小型規(guī)模豬場(chǎng)爆發(fā)藍(lán)耳病毒感染的診斷與防控分析

李 晶 ，楊 俊 ，葛 猛 ,龔愛民

（1.湖南省桃江縣畜牧水產(chǎn)局，湖南桃江 413400；2.湖南省畜牧獸醫(yī)研究所，湖南長(zhǎng)沙400131）

小型規(guī)模豬場(chǎng)爆發(fā)藍(lán)耳病毒感染的診斷與防控分析

李 晶1，楊 俊2，葛 猛1,龔愛民1

（1.湖南省桃江縣畜牧水產(chǎn)局，湖南桃江 413400；2.湖南省畜牧獸醫(yī)研究所，湖南長(zhǎng)沙400131）

某小型豬場(chǎng)的不同生長(zhǎng)階段的育肥豬陸續(xù)出現(xiàn)發(fā)病死亡，母豬出現(xiàn)流產(chǎn)的情況，根據(jù)發(fā)病豬群的臨床表現(xiàn)和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果，診斷該豬場(chǎng)的主要病因?yàn)樗{(lán)耳病毒感染，采取相應(yīng)防控措施后疫情得到了有效控制。

豬藍(lán)耳病毒感染；PCR；序列分析

豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）是由PRRS病毒 引起的豬的一種高度接觸性傳染病，患病懷孕母豬表現(xiàn)為流產(chǎn)、早產(chǎn)、產(chǎn)死胎、木乃伊胎等臨床癥狀，保育和育肥豬表現(xiàn)為以腹式呼吸為主的呼吸道癥狀[1]。我國(guó)是由郭寶清第一次在爆發(fā)的流產(chǎn)胎兒中分離到PRRSV，并證實(shí)了該病在豬場(chǎng)中的存在[2]。尤其是2006年以來，我國(guó)豬群中出現(xiàn)高致病性PRRSV毒株的感染并廣泛流行，導(dǎo)致嚴(yán)重型PRRS的爆發(fā)，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3-4]。目前,PRRS對(duì)我國(guó)生豬養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重危害。

1 病例介紹

2016年7月，湖南常德某20頭母豬的小型規(guī)模豬場(chǎng)發(fā)病，前期發(fā)病表現(xiàn)為50～75kg肥豬發(fā)病，體溫可升高至40～42℃以上，耳朵及全身皮膚通紅，食欲不振或廢決；哺乳仔豬和保育豬陸續(xù)發(fā)病，體溫達(dá)41以上，后肢癱瘓或站立不穩(wěn)，病程5～7d后死亡；少數(shù)懷孕母豬出現(xiàn)體溫升高，食欲下降，前后共有5頭母豬出現(xiàn)了流產(chǎn)現(xiàn)象，一頭母豬產(chǎn)仔后7天小豬全部死亡，母豬也出現(xiàn)死亡。發(fā)病后，筆者協(xié)助豬場(chǎng)將4頭不同日齡、具有典型臨床癥狀的病豬送檢，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。

2 實(shí)驗(yàn)室診斷

2.1 引物設(shè)計(jì)和病料樣品RNA的提取

根據(jù)GenBank中PRRSV基因序列（登錄號(hào)：EF112445.1），應(yīng)用Pri m er設(shè)計(jì)了一對(duì)引物，上游引物為：5-GCGCTCACTATGGGAGCAGTAG-3 ；下游引物為：5-TAATTACGGCCGCATGGTTC-3；擴(kuò)增片段為830bp，由上海生工合成設(shè)計(jì)的引物。

從送檢的4頭豬中分別取4份樣品，使用北京天恩澤基因科技有限公司的柱式病毒試劑盒提取樣品RNA。

2.2 PRRSV片段的擴(kuò)增

提取的基因組RNA為模板，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Therm o公司）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄體系如下：FreeRNaseH2O 10 μL，5×RT Buf f er4 μL，10m M ol dNTPs 2μL，Random pri m er 1μL；ReverTra Ace 1 μL，RNaseInhi bi t or1 μL；Tot alRNA 1 μL。

反轉(zhuǎn)錄條件為：30℃10 m i n,42℃60 m i n,99℃5 m i n。PCR擴(kuò)增體系為：M i x 25μL，基因組模板，上游和下游引物各1μL，加超純水至50μL。PCR反應(yīng)條件為：94℃ 預(yù)變性 5 m i n，然后 94℃ 30 s、60℃30 s、72℃ 30 s,40 個(gè)循環(huán)，72℃延伸 7 m i n。

