建立改良法兔VX2肝癌模型及肝動脈聯(lián)合門靜脈插管的應(yīng)用

含 笑，胡茂能，吳鴻峰，余 梁，王國亮，周麗芬

(合肥市第三人民醫(yī)院影像中心，安徽 合肥 230022)

·基礎(chǔ)與實驗研究·

建立改良法兔VX2肝癌模型及肝動脈聯(lián)合門靜脈插管的應(yīng)用

含 笑，胡茂能*，吳鴻峰，余 梁，王國亮，周麗芬

(合肥市第三人民醫(yī)院影像中心，安徽 合肥 230022)

目的采用改良法建立兔VX2肝癌模型，探討經(jīng)肝動脈聯(lián)合門靜脈插管技術(shù)的應(yīng)用并分析其影響因素。方法對60只健康新西蘭大白兔行改良開腹穿刺接種法移植肝癌，并行肝動脈聯(lián)合門靜脈造影，根據(jù)術(shù)后是否發(fā)生短期死亡(術(shù)后7天內(nèi))分為存活組和死亡組，將可能導(dǎo)致實驗兔死亡的因素進(jìn)行單因素分析，以有統(tǒng)計學(xué)意義的指標(biāo)為自變量，建立二分類Logistic回歸模型，分析導(dǎo)致實驗兔死亡的獨立危險因素。結(jié)果60只實驗兔均移植腫瘤成功，9只(9/60，15.00%)實驗兔術(shù)后短期內(nèi)死亡，51只(51/60，85.00%)存活。單因素分析顯示兩組間體質(zhì)量<2.5 kg、術(shù)中追加麻醉、手術(shù)時間≥60 min、切口長度≥5 cm及總出血量≥25 ml為相關(guān)影響因素(P均<0.05)。Logistic回歸分析篩選出體質(zhì)量<2.5 kg、術(shù)中追加麻醉及出血量≥25 ml為手術(shù)死亡的獨立危險因素(P均<0.01)。結(jié)論改良法兔VX2肝癌模型建立成功率較高；選擇體重較大的實驗兔，同時加強(qiáng)手術(shù)技巧的訓(xùn)練，減少術(shù)中出血量和避免術(shù)中追加麻醉是進(jìn)行肝動脈聯(lián)合門靜脈造影時降低實驗兔死亡率的有效措施。

兔；VX2肝癌；放射學(xué)，介入性；回歸分析

經(jīng)導(dǎo)管動脈化療栓塞術(shù)(transcatheter arterial chemoembolization, TACE)已成為中晚期原發(fā)性肝癌的標(biāo)準(zhǔn)治療方式[1]，但單純TACE具有短期復(fù)發(fā)，且復(fù)發(fā)率較高的缺點，肝癌存在肝動脈和門靜脈雙重血供是其復(fù)發(fā)的主要原因。研究[2-4]發(fā)現(xiàn)采用經(jīng)肝動脈聯(lián)合門靜脈化療栓塞術(shù)治療中晚期肝癌患者的療效好于單純TACE，但目前仍缺乏大樣本研究證實。VX2兔因體型大、腫瘤生長迅速及腫瘤血液供應(yīng)與人體肝細(xì)胞癌相似等優(yōu)點被用作肝癌研究的動物模型[5]，但肝動脈聯(lián)合門靜脈插管造影的研究較少[6]。本研究采用改良法建立兔VX2肝癌模型，并行肝動脈聯(lián)合門靜脈插管造影，并分析其影響因素。

1 材料與方法

1.1 改良法兔VX2肝癌模型建立 選取60只健康新西蘭大白兔(安徽醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供，編號201615838)，雌兔25只，雄兔35只，體質(zhì)量1.75～2.80 kg，平均(2.16±0.48)kg。荷VX2瘤兔2只(安徽省立醫(yī)院介入科惠贈)，雌雄各1只，體質(zhì)量分別為1.81 kg和2.03 kg。以外科法剝離荷VX2瘤兔后肢瘤體，取瘤體邊緣生長旺盛的魚肉樣組織，置于50 ml生理鹽水+2萬單位慶大霉素溶液中，使用眼科剪將瘤塊剪成最大徑約2 mm的碎塊，以備腫瘤移植使用。以苯巴比妥鈉(100 mg/kg體質(zhì)量)經(jīng)耳緣靜脈緩慢推注麻醉動物，采用改良開腹穿刺接種法進(jìn)行腫瘤移植：于劍突下正中偏左作一長約2 cm縱行切口，打開腹腔暴露肝臟左內(nèi)葉，以4F擴(kuò)張鞘管斜行輕柔刺破肝包膜，插入肝臟內(nèi)約5 mm，經(jīng)鞘管內(nèi)芯推入3～5個瘤塊，再以2 mm×2 mm×5 mm的明膠海綿條封堵穿刺通道后拔出，縫合上腹切口。術(shù)后均常規(guī)抗感染：實驗兔后肢肌肉注射青霉素鈉80萬單位/天，連續(xù)3天。

