煤矸石充填不同復(fù)墾年限土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及其酶活性

侯湖平,王 琛,李金融,丁忠義,張紹良,黃 磊,董 健,馬 靜,楊永均

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煤矸石充填不同復(fù)墾年限土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及其酶活性

侯湖平,王 琛,李金融,丁忠義,張紹良*,黃 磊,董 健,馬 靜,楊永均

(中國(guó)礦業(yè)大學(xué)環(huán)境與測(cè)繪學(xué)院,江蘇徐州 221116)

基于徐州市3塊煤矸石充填復(fù)墾地(復(fù)墾時(shí)間分別為2015、2010和2001年)的土壤樣本,采用Illumina PE250測(cè)序方法測(cè)定微生物群落組分,以未受采煤塌陷影響區(qū)的土壤樣本為對(duì)照地,對(duì)比分析充填復(fù)墾區(qū)細(xì)菌群落的垂直結(jié)構(gòu)及其時(shí)間變化.結(jié)果表明:(1)與對(duì)照地相比,復(fù)墾土壤在各個(gè)分類水平的細(xì)菌種類數(shù)量減少,群落多樣性降低.隨著復(fù)墾年限的增加,復(fù)墾地與對(duì)照地的貼近度越高.(2)厚壁菌門、變形菌門是復(fù)墾土壤中門水平的優(yōu)勢(shì)菌,厚壁菌門在復(fù)墾土壤中優(yōu)勢(shì)地位上升,有從20~40cm土層向0~20cm土層轉(zhuǎn)移的趨勢(shì).(3)芽孢桿菌綱在綱水平占絕對(duì)優(yōu)勢(shì),在復(fù)墾土壤0~20cm土層中的數(shù)量多于對(duì)照土壤,在復(fù)墾土壤20~40cm土層的數(shù)量隨年限增加而減少.(4)乳桿菌目、芽孢桿菌目在目水平是優(yōu)勢(shì)菌,除硫單胞菌目對(duì)重金屬污染修復(fù)有重要作用,然而在復(fù)墾土壤的0~20cm土層中的數(shù)量比正常農(nóng)田土壤少74.81%~99.59%.(5)芽孢桿菌科、腸球菌科、鏈球菌科是科水平的優(yōu)勢(shì)菌,芽孢桿菌屬、腸球菌屬、乳球菌屬是屬水平的優(yōu)勢(shì)菌,芽孢桿菌屬-JH7、屎腸球菌、乳球菌屬-piscium是種水平的優(yōu)勢(shì)菌,3大類在復(fù)墾土壤中的數(shù)量比例大于正常農(nóng)田,且在0~20cm土層中的差別更明顯,在復(fù)墾土壤的20~40cm土層的數(shù)量隨年限增加而減少.(6)脫氫酶活性與厚壁菌門下的多種細(xì)菌的數(shù)量呈顯著負(fù)相關(guān),與放線菌門的數(shù)量呈顯著正相關(guān),與γ-變形菌綱的數(shù)量呈極顯著正相關(guān).隨著復(fù)墾年限的增加,土壤優(yōu)勢(shì)菌群的類型沒(méi)有變化,但是數(shù)量結(jié)構(gòu)在變化.厚壁菌門在缺水和極端環(huán)境下適合生長(zhǎng),變形菌門有助于土壤氮素以及能量的循環(huán).采用微生物修復(fù)技術(shù),調(diào)整土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu),可以改善土壤質(zhì)量,縮短土壤恢復(fù)年限.

煤矸石充填復(fù)墾；微生物群落；細(xì)菌群落；復(fù)墾年限；徐州礦區(qū)

煤炭資源開發(fā)在促進(jìn)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的同時(shí),對(duì)生態(tài)環(huán)境也產(chǎn)生巨大的負(fù)效應(yīng),煤矸石堆積與土地沉陷是其中的問(wèn)題之一.煤矸石充填復(fù)墾是處理煤矸石問(wèn)題之一,它是以煤矸石為充填物并在上面填充土壤,使其土地達(dá)到可供利用狀態(tài)的復(fù)墾模式.該模式一方面解決煤矸石壓占土地的問(wèn)題,另一方面,降低煤矸石對(duì)大氣、土壤和水等造成的一定程度污染,在我國(guó)被廣泛應(yīng)用[1].但是,復(fù)墾后的農(nóng)田與未受采煤塌陷的正常農(nóng)田相比,土壤理化性質(zhì)和土壤微生物群落的結(jié)構(gòu)特征發(fā)生變化[2-4],進(jìn)而影響著復(fù)墾后耕地的質(zhì)量.土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)特征和變化規(guī)律能夠反映礦區(qū)復(fù)墾土壤微生物群落多樣性和生態(tài)功能,反應(yīng)土壤復(fù)墾水平和質(zhì)量[5-8].

