[2016]5號)資助。

龍云川，助理研究員，碩士，主要從事環(huán)境微生物研究。E-mail:sculyc@163.com。*通信作者：周少奇，教授，博士生導師，博士，主要從事環(huán)境科學與工程研究。E-mail:2975742087@qq.com

10.19586/j.2095-2341.2017.0053