1.2 經(jīng)肝動脈聯(lián)合門靜脈插管造影 于瘤塊接種后第15天行肝動脈聯(lián)合門靜脈造影。術(shù)前3天予以正常飲食之半量喂養(yǎng)，術(shù)前4 h禁飼禁飲；術(shù)后將動物置于烤燈下觀察蘇醒，術(shù)后6 h開始給水，12 h予以術(shù)前1/3飼料喂養(yǎng)，術(shù)后第4天恢復(fù)正常飼喂。

1.2.1 肝動脈造影 實驗兔右側(cè)腹股溝區(qū)備皮、常規(guī)消毒鋪巾，于股動脈搏動區(qū)作縱行切口，鈍性分離至完全暴露股動脈，穿4號縫合線置于近心端，提緊縫線，暫時阻斷血流，采用眼科剪將股動脈遠(yuǎn)心端剪一小斜行切口，將3F微導(dǎo)管(泰爾茂株式會社)直接插入股動脈。之后于透視下將微導(dǎo)管置于腹主動脈(約T12水平)進(jìn)行造影，再于腹主動脈前壁或偏左側(cè)壁(T12/L1椎體水平)進(jìn)入腹腔動脈后再行腹腔動脈手推造影，采用路圖技術(shù)超選擇插管進(jìn)入肝總動脈，連接高壓注射器行DSA。對比劑(碘佛醇，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司)流速為2～3 ml/s，總量6 ml。

1.2.2 門靜脈造影 肝動脈造影結(jié)束后，采用腹正中切口(切口長度<5 cm)，逐層打開腹壁，清晰暴露門靜脈。將5號靜脈輸液針折成直角，水平段斜行插入門靜脈，回抽見血后用動脈夾妥善固定，連接高壓注射器行DSA，對比劑流速為3～5 ml/s，總量8～10 ml。術(shù)畢拔針，以紗布壓迫10 s左右止血。逐層縫合切口后包扎傷口。

1.3 觀察指標(biāo) 根據(jù)實驗兔術(shù)后7天內(nèi)是否存活分為存活組和死亡組，觀察指標(biāo)包括性別、體質(zhì)量、切口長度、手術(shù)時間、腹腔暴露時間、術(shù)中出血量及術(shù)中是否追加麻醉等。比較兩組實驗兔的一般特征和術(shù)中情況，分析可能影響實驗兔術(shù)后短期死亡的相關(guān)因素。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計分析軟件。計數(shù)資料以例數(shù)或百分比表示，計量資料以±s表示。采用χ2檢驗對可能導(dǎo)致實驗兔死亡的相關(guān)指標(biāo)行單因素分析，以有統(tǒng)計學(xué)意義的指標(biāo)為自變量，以造影術(shù)后7天內(nèi)是否死亡為因變量(Y=1，0；存活為0，死亡為1)，采用最大似然比檢驗進(jìn)行多因素回歸分析，建立多因素二分類Logistic回歸模型，獲得各指標(biāo)的回歸系數(shù)β、標(biāo)準(zhǔn)誤(standard errors, SE)、比值比(odds ratio, OR)及95%可信區(qū)間(confidence interval, CI)。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腫瘤移植及造影所見 全部60只實驗兔均移植腫瘤成功，未出現(xiàn)腹腔內(nèi)廣泛轉(zhuǎn)移及積液等。所有移植瘤均位于肝左葉，其中4只(4/60，6.67%)為多發(fā)(均為2個瘤塊)，其余56只(56/60，93.33%)為單發(fā)。種植成功的VX2腫瘤呈灰白色結(jié)節(jié)狀，與正常肝組織分界清晰(圖1)。肝動脈聯(lián)合門靜脈造影顯示腫瘤血供豐富，其中55只(55/60，91.67%)腫瘤血供僅來自肝動脈(圖2)，5只(5/60，8.33%)門靜脈參與供血(圖3)。術(shù)后7天內(nèi)存活51只(51/60，85.00%)，死亡9只(9/60，15.00%)。

2.2 影響術(shù)后死亡率的單因素分析 對可能導(dǎo)致實驗兔死亡的因素，包括性別、體質(zhì)量、切口長度、手術(shù)時間、腹腔暴露時間、術(shù)中出血量及術(shù)中是否追加麻醉等進(jìn)行單因素分析，結(jié)果顯示體質(zhì)量<2.5 kg、術(shù)中追加麻醉、手術(shù)時間≥60 min、切口長度≥5 cm及總出血量≥25 ml為相關(guān)影響因素(P均<0.05，表1)。