國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)礦區(qū)復(fù)墾土壤中的微生物進(jìn)行研究,主要有以下幾個(gè)方面:一是針對(duì)復(fù)墾土壤微生物的生物量及其數(shù)量進(jìn)行研究,分析復(fù)墾前后不同復(fù)墾年限、不同植被模式下土壤細(xì)菌、真菌、放線菌的生物量及其數(shù)量變化[10-13].二是對(duì)復(fù)墾土壤中細(xì)菌群落多樣性的研究,包括不同復(fù)墾年限煤矸石填埋場(chǎng)的土壤微生物特性[3],對(duì)不同復(fù)墾植被類型和復(fù)墾年限對(duì)土壤細(xì)菌群落多樣性的影響[14],土壤pH值變化對(duì)復(fù)墾土壤細(xì)菌群落多樣性以及細(xì)菌門結(jié)構(gòu)特征的影響[15].三是對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)中優(yōu)勢(shì)菌群的研究,諸如中國(guó)東部礦區(qū)不同復(fù)墾植被類型和不同復(fù)墾時(shí)間土壤細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌及其多樣性[16],我國(guó)準(zhǔn)格爾地區(qū)煤礦不同復(fù)墾時(shí)間土壤細(xì)菌組成及其多樣性的變化[17].四是對(duì)復(fù)墾土壤中微生物量和土壤養(yǎng)分的相關(guān)性研究,諸如昆陽(yáng)磷礦不同年限和不同植被的礦山恢復(fù)土壤的理化性狀和微生物的相關(guān)性[18],研究采石場(chǎng)不同開采模式和土壤恢復(fù)模式對(duì)土壤微生物群落的活性、生物量和遺傳結(jié)構(gòu)的影響[5].這些研究多針對(duì)復(fù)墾土壤中的微生物活動(dòng)情況,但是對(duì)于煤矸石充填復(fù)墾土壤中細(xì)菌群落的研究不夠深入.本研究以徐州不同復(fù)墾年限的煤矸石復(fù)墾地為研究對(duì)象,研究復(fù)墾區(qū)土壤0~20cm和20~40cm深度的土壤樣本,采用Illumina PE250測(cè)序方法,測(cè)定土樣中細(xì)菌門、綱、目、科、屬、種6個(gè)水平的序列數(shù),研究煤矸石充填復(fù)墾土壤細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)、多樣性及其酶活性,目的在于分析煤矸石充填復(fù)墾地不同復(fù)墾年限土壤細(xì)菌群落的變化特征,為采用微生物修復(fù)措施提高復(fù)墾地質(zhì)量提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

研究區(qū)位于江蘇省徐州市西北部的煤礦開采區(qū),屬于華東高潛水位平原區(qū),屬暖溫帶半濕潤(rùn)季風(fēng)氣候區(qū),四季分明.年氣溫13.8℃,年日照時(shí)數(shù)為2284~2495h,日照率為52%~57%,年均無(wú)霜期200~220d,年均降水量800~930mm,年均濕度72%.氣候資源豐富,適宜農(nóng)作物生長(zhǎng),為我國(guó)華東地區(qū)重要糧食產(chǎn)區(qū).該區(qū)域正常水旱輪作地的地下水位在(0.80±0.20)m,正常旱地地下水位在1.0m以下.受采煤影響,研究區(qū)復(fù)墾前最大沉陷量1~1.5m,最小沉陷量0.6m,平均沉陷量1.1m,大部分塌陷地出現(xiàn)積水,農(nóng)田絕產(chǎn).

煤矸石充填前,首先將積水清理,然后表土層剝離,采用統(tǒng)一矸石分層振壓回填復(fù)墾,充填煤矸石4.6m,壓實(shí)度為85%,覆土厚度為50cm.經(jīng)檢測(cè),煤矸石有毒元素的平均含量分別為:Hg為0.104mg/kg(標(biāo)準(zhǔn)值為0.15mg/kg),Cd為0.086mg/ kg(標(biāo)準(zhǔn)值為0.2mg/kg),Pb為29.73mg/kg(標(biāo)準(zhǔn)值為35mg/kg),As為9.25mg/kg(標(biāo)準(zhǔn)值為15mg/kg),該含量均符合我國(guó)土壤的可接受水平[19].

在研究區(qū)內(nèi)選取3塊不同復(fù)墾年限的煤矸石充填復(fù)墾地,并在每塊復(fù)墾地附近1km以內(nèi)選取未受采煤塌陷影響的正常農(nóng)田作為對(duì)照地,對(duì)照地與復(fù)墾地具有相同的種植作物種類和施肥管理方式.第1塊復(fù)墾地S(116°48′44″E, 34°48′47″N),復(fù)墾年限為1年,對(duì)照地SC (116°48′36″E,34°48'25″N);第2塊復(fù)墾地M (117°23′48″E,34°21'25″N),復(fù)墾年限為6年,對(duì)照地MC(117°23′36″E,34°21′05″N);第3塊復(fù)墾地L(117°08′22″E,34°25' 24″N),復(fù)墾年限為15年,對(duì)照地LC(117°08′33″E,34°25'25″N).復(fù)墾地和對(duì)照地的地面作物以種植玉米和大豆為主,一年兩熟制,作物長(zhǎng)勢(shì)良好.土壤以黃河沖積物為其母質(zhì)發(fā)育而成,土壤類型為普通褐土,土壤pH6~7呈弱酸性,土壤電導(dǎo)率為652.1~664.3μS/cm,屬于正常的鹽分濃度范圍.

1.2 土壤樣本采集

采樣時(shí)間為2016年6月.每塊樣地以S型采樣,利用無(wú)菌取土器取0~20cm和20~40cm深度的土壤樣品各約1kg,共采樣12個(gè)點(diǎn),每個(gè)點(diǎn)取樣取5次重復(fù),然后混合作為樣本.將一部分新鮮土樣研磨過(guò)2mm篩后,置于-20℃冰箱中保存待用,3d內(nèi)進(jìn)行土壤微生物指標(biāo)分析;另一部分土樣進(jìn)行自然風(fēng)干,研磨處理,過(guò)0.149mm篩后,用于土壤理化性質(zhì)和酶活性指標(biāo)分析.