2.3 PCR產(chǎn)物的序列分析

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序并進(jìn)行Bl ast分析。

3 結(jié)果

3.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

以提取的基因組為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，4個(gè)樣品中均擴(kuò)增到830bp的目的片段，結(jié)果見圖1。

圖1 RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

3.2 測(cè)序結(jié)果

將RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序和Bl ast比對(duì)分析，結(jié)果顯示：所擴(kuò)增的基因片段為豬藍(lán)耳病毒基因，與PRRSV基因序列（登錄號(hào)：EF112445.1）同源性達(dá)到100%。

4 討論

高致病性豬繁殖與呼吸障礙綜合征在湖南省發(fā)生以來，根據(jù)何世成等對(duì)湖南省的20個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)血清學(xué)監(jiān)測(cè)表明，免疫血清陽性率和非免疫血清陽性率僅有9.3﹪相差，說明規(guī)模豬場(chǎng)的野毒感染率比較高[5]。王建等對(duì)上海地區(qū)發(fā)病豬進(jìn)行PRRSV檢測(cè)，2002～2009年H P-PRRSV陽性率逐年上升，成為PRRS中的優(yōu)勢(shì)病毒株，上海地區(qū)豬場(chǎng)自2009年開始使用H P-PRRS弱毒疫苗后，H P-PRRSV在臨床病例中的檢出率由53.69﹪下降到22.3﹪，說明H P-PRRS弱毒疫苗的控制效果較好[6]。在筆者進(jìn)行獸醫(yī)工作的地區(qū)也使用H P-PRRS弱毒疫苗多年，在進(jìn)行動(dòng)物流行病學(xué)調(diào)查時(shí)未見H P-PRRS的爆發(fā)與流行，說明高致病性豬繁殖與呼吸障礙綜合征的流行得到了有效地控制，但缺乏系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持。

由于H P-PRRSV疫情整體平穩(wěn)，部分養(yǎng)殖戶主觀上對(duì)H P-PRRSV疫苗免疫不重視，在個(gè)別豬場(chǎng)及周圍有爆發(fā)高熱病的可能。本文中豬場(chǎng)根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，采取對(duì)未發(fā)病豬群緊急免疫H P-PRRSV弱毒疫苗，發(fā)病豬使用泰萬菌素為主的綜合防控措施后，疫情得到有效控制。2017年開始，豬瘟和豬繁殖與呼吸綜合征將會(huì)退出國(guó)家動(dòng)物強(qiáng)制免疫范圍，我們獸醫(yī)工作者和規(guī)模養(yǎng)殖戶要加強(qiáng)對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征的綜合防控，同時(shí)加強(qiáng)流行病學(xué)與病原學(xué)監(jiān)測(cè)，逐步實(shí)現(xiàn)PRRSV的無疫區(qū)建設(shè)。

[1]劉準(zhǔn)，王風(fēng)雪，武華，等.豬繁殖與呼吸綜合征病毒非結(jié)構(gòu)蛋白研究進(jìn)展[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2010，31（12）：120-124.

[2]郭寶清，陳章水，劉文興，等.從疑似PRRS流產(chǎn)胎兒分離PRRSV的研究[J].中國(guó)畜禽傳染病,1996,（2）：1-4.

[3]Tian Ke-gong,Yu Xiu-ling, Zhao Tie-zhu,etal.Emergence of fatal PRRSV variants:unparalleled outbreaks of atypical PRRS in China and molecular dissection of the unique hallmark[J].PLoS One,2007,2(6)526:1-10.

[4]Li Yu-feng,Wang Xing-long,Bo Kun-tao,et al.Emergence of a highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus in the Mid-Eastern region of China [J].Vet J,2007,174(3):577-584.

[5]何世成，范仲鑫，劉道新，等.規(guī)?；i場(chǎng)豬瘟豬繁殖與呼吸綜合征血清學(xué)調(diào)查與分析[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志，2009，45（4）:48-49.

[6]王建，張維誼，鞠厚斌，等.2004年-2012年上海地區(qū)豬繁殖與呼吸綜合征流行情況調(diào)查 [J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2015，37（3）：190-193.

S858.28

C

1006-4907（2017）05-0026-02

10.3969/j.issn.1006-4907.2017.05.012

2017-10-03