黃連對糖尿病腦缺血再灌注模型大鼠Bax和Bcl-2蛋白表達的影響

黃連對糖尿病腦缺血再灌注模型大鼠Bax和Bcl-2蛋白表達的影響

覃小軍馮愛平黃其軍喬偉王文

黃連; 糖尿病; 腦缺血再灌注; Bax; Bcl-2; 細胞凋亡

缺血性腦卒中是糖尿病的嚴重并發(fā)癥之一,糖尿病性腦缺血占缺血性腦卒中的20%～25%,且缺血面積大、癥狀重、預后更差[1]?，F(xiàn)已明確糖尿病加重腦缺血再灌注損傷是一個多因素、多機制、多環(huán)節(jié)的惡性級聯(lián)過程,其中細胞凋亡在糖尿病加重缺血性腦損傷的過程中起重要作用。當腦缺血發(fā)生后,若錯過溶栓或取栓時間窗,則無確切有效的治療手段,故糖尿病合并腦缺血的治療仍為亟待解決的難題。

經(jīng)大量研究表明,黃連主要有效成分為生物堿類和酮類,具有抗菌消炎、降壓降糖、抑癌防癌及抗氧化、抗凋亡、保護神經(jīng)細胞等作用[2]。當腦缺血損傷發(fā)生后,機體γ-氨基丁酸(GABA)和谷氨酸水平急劇升高,加重腦細胞損傷,而黃連中的總黃酮可以促進腦缺血模型大鼠丘腦中谷氨酸和GABA 含量恢復至正常水平,減輕細胞損傷,增強神經(jīng)元對缺血的耐受性,發(fā)揮神經(jīng)保護作用[3]。同時也有研究證實,黃連可增加胰島素生物活性和胰島素敏感性,對糖尿病大鼠醛糖還原酶活性有抑制作用,對糖尿病及其神經(jīng)病變有很好的防治作用[4]。糖尿病腦缺血發(fā)生后,主要凋亡信號轉導通路(Bax/Bcl-2)被激活,誘導神經(jīng)細胞凋亡。有研究證實，黃連可使促凋亡成員Bax表達減弱,而抗凋亡成員Bcl-2 表達相對增強,從而降低神經(jīng)細胞凋亡，保護腦缺血損傷的神經(jīng)細胞[5]。

本研究采用佐鏈脲菌素(STZ)腹腔注射造糖尿病模型,用線栓法造大鼠腦部急性缺血損傷[6],制備大鼠腦缺血再灌注模型,觀測黃連水提取混合物對糖尿病腦缺血再灌注模型大鼠Bax和Bcl-2蛋白表達情況的影響,從作用機制方面探究黃連單味藥在腦缺血再灌注造成的神經(jīng)損傷方面的保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 Sprague-Dawley雄性大鼠60只,SPF級,體質量均為180～220 g,8周齡,由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供,許可證號:SCXK(粵)2008-0002。

1.2 藥物與試劑 黃連購自廣東省珠海市三灶鎮(zhèn)源春林大藥房(經(jīng)遵義醫(yī)學院珠海校區(qū)藥學教研室鑒定為植物黃連的根莖); STZ粉劑(美國Sigma公司);10%水合氯醛注射液(上海寶曼生物);一抗:兔源抗鼠Bax多克隆抗體、兔源抗鼠Bcl-2多克隆抗體(上海碧云天生物);兔源抗鼠β-actin單克隆抗體(上海碧云天生物);二抗:辣根過氧化物酶標記山羊抗兔(上海碧云天生物);RIPA蛋白裂解液(上海碧云天生物);PMSF (上海碧云天生物);PVDF膜(上海碧云天生物);其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 黃連藥液的制備 用天平準確稱取上述鑒定過的黃連10 g,第一次煎煮時料液比為1∶10,第二次煎煮時料液比為1∶8,共煎煮2次,每次煎煮1 h,煎煮完成后合并水煎液,置于旋轉蒸發(fā)儀中濃縮,制成含生藥分別為100 mg/ml、50 mg/ml和25 mg/ml的藥液備用。