1.3 土壤細(xì)菌的16S rRNA 基因測(cè)序

1.3.1 DNA提取和PCR擴(kuò)增 利用E.Z.N. A.Soil DNA試劑盒(Omega Bio-tek, Norcross, GA, U.S.)提取12個(gè)土壤樣本DNA.針對(duì)細(xì)菌的16S rRNA的V4-V5區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增.使用的兼并引物為:515F 5’-barcode-GTGCCAGCMGC- CGCGG)-3’和907R 5’-CCGTCAATTCMTTT- RAGTTT-3’.PCR,擴(kuò)增程序如下:95℃預(yù)變性2min,隨后95℃變性30s,55℃退火30s,72℃延伸30s,共25個(gè)循環(huán);最后72℃最終延伸5min結(jié)束. PCR反應(yīng)在一式3份的20μL含有4μL 5×FastPfu緩沖液,2μL 2.5m dNTP,0.8μL每種引物(5μmol/ L),0.4μL FastPfu聚合酶和10ng模板DNA的混合物中進(jìn)行.從2%瓊脂糖凝膠中提取擴(kuò)增子,并利用AxyPrep DNA凝膠提取試劑盒(Axygen Biosciences,Union City,CA,U.S.)進(jìn)行純化,并使用QuantiFluor TM-ST(Promega,U.S.)進(jìn)行定量.實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,每個(gè)樣本進(jìn)行3個(gè)重復(fù).

1.3.2 文庫(kù)的構(gòu)建及測(cè)序 純化的PCR產(chǎn)物通過(guò)Qubit?3.0(Life Invitrogen)定量,并且序列不同的每12個(gè)擴(kuò)增子混合均勻.在Illumina的基因組DNA文庫(kù)制備程序之后,將匯集的DNA產(chǎn)物用于構(gòu)建Illumina Pair-End文庫(kù).然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案在Illumina MiSeq平臺(tái)(上海BIOZERON有限公司)上對(duì)擴(kuò)增子文庫(kù)進(jìn)行配對(duì)終點(diǎn)測(cè)序(2×250).原始讀取存儲(chǔ)在NCBI序列讀取存檔(SRA)數(shù)據(jù)庫(kù)中.

1.4 數(shù)據(jù)處理

1.4.1 原始數(shù)據(jù)處理與樣本序列數(shù)目統(tǒng)計(jì) 使用QIIME(1.17版本)對(duì)原始fastq文件進(jìn)行質(zhì)量過(guò)濾:在任何平均質(zhì)量評(píng)分小于20的位點(diǎn),在10bp滑動(dòng)窗口上截?cái)?50bp讀數(shù),丟棄短于50bp的截?cái)嘧x數(shù).精確條碼匹配,引物匹配中的2個(gè)核苷酸不匹配,去除包含模糊字符的讀數(shù).根據(jù)重疊序列僅組裝長(zhǎng)度大于10bp的序列,無(wú)法組裝的讀數(shù)被丟棄.使用UPARSE(版本7.1)將操作單位(OTU)聚類為具有97%的相似性截?cái)?并使用UCHIME鑒定和去除嵌合序列.通過(guò)使用70%的置信閾值的RDP分類器[20],對(duì)silva(SSU123)16S rRNA數(shù)據(jù)庫(kù)分析每個(gè)16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)生親緣關(guān)系.

1.4.2 生物信息學(xué)分析 基于Mothur v.1.21.的分析[21],計(jì)算Shannon和Chao多樣性指數(shù)[22].使用UniFrac進(jìn)行β多樣性分析[23],比較使用群落生態(tài)包R-forge的主成分分析(PCA)的結(jié)果,使用SPSS(ver.22.0)軟件通過(guò)平均連結(jié)的聚類技術(shù)對(duì)從RDP分類器獲得的門進(jìn)行聚類,利用基于Spearman的方法計(jì)算相關(guān)性系數(shù),用OriginPro (ver.9.0)進(jìn)行繪圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)墾地與對(duì)照地土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的對(duì)比分析

2.1.1 細(xì)菌群落多樣性分析 由表1可知,復(fù)墾土壤中細(xì)菌群落在各個(gè)分類水平的細(xì)菌種類數(shù)量都少于對(duì)照地,但是在不同復(fù)墾年限中,細(xì)菌種類數(shù)量的變化規(guī)律性不強(qiáng).細(xì)菌群落多樣性和物種豐富度降低,Shannon、Chao指數(shù)(圖1)在0~20cm土層中復(fù)墾地比對(duì)照地降低33.39%~ 66.94%和34.75%~85.32%,在20~40cm土層中復(fù)墾地比對(duì)照地降低13.41%~65.62%和12.43%~ 84.80%.可見,經(jīng)過(guò)煤炭資源開采、土地塌陷、煤矸石充填復(fù)墾工程等嚴(yán)重?cái)_動(dòng)后,土壤細(xì)菌群落在1年內(nèi)立即產(chǎn)生響應(yīng),煤矸石充填復(fù)墾后的土壤細(xì)菌群落的數(shù)量減少,直到復(fù)墾15年后細(xì)菌群落多樣性仍未完全恢復(fù),并且在0~20cm深度比在20~40cm深度的變化更劇烈.隨著復(fù)墾年限增加,20~40cm土層的群落多樣性指數(shù)增加,因?yàn)殡S著時(shí)間的推移,微生物生存環(huán)境不斷改善,細(xì)菌群落多樣性呈現(xiàn)變好的趨勢(shì).