2.3 影響術(shù)后死亡率的多因素分析 以上述單因素(體質(zhì)量<2.5 kg、術(shù)中追加麻醉、手術(shù)時間≥60 min、切口長度≥5 cm及總出血量≥25 ml)作為自變量，行非條件二分類Logistic回歸分析，篩選得出體重<2.5 kg、術(shù)中追加麻醉及出血量≥25 ml是動物術(shù)后死亡的獨立危險因素(P均<0.01，表2)。

3 討論

肝癌具有豐富的血供和新生血管形成，后者對腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移起重要作用[7]。VX2肝癌是Shop病毒在兔皮膚上誘發(fā)的一種鱗癌，經(jīng)過傳代后可作為兔移植性腫瘤，在肝臟的移植成功率較高[8]。建立VX2模型的方法較多，既往[9-10]常采用經(jīng)腹部正中切口開腹穿刺法，拉出肝左葉，將瘤塊直接植入肝臟內(nèi)，該方法易刺破肝內(nèi)血管，導(dǎo)致早期轉(zhuǎn)移；同時呼吸運動易導(dǎo)致瘤塊溢出而出現(xiàn)腹腔廣泛轉(zhuǎn)移或切口轉(zhuǎn)移。本研究對上述方法加以適當(dāng)改良，采用經(jīng)皮肝穿刺擴(kuò)張鞘管斜行輕柔刺破肝包膜，推注瘤塊后同時經(jīng)鞘管注入明膠海綿條；采用正中偏左切口可直視肝左葉，無需拉出肝臟，操作簡便，移植瘤位置易固定。本組60只實驗兔均移植成功，腹腔內(nèi)未出現(xiàn)廣泛轉(zhuǎn)移及積液等。魯東等[11]比較改良接種法與常規(guī)開腹穿刺接種法，發(fā)現(xiàn)改良法移植成功率為95%，高于常規(guī)開腹穿刺法(85%)，且肝內(nèi)多發(fā)病灶發(fā)生率及網(wǎng)膜或腹壁種植轉(zhuǎn)移率均有顯著下降(P均<0.05)。

介入治療已成為肝癌的主要姑息療法[2]，VX2實驗兔的腫瘤血供與人類相同，主要來自肝動脈，且其肝動脈內(nèi)徑較粗，可允許行插管操作[8]。目前研究[12-13]認(rèn)為肝癌80%以上的血供來源于肝動脈，供應(yīng)腫瘤中心區(qū)域，而門靜脈供應(yīng)腫瘤周邊區(qū)域。乏血供肝臟腫瘤多以門靜脈供應(yīng)為主。此外，還有15%無包膜肝癌的門靜脈血供超過肝動脈。本組9只實驗兔于術(shù)后7天內(nèi)死亡，Logistic回歸分析顯示影響實驗兔術(shù)后短期死亡的獨立危險因素為實驗兔體質(zhì)量過低(<2.5 kg)、術(shù)中追加麻醉及術(shù)中出血量過大(≥25 ml)，這可能與體質(zhì)量較小的實驗兔血容量較少、耐受性差、血管較細(xì)致手術(shù)難度增加等因素有關(guān)。本研究采用大劑量苯巴比妥鈉(100 mg/kg體質(zhì)量)經(jīng)實驗兔耳緣靜脈注射，其半數(shù)致死量為340 mg/kg體質(zhì)量，半衰期較長。本實驗中因追加麻醉導(dǎo)致實驗兔死亡，可能與以下原因有關(guān)：不熟悉實驗步驟、微導(dǎo)管插管技巧生疏致手術(shù)時間延長，術(shù)中實驗兔清醒；進(jìn)行耳緣靜脈注射苯巴比妥鈉時出現(xiàn)藥液外滲，一次性麻醉程度不足，導(dǎo)致術(shù)中需要追加麻醉，因藥物過量而導(dǎo)致死亡。此外，術(shù)中出血量超過25 ml也是導(dǎo)致實驗兔術(shù)后短期死亡的獨立因素，可能的原因為較大出血量導(dǎo)致實驗兔對手術(shù)的耐受性差，本組1只實驗兔(出血量約40 ml)在手術(shù)結(jié)束后1 h內(nèi)死亡；術(shù)后傷口愈合延遲，機(jī)體抗感染能力下降。

表1 影響VX2肝癌兔雙介入術(shù)后7天內(nèi)死亡的單因素分析(只)