1.4 動物分組及給藥 SD雄性大鼠隨機分為4組:假手術組、糖尿病合并腦缺血再灌注高、中、低劑量黃連治療組,每組各15只。除假手術組灌胃生理鹽水(10 ml/kg)以外,其余各治療組分別灌予相應藥物劑量(按含生藥100 g/kg, 50 g/kg, 25 g/kg灌注) ,1次/d,連用7 d后造模。

1.5 糖尿病模型制備方法 大鼠禁食8 h以上,左下方腹腔內(nèi)注射STZ 30 mg/kg,24 h后再次腹腔注STZ 35 mg/kg,正常進食飲水飼養(yǎng)7 d,中間不進行血糖干預,也不進行糖尿病飲食控制。密切動態(tài)觀察大鼠癥狀和體征變化,應用羅氏血糖儀(德國羅氏公司)測定尾尖靜脈血糖,當隨機血糖>13.5 mmol/L且伴有多飲、多尿、體質量下降等表現(xiàn)者判定為糖尿病制模成功。假手術組注射等體積的無菌生理鹽水。

1.6 缺血再灌注動物模型制備方法 采用改良線栓法制大腦中動脈栓塞模型:用10%水合氯醛(350 mg/kg)左下腹腔注射麻醉,頸前正中旁切口,充分暴露頸總動脈，分離頸內(nèi)動脈和頸外動脈及其分支;結扎頸外動脈,特定尼龍線栓從頸總動脈插入,向頸內(nèi)動脈方向進入顱內(nèi)至大腦中動脈與大腦前動脈分叉處(此時感到有阻力,線栓進入頸動脈大約18 mm左右)阻斷血流;固定線栓,60 min后拔除線栓,再灌注120 min后取材。假手術組插入線栓但不堵塞大腦中動脈,插入深度為8～10 mm。以SD大鼠麻醉醒后有神經(jīng)功能缺損且未死亡作為動物模型制備成功為標準進行判斷。神經(jīng)功能缺損評分按改良Bederson評分標準執(zhí)行[7]。

1.7 目的蛋白表達情況檢測 采用Western blot法檢測,各組大鼠再灌注2 h后,斷頭處死,在冰盤上(低溫環(huán)境下)快速剝離腦組織(保持完整性),剔除腦干及多余脂肪,凍存?zhèn)溆?。準確稱取大鼠的海馬區(qū)組織100 mg提取總蛋白,加組織裂解液0.99 ml和0.01 ml PMSF于小勻漿器中,至冰上研磨粉碎細胞30 min,4 ℃ 12 000 r/min離心10 min,收集上清液,即為海馬組織蛋白,-80 ℃保存。BCA法測定提取組織的蛋白濃度,根據(jù)蛋白濃度換算所取蛋白溶液體積。取稀釋過的等量蛋白加5×SDS-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)上樣緩沖液按1∶4的比例混合,混勻后蛋白變性于沸水中煮沸5 min。取變性后的蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳,濃縮膠電壓為80 V,分離膠電壓為120 V,進行SDS-PAGE電泳后將含有目的條帶的蛋白轉移到PVDF膜上(濕轉, 轉膜條件220 mA, 30 min)。用(5%脫脂奶粉)封閉液(用TBST配置)封閉2 h,用TBST漂洗工作液充分漂洗(8min×2次)。經(jīng)漂洗后的PVDF膜片分別滴加對應抗體(Bax多克隆抗體、Bcl-2多克隆抗體)(稀釋度為1∶700),用薄膜袋密封后置于4 ℃冰箱內(nèi)孵育過夜(約24 h)。孵育一抗后的PVDF膜用TBST漂洗工作液洗滌3次,每次5 min,加入酶標二抗(稀釋度為1∶1000),用薄膜袋密封后置于室溫搖床內(nèi)孵育2 h,孵育二抗后的PVDF膜用TBST漂洗工作液洗滌3次,每次5 min,ECL法顯色,膠片曝光顯影定影后留底保存。用β-actin做內(nèi)參蛋白重復以上步驟。采用Image J軟件分析膠片圖像,以Bax/β-actin,Bcl-2/β-actin比值分別表示目的蛋白的相對表達水平,采用積分光密度值(IOD)表示。