表1 樣本中的細(xì)菌種類數(shù)

圖1 97%相似度水平下不同土層的細(xì)菌群落Chao、Shannon指數(shù)

采用行聚類分析法對(duì)12個(gè)樣本的土壤細(xì)菌群落在門水平的序列數(shù)進(jìn)行聚類,結(jié)果如圖2所示.當(dāng)聚類分為2類時(shí),分別為復(fù)墾地樣本S、M、L聚為一類,SC、MC、LC樣本聚為一類,說(shuō)明了復(fù)墾土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和對(duì)照土壤細(xì)菌結(jié)構(gòu)之間的差異明顯.

2.1.2 土壤優(yōu)勢(shì)菌分析 在復(fù)墾土壤中,各樣本中占主要數(shù)量比例的細(xì)菌序列數(shù)統(tǒng)計(jì)見表2.從物種組成來(lái)看,復(fù)墾地與對(duì)照地比較,復(fù)墾細(xì)菌群落構(gòu)成相對(duì)簡(jiǎn)單,呈現(xiàn)物種數(shù)量少,豐富度低.本結(jié)論和Poncelet等[2]、馬守臣等[3]、李媛媛等[24]、錢奎梅等[25]的結(jié)果類似.可見,礦區(qū)經(jīng)過(guò)煤矸石充填復(fù)墾工程擾動(dòng)后,土壤生態(tài)環(huán)境受到嚴(yán)重影響,土壤微生物多樣性有降低的趨勢(shì).但是,隨著復(fù)墾年限的增加,植物生長(zhǎng)導(dǎo)致土壤有機(jī)質(zhì)含量上升,為微生物的生長(zhǎng)和繁殖提供有利條件,復(fù)墾土壤的多樣性指數(shù)、豐富度指數(shù)會(huì)有提高的趨勢(shì),這一結(jié)論與樊文華等[13]、錢奎梅等[25]對(duì)不同復(fù)墾年限對(duì)土壤微生物多樣性的影響研究一致.隨著復(fù)墾年限的增加,復(fù)墾土壤中的細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌種不變,都是以厚壁菌門和變形菌門為主,但是數(shù)量比例略有變化.

圖2 不同樣本細(xì)菌群落聚類

表2 土壤中主要細(xì)菌的序列數(shù)

在門水平,復(fù)墾土壤和對(duì)照土壤中的優(yōu)勢(shì)菌均為厚壁菌門和變形菌門,二者在復(fù)墾土壤中共占87.56%~93.96%,在對(duì)照土壤中共占64.22%~ 69.37%.在綱的水平上,芽孢桿菌綱占絕對(duì)優(yōu)勢(shì),在復(fù)墾土壤中相對(duì)豐度為64.55%~76.24%,然而在對(duì)照地土壤中為25.01%~35.25%.在目水平上,乳桿菌目、芽孢桿菌目共占64.55%~75.84%.在科水平上,復(fù)墾土壤中的芽孢桿菌科腸球菌科鏈球菌科共占58.75%~69.70%.在屬水平上,復(fù)墾土壤的芽孢桿菌屬腸球菌屬乳球菌屬共占57.65%~68.37%.在種水平上,芽孢桿菌屬-JH7、屎腸球菌乳球菌屬-piscium是優(yōu)勢(shì)菌種,在數(shù)量上共占54.79%~65.12%.

復(fù)墾土壤中幾乎所有細(xì)菌門的數(shù)量比對(duì)照地少,但是厚壁菌門在復(fù)墾土壤中的數(shù)量比例大于對(duì)照地土壤,在復(fù)墾土壤0~20cm和20~40cm土層中的數(shù)量分別比對(duì)照地土壤多155.96%~ 614.01%和4.06%~241.73%.厚壁菌門有從20~ 40cm土層向0~20cm土層轉(zhuǎn)移的趨勢(shì).芽孢桿菌綱屬于厚壁菌門,在復(fù)墾地中的數(shù)量大于對(duì)照地,在0~20cm土層中的數(shù)量比對(duì)照地多191.04%~ 764.03%,差別更明顯,其在復(fù)墾土壤的20~40cm土層的數(shù)量隨年限增加而減少.乳桿菌目、芽孢桿菌目、芽孢桿菌科、腸球菌科、鏈球菌科、類芽孢桿菌科屬于芽孢桿菌綱,在復(fù)墾地中的數(shù)量大于對(duì)照地,在0~20cm土層中的差別更明顯,復(fù)墾土壤中的數(shù)量分別比對(duì)照地多197.27%~ 826.72%、147.74%~703.36%、159.92%~751.21%、202.10%~812.17%、194.24%~846.47%、113.73%~536.51%.屬和種水平,厚壁菌門下的芽孢桿菌屬、腸球菌屬、乳球菌屬、芽孢桿菌屬-JH7、屎腸球菌、乳球菌屬-piscium均有同樣的分布特征,在復(fù)墾地的數(shù)量大于對(duì)照地,在0~ 20cm土層中的差別更明顯,復(fù)墾土壤中的數(shù)量分別比對(duì)照地多173.06%~754.78%、202.10%~ 812.17%、194.24%~846.47%、197.46%~765.10%、202.10%~812.17%、197.63%~45.74%.上述細(xì)菌目、科、屬、種在復(fù)墾土壤的20~40cm土層的數(shù)量均隨年限增加而減少.