表2 影響VX2肝癌兔雙介入術(shù)后7 天內(nèi)死亡的多因素Logistic回歸參數(shù)估計結(jié)果

圖1 改良法VX2肝癌兔移植術(shù)后見位于肝左葉孤立移植瘤，呈灰白色，與周邊組織分界清晰 圖2 肝動脈微導(dǎo)管造影示腫瘤為孤立病灶，位于肝左葉，血供豐富 圖3 門靜脈直接插管造影示門靜脈參與肝左葉腫瘤供血

本實驗結(jié)果提示：①操作時需熟練掌握介入操作技術(shù)及插管技巧，在減少損傷的同時縮短手術(shù)時間；②在耳緣靜脈注射麻醉藥物時，于耳下方采用自制硬卡片固定，可避免因動物躁動導(dǎo)致的藥液外滲及術(shù)中追加麻醉；③選擇正中偏左切口，盡量靠近移植瘤，可使切口較小，從而減少損傷、降低出血量；④門靜脈插管時盡量一次成功，可以減少出血量，經(jīng)直視下行門靜脈插管操作簡便，不需擴(kuò)大切口即可獲得清晰的視野。

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《醫(yī)學(xué)影像信息學(xué)》已出版

由全軍醫(yī)學(xué)影像中心、全國學(xué)科排名位居前10位的南京軍區(qū)南京總醫(yī)院醫(yī)學(xué)影像科(南京大學(xué)附屬金陵醫(yī)院)王駿主編的高等醫(yī)學(xué)院校教材《醫(yī)學(xué)影像信息學(xué)》由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社出版發(fā)行(ISBN978-7-5659-0991-7)。該書以數(shù)字圖像為基礎(chǔ)，介紹了利用各種醫(yī)學(xué)影像后處理技術(shù)提取醫(yī)學(xué)影像相關(guān)信息，闡述網(wǎng)絡(luò)技術(shù)的存儲、傳輸和查閱，并對如何利用各類搜索引擎短時、精準(zhǔn)查閱所需的醫(yī)學(xué)影像相關(guān)信息進(jìn)行了分析，是多學(xué)科專家學(xué)者共同努力的結(jié)晶。該書適合醫(yī)學(xué)影像、生物醫(yī)學(xué)工程及相關(guān)醫(yī)學(xué)類在校學(xué)生及同行使用。

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EstablishingimprovedrabbitmodelbearingVX2livertumorandapplicationofhepaticarteryandportalveincatheterization

HANXiao,HUMaoneng*,WUHongfeng,YULiang,WANGGuoliang,ZHOULifen

(ImagingCenter,theThirdPeople'sHospitalofHefei,Hefei230022,China)

ObjectiveTo establish rabbit model bearing VX2 liver tumor using improved technique, and to analyze the relevant impact factors of hepatic artery and portal vein catheterization.MethodsTransplanted liver tumors of 60 healthy New Zealand white rabbits were established through open abdominal puncture and hepatic artery and portal vein catheterization. The rabbits were divided into A group (survival) and B group (death) according to whether a short-term (within 7 days after surgery) death occurred or not. The univariate analysis of the factors which could lead to the death of rabbits were analyzed. TheLogisticregression models were established with parameters which were significantly different between the 2 groups, and independent risk factors which could lead to the failure of the experiment were analyzed.ResultsVX2 tumors were successfully implanted in the liver to all 60 rabbits. Nine (9/60, 15.00%) rabbits died within 7 days, while 51 (51/60, 85.00%) rabbits survived. weight < 2.5 kg, additional intraoperative anesthesia, operation time ≥60 min, length of incision ≥5 cm and blood loss of operation ≥25 ml were impact factors (allP<0.05). Weight < 2.5 kg, additional intraoperative anesthesia and the blood loss of operation ≥25 ml were independent risk factors for death (P<0.01).ConclusionRelative high success rate of building rabbit models bearing VX2 liver tumor may achieved using hepatic artery and portal vein catheterization. Larger weight of rabbits, training of surgical skills, less intraoperative blood loss are helpful to avoid intraoperative additional anesthesia, thus reducing mortality of rabbits.

Rabbits; VX2 liver tumor; Radiology, intervention; Regression analysis

含笑(1981—)，男，安徽全椒人，碩士，主治醫(yī)師。研究方向：惡性腫瘤及外周血管疾病的介入治療。E-mail: 29435205@qq.com

胡茂能，合肥市第三人民醫(yī)院影像中心，230022。E-mail: hmn596@163.com

2017-06-11

2017-09-11

R73; R816

A

1672-8475(2017)11-0690-04

10.13929/j.1672-8475.201706018