2 結果

2.1 腹腔注射STZ前后48 h血糖變化 各治療組注射前后血糖變化見表1,黃連低劑量組與黃連高劑量組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。黃連低劑量組與黃連中劑量組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表1 STZ腹腔注射前后48 h血糖變化表(,mmol/L,n=15)

注:與黃連低劑量組比較,*P<0.05

2.2 神經(jīng)功能評分 缺血再灌注動物模型制作成功后2 h,所有實驗大鼠均從麻醉中清醒。除假手術組,其余各組均出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)功能缺損。假手術組、黃連低劑量組、黃連中劑量組和黃連高劑量組神經(jīng)功能評分分別為(0.00±0.0)分、(3.40±0.5)(3.20±0.41)分和(2.50±0.43)分,各組間差異有統(tǒng)計學意義(F=12.632,P<0.05)。與假手術組比較,不同劑量黃連干預組差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05);黃連中劑量組與低劑量組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);黃連高劑量組神經(jīng)功能缺損較中、低劑量組顯著減輕(P<0.05)。

2.3 Bax蛋白表達水平比較 假手術組大鼠的Bax蛋白表達量較黃連各劑量組低,而黃連可下調(diào)各治療組的Bax蛋白表達(P<0.05);且隨著劑量的增加,效果越來越明顯(P<0.01);內(nèi)參各組蛋白條帶IOD差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

2.4 Bcl-2蛋白表達水平比較 假手術組大鼠的Bcl-2蛋白表達量較黃連各劑量組低,黃連可上調(diào)各劑量組Bcl-2蛋白表達(P<0.05);且隨著劑量的增加,效果越來越明顯(P<0.01);內(nèi)參各組蛋白條帶灰度值差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

注: 1: 高劑量組; 2: 中劑量組; 3: 低劑量組; 4: 假手術組圖1 黃連對糖尿病腦缺血再灌注模型大鼠Bax、Bcl-2蛋白表達的影響(WB膠片照片)

表2 黃連對糖尿病腦缺血再灌注模型大鼠Bax和Bcl-2蛋白表達的影響(n=15)

注:與假手術組比較，*P<0.05;與黃連低劑量組比較，△P<0.05

3 討論

目前認為糖尿病加重腦缺血再灌注損傷機理與興奮性氨基酸毒性、鈣超載、自由基反應、梗死周圍除極化及細胞凋亡有著密切的關系[8]。經(jīng)研究證實腦缺血損傷與細胞凋亡密切關系,其受凋亡序列基因調(diào)控[9]。細胞凋亡由多種相關的凋亡基因調(diào)控,其中Bcl-2和Bax是最早研究的凋亡相關基因,Bcl-2和Bax蛋白水平高低與凋亡調(diào)控密切相關?，F(xiàn)認為Bcl-2和Bax是抑制和促進細胞凋亡的兩個最重要基因[10-11]。本研究發(fā)現(xiàn)在黃連治療組中促細胞凋亡蛋白Bax顯著降低,且隨黃連劑量的增加Bax蛋白的表達量顯著減少。而抑制凋亡蛋白Bcl-2水平在黃連治療組的變化趨勢與Bax蛋白表達相反。同時黃連高劑量治療組的血糖,神經(jīng)功能評分均較其他各組改善顯著,故黃連高劑量治療組降低血糖,改善神經(jīng)功能評分,可能與調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax蛋白表達相關。

體外研究表明Bcl-2基因可阻止由多種刺激物誘導的細胞凋亡途徑相同的凋亡,其過表達可導致細胞產(chǎn)生多種促凋亡耐受,因此,抑制Bcl-2基因表達可能是多種細胞凋亡的共同作用通路,其表達下調(diào)可誘導細胞凋亡[12]。