變形菌門下的-變形菌綱、-變形菌綱、-變形菌綱在復(fù)墾土壤中數(shù)量均小于對(duì)照地,分別少13.02%~34.04%、3.42%~98.54%、3.14%~ 97.52%.-變形菌綱下的腸桿菌目、腸桿菌科在復(fù)墾地中的數(shù)量大于對(duì)照地,在0~20cm土層中的差別更明顯,復(fù)墾土壤中的數(shù)量分別比對(duì)照地多162.79%~756.89%和162.79%~181.96%.-變形菌綱下的除硫單胞菌目在復(fù)墾地中的數(shù)量比對(duì)照地少34.39%~98.84%,在研究區(qū)復(fù)墾土壤中的含量低于正常水平.

放線菌門作為高G+C革蘭氏陽(yáng)性菌,能促使土壤中的動(dòng)物和植物遺骸腐爛.而在研究區(qū)的復(fù)墾地土壤中,20~40cm土層的數(shù)量比對(duì)照地少19.18%~97.04%.

2.2 不同復(fù)墾年限土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的對(duì)比

通過(guò)分析不同樣本OTU(97%相似性)組成,對(duì)3組樣地的土壤細(xì)菌群落數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析(PCA),不同環(huán)境間的樣本表現(xiàn)出分散或聚集的分布情況(圖3).PC1軸的可信度為97.12%, PC2軸的可信度為1.01%,累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)98.13%.在PC1軸上,復(fù)墾地土壤樣本與對(duì)照地土壤樣本從PC1的0值位置顯著分離,表明煤矸石充填復(fù)墾后土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生較大變化,此結(jié)果與不同樣品間的聚類分析結(jié)果一致.同時(shí),不同復(fù)墾年限對(duì)土壤微生物的影響差異在PC1軸和PC2軸上均有較好的體現(xiàn),復(fù)墾地樣本L和LC距離最遠(yuǎn),M和MC樣本次之,S和SC樣本距離最近,表明隨著時(shí)間的推移,復(fù)墾土壤的微生物群落結(jié)構(gòu)組成會(huì)逐漸發(fā)生變化,與對(duì)照地土壤中的微生物群落結(jié)構(gòu)將偏離正常土壤的水平.

圖3 土壤樣本主成分分析

2.3 細(xì)菌群落優(yōu)勢(shì)菌和脫氫酶的相關(guān)性分析

土壤酶在土壤生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)和能量轉(zhuǎn)化過(guò)程中有重要作用[26].土壤酶活性能表征土壤的綜合肥力特征及土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化進(jìn)程[27-29].已有研究表明,土壤酶和土壤微生物之間存在相互促進(jìn)和制約的復(fù)雜關(guān)系[30].由于作物和微生物的分泌物及對(duì)其殘?bào)w的分解物是土壤酶的主要來(lái)源,增加土壤中微生物的含量,有利于提高土壤的酶活性,土壤酶與土壤細(xì)菌的相互作用能夠推動(dòng)土壤有機(jī)質(zhì)的礦化分解和養(yǎng)分循環(huán)轉(zhuǎn)化.因此,土壤酶活性能夠敏感地反映土壤微生物的活性狀況,在復(fù)墾土壤中起到重要的生態(tài)指示作用.本研究中測(cè)得土壤中脫氫酶活性(圖4),在復(fù)墾土壤和對(duì)照土壤中,脫氫酶活性均表現(xiàn)出0~20cm土層的含量大于20~40cm土層,在復(fù)墾土壤中多出1.62%~9.43%,在對(duì)照土壤中多出4.35%~17.49%,土壤脫氫酶含量在不同土層的分布上總體呈現(xiàn)出隨土壤深度的增加而遞減的規(guī)律.用復(fù)墾樣本數(shù)據(jù)除以對(duì)照樣本,得到的百分?jǐn)?shù)可以表示復(fù)墾地土壤相比對(duì)照土壤的貼近度.經(jīng)過(guò)計(jì)算,0~ 20cm土層的S、M、L樣本的貼近度分別為83.76%、86.05%、89.57%,呈現(xiàn)L>M>S的規(guī)律.此數(shù)據(jù)表明,采煤塌陷與復(fù)墾工程改變了土壤脫氫酶活性及其分布,隨著復(fù)墾年限增加,土壤脫氫酶活性正逐步恢復(fù)到正常土壤.20~40cm土層的S、M、L樣本的貼近度分別為89.93%、88.31%、91.98%,說(shuō)明復(fù)墾年限的變化對(duì)20~40cm的土層酶活性沒(méi)有明顯的影響.

圖4 土壤樣品中脫氫酶含量

土壤脫氫酶的活性能表征土壤微生物的氧化能力,可以作為微生物氧化還原系統(tǒng)的指標(biāo)[31].細(xì)菌群落優(yōu)勢(shì)菌和脫氫酶的相關(guān)性見表3,土壤中脫氫酶活性與厚壁菌門、芽孢桿菌綱、乳桿菌目、芽孢桿菌目,芽孢桿菌科、鏈球菌科、腸球菌科、芽孢桿菌屬、腸球菌屬、乳球菌屬、芽孢桿菌屬-JH7、屎腸球菌和乳球菌屬-piscium成顯著負(fù)相關(guān),與放線菌門成顯著正相關(guān),和γ-變形菌綱成極顯著正相關(guān),說(shuō)明土壤中脫氫酶活性與土壤中細(xì)菌數(shù)量有密切的關(guān)系,脫氫酶活性可作為判斷細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)是否發(fā)生變化的指標(biāo)之一.其原因在于部分土壤微生物體內(nèi)的脫氫酶通過(guò)催化生物氧化還原反應(yīng),而后經(jīng)過(guò)氧化磷酸化作用生成腺苷三磷酸(ATP),以作為異養(yǎng)生物能量的主要來(lái)源,該類土壤細(xì)菌得以生存.

注:*、**分別代表差異達(dá)到極顯著(<0.01)、顯著(<0.05)水平.

3 討論

根據(jù)Shannon指數(shù)和Chao指數(shù),將復(fù)墾樣本數(shù)據(jù)除以對(duì)照樣本計(jì)算貼近度,表征復(fù)墾地土壤相比正常農(nóng)田土壤的生物多樣性的貼近程度.在0~20cm土層,S、M、L樣本的Shannon指數(shù)貼近度分別為66.61%、65.04%、33.06%,Chao指數(shù)的貼近度分別為54.88%、65.25%、14.69%,說(shuō)明在0~20cm深度的土層,隨著復(fù)墾年限增加,煤矸石充填復(fù)墾土壤的細(xì)菌群落多樣性和物種豐富度會(huì)偏離正常農(nóng)田的水平.在20~40cm土層,S、M、L樣本的Shannon指數(shù)貼近度分別為60.74%、34.38%、86.59%,Chao指數(shù)的貼近度分別為44.87%、15.20%、87.57%,數(shù)值雖有波動(dòng),但是值得注意的是,復(fù)墾15年的20~40cm深度的樣本中,細(xì)菌群落多樣性和物種豐富度已經(jīng)與正常農(nóng)田的水平十分接近.

從不同分類水平上對(duì)土壤微生物優(yōu)勢(shì)菌進(jìn)行分析,厚壁菌門、變形菌門、芽孢桿菌綱、乳桿菌目、芽孢桿菌目、芽孢桿菌科、腸球菌科、鏈球菌科、芽孢桿菌屬、腸球菌屬、乳球菌屬、芽孢桿菌屬-JH7、屎腸球菌、乳球菌屬-piscium是研究區(qū)煤矸石充填復(fù)墾土壤中的優(yōu)勢(shì)菌(表2).這與陳來(lái)紅等[16]對(duì)露天煤礦區(qū)復(fù)墾多樣性的研究結(jié)果類似.而李媛媛等[24].對(duì)采煤塌陷區(qū)泥漿泵復(fù)墾的研究發(fā)現(xiàn),土壤細(xì)菌主要由變形菌、放線菌、浮霉菌、酸桿菌、綠彎菌、擬桿菌、芽單胞菌、厚壁菌和硝化螺旋菌組成,且復(fù)墾的效果優(yōu)于本研究區(qū),這可能由于復(fù)墾方式和農(nóng)田耕作方式的不同引起的差異,說(shuō)明復(fù)墾方式對(duì)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響顯著,也說(shuō)明土壤微生物對(duì)生態(tài)環(huán)境變化十分敏感.計(jì)算優(yōu)勢(shì)菌的貼近度,結(jié)果見表4:厚壁菌門以及厚壁菌門下屬的芽孢桿菌綱、乳桿菌目、芽孢桿菌目、芽孢桿菌科、鏈球菌科、腸球菌科、芽孢桿菌屬、腸球菌屬、乳球菌屬、芽孢桿菌屬-JH7、屎腸球菌、乳球菌屬- piscium等的貼近度基本呈現(xiàn)樣本SM>L的規(guī)律,說(shuō)明在煤矸石充填復(fù)墾土壤的演替過(guò)程中,變形菌門在減少.而在20~40cm土層中,優(yōu)勢(shì)菌的相對(duì)豐富度隨著復(fù)墾年限的增加有波動(dòng)規(guī)律,因此0~20cm土層中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)比20~40cm土層中的細(xì)菌群落更容易受人為擾動(dòng)或時(shí)間推演而發(fā)生變化.