黃連提取物在一定濃度范圍內(nèi)明顯對糖尿病大鼠腦缺血再灌注損傷引起的神經(jīng)元凋亡有抑制作用,推斷其可能通過阻斷線粒體凋亡途徑發(fā)揮抗損傷作用;黃連可能通過調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax蛋白表達量,負調(diào)控大鼠腦缺血再灌注損傷中的神經(jīng)細胞凋亡,從而起到改善腦缺血再灌注損傷的功能。在腦缺血再灌注損傷中，Bcl-2/Bax比值是一個動態(tài)平衡過程,當平衡被打破時凋亡就會加速發(fā)生發(fā)展,故在研究中觀察Bcl-2/Bax的值顯得尤為重要。高血糖會加重腦缺血再灌注損傷已無可爭議,但其機制至今尚未完全清楚。越來越多的研究證明,凋亡是糖尿病合并缺血腦組織再灌注損傷的重要因素,其中,凋亡因子Bcl-2和Bax是構成了腦缺血再灌注損傷轉變的基礎。本研究證實,高劑量的黃連可以改善糖尿病合并腦缺血大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀和調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax的比值,提示高劑量的黃連抗凋亡作用明顯。

[1] Hafez S, Coucha M, Bruno A, et al. Hyperglycemia, acute ischemic stroke, and thrombolytic therapy[J]. Transl Stroke Res, 2014, 5(4):442-453.

[2] 馬紅梅, 陳剛, 李文,等. 黃連化學成分的分離與鑒定[J]. 沈陽藥科大學學報, 2011,28(9):695-699.

[3] 李新崇, 阮立新, 黃其川,等. 黃連堿對腦缺血/再灌注大鼠的影響及其機制研究[J]. 中國臨床藥理學與治療學, 2015, 20(9):1004-1007.

[4] 趙曉蓮, 隋洪玉, 李凱霞,等. 黃連素對糖尿病大鼠腦組織的保護作用[J]. 黑龍江醫(yī)藥科學, 2006, 29(3):4-5.

[5] 茹愛忠, 范強, 楊麗霞. 基于中國知網(wǎng)數(shù)據(jù)庫分析黃連素治療糖尿病的研究現(xiàn)狀[J]. 衛(wèi)生職業(yè)教育, 2017, 35(9):133-135.

[6] 陳曉娟,肖宗宇,潘琪,等.改良線栓法大鼠腦缺血再灌注損傷模型的建立[J]. 中國醫(yī)學創(chuàng)新, 2015,12(3):24-27.

[7] Hunter A J, Hatcher J, Virley D, et al. Functional assessments in mice and rats after focal stroke.[J]. Neuropharmacology, 2000, 39(5):806-816.

[8] Maddahi A, Edvinsson L. Cerebral ischemia induces microvascular pro-inflammatory cytokine expression via the MEK/ERK pathway[J]. J Neuroinflammation, 2010, 7:14.

[9] 高紅莉, 劉昭純, 曲曉蘭. 活血熄風方對局灶性腦缺血大鼠神經(jīng)細胞凋亡及基因蛋白蛋白表達的影響[J]. 中國實驗方劑學雜志, 2010, 16(3):74-76.

[10] Chen J, Graham SH, Nakayama M, et al. Apoptosis repressor genes Bcl-2 and Bcl-x-long are expressed in the rat brain following global ischemia[J]. J Cerebral Blood Flow Metab, 1997, 17(1):2-10.

[11] Sulejczak D, Czarkowska-Bauch J, Macias M, et al. Bcl-2 and Bax proteins are increased in neocortical but not in thalamic apoptosis following devascularizing lesion of the cerebral cortex in the rat: an immunohistochemical study[J]. Brain Res, 2004, 1006(2):133-49.

[12] 劉春嶺, 劉玉府, 李昕,等. 雌激素對血管性癡呆大鼠認知功能、海馬Bcl-2、Bax蛋白表達及神經(jīng)元凋亡的影響[J]. 臨床神經(jīng)病學雜志, 2009, 22(6):433-435.

EffectofCoptidisRhizomaonexpressionofBaxandBcl-2proteinsindiabeticratsmodelofcerebralischemiareperfusion

QINXiao-jun,FENGAi-ping,HUANGQi-jun,QIAOWei,WANGWen.
DepartmentofNeurology,theSecondPeople’sHospitalofDeyangCity,Deyang618000,China

ObjectiveTo explore the effect of coptidis rhizoma on the expression of Bax and Bcl-2 proteins and to explore the protective mechanism in diabetic rats complicated with cerebral ischemia after cerebral ischemia reperfusion.MethodsSixty SD rats were selected and randomized into four groups: sham group and high, medium, low dose groups of coptidis rhizome (100 g/kg, 50 g/kg, 25 g/kg), each involved fifteen rats. The pretreatment group with STZ injection was the diabetic model, and the rats were continuously monitor for 7 days until the blood glucose was stable, and then the cerebral ischemia reperfusion model was made by suture method. The expressions of Bax and Bcl-2 proteins were detected 120 min after cerebral ischemia/reperfusion treated by coptidis rhizoma.ResultsThe expression of Bax protein in the sham group was significantly lower than that in other groups (P<0.05),the expression of Bax protein decreased significantly with the increasing dosage of coptidis rhizoma (P<0.05). The expression of Bcl-2 protein in the sham group was lower than that in other groups (P<0.05), and the expression of Bcl-2 protein increased with the increasing dosage of coptidis rhizoma (P<0.05). The pretreatment group with high dosage of coptidis rhizoma could improve the neurological deficit and blood sugar.ConclusionsCoptidis rhizoma can up regulate the expression of Bcl-2 protein and down regulate the expression of Bax protein, meanwhile reduce the neurological function score and the levels of blood sugar. Coptidis rhizoma may protect the injury induced by diabetes mellitus complicated with cerebral ischemia/reperfusion through inhibiting neuron apoptosis.

coptidis rhizome; diabetes; reperfusion injury; Bax; Bcl-2; cell apoptosis

618000 四川省德陽市，德陽市第二人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

目的探討黃連對糖尿病合并腦缺血再灌注模型大鼠Bax蛋白和Bcl-2蛋白表達的影響及其保護糖尿病合并腦缺血再灌注大鼠的腦損傷作用機制。方法本實驗將SD雄性大鼠60只隨機分為4組,即假手術組和糖尿病腦缺血再灌注黃連高、中、低(100 g/kg, 50 g/kg, 25 g/kg)劑量組,每組15只。黃連干預組給予佐鏈脲菌素(STZ)注射造糖尿病模型。連續(xù)監(jiān)測血糖7 d,待血糖穩(wěn)定后,用線栓法造腦缺血再灌注模型。觀察黃連對糖尿病大鼠腦缺血再灌注120 min后腦組織Bax蛋白和Bcl-2蛋白表達的影響。結果假手術組的Bax蛋白較其他各組低,差異有統(tǒng)計學意義 (P<0.05),而黃連低、中、高劑量組的Bax蛋白表達呈降低趨勢(P<0.05)。假手術組的Bcl-2蛋白表達亦較其他各組低,各黃連劑量組的Bcl-2蛋白表達隨黃連劑量增加而增高(P<0.05),降低血糖,可明確改善神經(jīng)功能缺損癥狀(P<0.05)。結論高劑量黃連能下調(diào)Bax蛋白、上調(diào)Bcl-2蛋白表達,降低血糖,改善神經(jīng)功能缺損癥狀,抑制糖尿病合并腦缺血再灌注損傷后細胞凋亡,從而對糖尿病合并腦缺血再灌注損傷起到保護作用。

R 587.1; R 747.9

A

10.3969/j.issn.1003-9198.2017.11.007

2017-05-21)