不同復(fù)墾年限土壤細(xì)菌的演替是有差異的,在不同復(fù)墾年限,土壤生態(tài)系統(tǒng)優(yōu)勢(shì)菌群的比例在不斷發(fā)生變化.在0~20cm土層的復(fù)墾土壤中,厚壁菌門的相對(duì)豐度隨著復(fù)墾年限增加而增加,在復(fù)墾15年的樣本中厚壁菌門占絕對(duì)優(yōu)勢(shì),相對(duì)豐度高達(dá)93.83%.厚壁菌門中主要的細(xì)菌目、細(xì)菌科、細(xì)菌屬在復(fù)墾土壤中的數(shù)量比例會(huì)大于正常農(nóng)田土壤,說(shuō)明厚壁菌門有特殊的生理結(jié)構(gòu),多數(shù)菌種能通過(guò)形成孢子適應(yīng)礦區(qū)缺水和極端環(huán)境,因此對(duì)于采煤塌陷地的生態(tài)修復(fù)、土壤生態(tài)系統(tǒng)的重建有重要意義.芽孢桿菌屬具有耐高熱、低溫、輻射等抵抗極端環(huán)境的能力,并去除土壤中的重金屬污染,是一種環(huán)境友好型生物農(nóng)藥[32].類芽孢桿菌的菌株具有抗性強(qiáng)、固氮、抑菌等優(yōu)良特性,可以作為促生菌劑促進(jìn)植物生長(zhǎng)[33].芽孢桿菌屬-JH7具有耐堿耐熱性[34],屎腸球菌長(zhǎng)速快,有較好的黏附能力,能產(chǎn)生乳酸及一些抗菌物質(zhì)[35],可用作益生菌制劑.因此上述幾種菌能與經(jīng)過(guò)復(fù)墾工程后發(fā)生改變的生態(tài)系統(tǒng)相適應(yīng),能改良土壤環(huán)境,改善養(yǎng)分相對(duì)貧瘠的復(fù)墾土壤,表現(xiàn)出復(fù)墾后土壤質(zhì)量提升的目的.賀龍等[14]也有同樣的研究結(jié)果,其研究認(rèn)為,露天煤礦復(fù)墾土壤的優(yōu)勢(shì)菌群多為化能自養(yǎng)或化能異養(yǎng)型細(xì)菌或參與氮循環(huán)、或降解多環(huán)芳烴類有機(jī)物等有利于污染土壤的生態(tài)修復(fù)和土壤肥力恢復(fù)的功能細(xì)菌屬,能在營(yíng)養(yǎng)貧瘠的環(huán)境下生長(zhǎng)繁殖,這對(duì)于復(fù)墾土壤肥力恢復(fù)具有重要作用,尤其是對(duì)露天煤礦的土壤修復(fù)、生態(tài)系統(tǒng)改善具有重要的利用價(jià)值.變形菌門以及變形菌門下的-變形菌綱、-變形菌綱、-變形菌綱、除硫單胞菌目的數(shù)量變化和厚壁菌門相反,在0~20cm土層中隨著年限增加而減少,在20~ 40cm土層中隨著年限增加而增加,因此有向下層土壤轉(zhuǎn)移分布的趨勢(shì).變形菌門是革蘭氏陰性菌,是細(xì)菌中數(shù)量最多、可培養(yǎng)細(xì)菌最多、代謝多樣性最高的門.變形菌門在維持土壤生態(tài)系統(tǒng)功能中扮演著重要的角色,為整個(gè)系統(tǒng)的氮素以及能量的循環(huán)提供幫助,對(duì)農(nóng)業(yè)有重要意義的菌種,可以有效提高土壤的質(zhì)量.放線菌門菌群能促使土壤中的動(dòng)物和植物遺骸腐爛,對(duì)有機(jī)物的礦化有著重要作用.在土壤中增加放線菌,有利于土壤中有機(jī)質(zhì)的增加,提高土壤養(yǎng)分,改良土壤,促進(jìn)植被生長(zhǎng).而本研究復(fù)墾土壤中的含量低于正常水平,說(shuō)明煤矸石充填復(fù)墾土壤的修復(fù)能力低于正常農(nóng)田土壤,在今后的土地復(fù)墾中可適量培育放線菌門,以增加土壤的自身修復(fù)能力,以達(dá)到改善土壤質(zhì)量的目的.通過(guò)對(duì)比復(fù)墾地和對(duì)照地的細(xì)菌群落特征,0~20cm土層中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)比20~40cm土層中的細(xì)菌群落更容易受人為擾動(dòng)或時(shí)間推演而發(fā)生變化,同時(shí),發(fā)現(xiàn)土壤生態(tài)系統(tǒng)不穩(wěn)定的復(fù)墾地中缺少某些有益菌,通過(guò)增施生物有機(jī)肥或特定的微生物肥,調(diào)節(jié)土壤環(huán)境微生態(tài),使土壤中有機(jī)質(zhì)和有益細(xì)菌數(shù)量增加,加速土壤細(xì)菌群落演替的速度和土壤生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定,這對(duì)于指導(dǎo)土壤復(fù)墾具有重要的理論指導(dǎo)意義.

表4 土壤樣本優(yōu)勢(shì)菌序列數(shù)的貼近度(%)

土壤酶活性與微生物數(shù)量之間有密切的關(guān)系,采煤塌陷與復(fù)墾工程改變了脫氫酶活性的垂直分布特征,土壤脫氫酶含量在垂直分布上總體呈現(xiàn)出隨土層深度的增加而遞減的規(guī)律.這與相關(guān)文獻(xiàn)的研究結(jié)果相一致,李智蘭等[31]認(rèn)為這是土壤酶活性的表聚性.這可能是因?yàn)?~20cm土層中植物根系發(fā)達(dá),植物殘?bào)w以及土壤微生物數(shù)量較多,使得土壤養(yǎng)分含量高,脫氫酶作用的底物多.脫氫酶活性隨復(fù)墾年限變化呈現(xiàn)不同的分布特征,且與土壤細(xì)菌群落的主要菌種有顯著相關(guān)關(guān)系.脫氫酶活性與厚壁菌門下的多種細(xì)菌的數(shù)量呈顯著負(fù)相關(guān),與放線菌門的數(shù)量呈顯著正相關(guān),與-變形菌綱的數(shù)量呈極顯著正相關(guān).可能是因?yàn)閺?fù)墾土壤與正常農(nóng)田土壤有不同的養(yǎng)分結(jié)構(gòu),致使土壤細(xì)菌群落有不同的響應(yīng),生物體內(nèi)的酶活性隨之發(fā)生變化.酶活性越強(qiáng),生物化學(xué)反應(yīng)越強(qiáng)烈,則生化反應(yīng)產(chǎn)物越多,對(duì)于體內(nèi)含有較多脫氫酶的細(xì)菌來(lái)說(shuō),其數(shù)量越多;體內(nèi)含有較多脫氫酶的細(xì)菌的數(shù)量越多,則土壤中脫氫酶的活性越高,因此這種細(xì)菌的數(shù)量與脫氫酶活性是相互促進(jìn)發(fā)展的協(xié)同關(guān)系,能共同反映土壤細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)及變化趨勢(shì),故可作為評(píng)價(jià)復(fù)墾土壤肥力的指標(biāo),為改良復(fù)墾土壤質(zhì)量提供理論依據(jù)[36-37].諸如孟會(huì)生等[8]研究認(rèn)為,復(fù)墾土壤主要的變形菌門與Olsen-P、堿性磷酸酶有很高的相關(guān)性,將細(xì)菌群與酶活性建立聯(lián)系,細(xì)菌可作為土壤磷有效性的靈敏性指標(biāo).土壤微生物和土壤環(huán)境是相互作用相互影響,揭示土壤微生物群落和土壤理化性質(zhì)的關(guān)系,建立土壤質(zhì)量和土壤微生物的監(jiān)測(cè)指標(biāo),更有助于提高礦區(qū)土壤質(zhì)量.

4 結(jié)論

4.1 與未受采煤塌陷影響的正常農(nóng)田土壤相比,復(fù)墾土壤在各個(gè)分類水平的細(xì)菌種類數(shù)量減少,群落多樣性降低,脫氫酶活性降低.復(fù)墾土壤和對(duì)照土壤的優(yōu)勢(shì)菌群種類一致,但是優(yōu)勢(shì)菌群的序列隨著復(fù)墾年限不同發(fā)生變化.

4.2 厚壁菌門、變形菌門、芽孢桿菌綱、乳桿菌目、芽孢桿菌目、芽孢桿菌科、腸球菌科、鏈球菌科、芽孢桿菌屬、腸球菌屬、乳球菌屬、芽孢桿菌屬-JH7、屎腸球菌、乳球菌屬-piscium是研究區(qū)煤矸石充填復(fù)墾土壤中的優(yōu)勢(shì)菌.

4.3 采煤塌陷改變了脫氫酶活性的垂直分布特征,并且隨復(fù)墾年限變化呈現(xiàn)不同的分布特征.土壤中脫氫酶活性可以間接反應(yīng)某種細(xì)菌的數(shù)量特征,脫氫酶活性與厚壁菌門下的多種細(xì)菌的數(shù)量呈顯著負(fù)相關(guān),與放線菌門的數(shù)量呈顯著正相關(guān),與-變形菌綱的數(shù)量呈極顯著正相關(guān).

4.4 復(fù)墾過(guò)程中,細(xì)菌作為生態(tài)演替過(guò)程中的先鋒種群,對(duì)于復(fù)墾土壤質(zhì)量恢復(fù)具有重要作用.例如厚壁菌門、芽孢桿菌、類芽孢桿菌、Bacillus sp. JH7等是有益于改良土壤環(huán)境的功能菌,能抵抗惡劣生存環(huán)境的有益菌,因而在復(fù)墾土壤中占有較大的數(shù)量?jī)?yōu)勢(shì),可以采用增加微生物菌的數(shù)量來(lái)改善養(yǎng)分貧瘠的復(fù)墾土壤.

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致謝：感謝上海BIOZERON有限公司在土壤樣品基因測(cè)序和分析方面的幫助,感謝蔡延江副教授對(duì)本論文英文潤(rùn)色的幫助.

Variation of bacterial community structure and enzyme activities in reclaimed soil filled with coal gangues along a relamation chronosequence.

HOU Hu-ping, WANG Chen, LI Jin-rong, DING Zhong-yi, ZHANG Shao-liang*, HUANG Lei, DONG Jian, MA Jing, YANG Yong-jun

(School of Environment Science & Spatial Informatics, China University of Mining and Technology, Xuzhou 221116, China)., 2017,37(11)：4230~4240

In this study, soil samples from the reclaimed land filled with coal gangue (SS) with different reclamation years (2015, 2010, and 2001 years) in Xuzhou mining area and from normal farmlands which were not affected by coal mining subsidence (SSC) were collected. The sequence numbers of bacterial community were determined by the Illumina PE250sequencing method, and the vertical structure and time structure were analyzed. The results showed that: (1) Reclamation decreased the number of bacteria species and the community diversity, but the goodness between SS and SSC increased with the age of reclamation. (2)anddominated in SS at the phylum level, the number ofincreased after reclamation andalso likely transferred from 20~40cm to 0~20cm soil layer. (3)predominantly existed in soils at the class level, the number ofin 0~20cm soil layer was higher in SS than in SSC samples, and the number in 20~40cm soil layers of SS samples decreased with the increase of the reclamation years. (4)anddominated in SS at the order level.played an important role in the remediation of heavy metal pollution and its number in 0~20cm soil layer of SS was 74.81~99.59% less than that in SSC samples. (5) In SS samples,,andwere the dominant family, while,andwere the dominant genus, andJH7,andwere the dominant species. All of these in SS samples were less in number than SSC samples especially in 0~20cm soil layer, while the number in 20~40cm soil layer of SS decreased with the increase of the reclamation years. (6)activity was negatively correlated with the number of, but was positively correlated with the number ofand the number of.Also, the type of dominant soil bacteria did not change, but their quantitative structure varied over time. Owing toare suitable for growth in the absence of water and extreme environments, butis conducive to soil nitrogen and energy cycling. Therefore, the soil quality was improved by adjusting soil bacterial community structure and shorten the recovery period.

land reclamation filled with coal gangue；soil microbial community；bacterial community structure；reclamation term；Xuzhou coal-mining areas

X171

A

1000-6923(2017)11-4230-11

侯湖平(1975-),女,山西孝義人,副教授,博士,主要從事煤礦區(qū)土地生態(tài)修復(fù)研究.發(fā)表論文80余篇.

2017-04-14

國(guó)家自然基金資助項(xiàng)目(51474217);中國(guó)礦業(yè)大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目(201610290044)

* 責(zé)任作者, 教授, slzhang@cumt.edu.cn