福建省登革熱監(jiān)測點(diǎn)白紋伊蚊mtDNA-COI基因遺傳多態(tài)性研究

游麗斌，朱 穎，何文祥，翁育偉,2，王金章，闞乃鵬，張擁軍,2

福建省登革熱監(jiān)測點(diǎn)白紋伊蚊mtDNA-COI基因遺傳多態(tài)性研究

游麗斌1，朱 穎1，何文祥1，翁育偉1,2，王金章1，闞乃鵬1，張擁軍1,2

目的探討福建省登革熱監(jiān)測點(diǎn)白紋伊蚊線粒體細(xì)胞色素C氧化酶亞基I(mtDNA-COI)基因序列特征和遺傳多態(tài)性。方法選擇福建省登革熱監(jiān)測點(diǎn)2015—2016年送檢部分批次白紋伊蚊雌性成蚊，提取基因組DNA，擴(kuò)增全長mtDNA-COI基因片段并測序，分析基因特征并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果PCR擴(kuò)增mtDNA-CO I基因共12個(gè)片段，測序得到的片段長度在1 476 bp—1 494 bp之間。與白紋伊蚊參比序列相比，同源性為99%，包含9個(gè)位點(diǎn)的堿基差異。根據(jù)不同單倍體型序列構(gòu)建種系發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)6個(gè)登革熱監(jiān)測點(diǎn)的白紋伊蚊分屬3個(gè)單倍體型，即H02、H03、H08。結(jié)論確定福建省登革熱監(jiān)測點(diǎn)白紋伊蚊mtDNA-COI基因存在9個(gè)單核苷酸差異位點(diǎn)，包括H02、H03、H08共3種單倍體型，為福建省蟲媒病毒病監(jiān)測及其防控提供技術(shù)支撐。

白紋伊蚊；線粒體細(xì)胞色素C氧化酶亞基I；遺傳多態(tài)性；種系發(fā)生分析

白紋伊蚊(Aedesalbopictus)屬雙翅目，蚊科，伊蚊屬(Aedes)，是登革熱、黃熱病、西尼羅熱、基孔肯雅熱等病毒性疾病傳播的主要媒介[1]。白紋伊蚊原廣泛分布于亞洲的熱帶、亞熱帶地區(qū)和部分溫帶地區(qū)，過去數(shù)十年間其孳生地不斷擴(kuò)大，北美、南美、歐洲和非洲大陸的一些國家均有分布[2]。在中國，白紋伊蚊孳生地遍及遼寧、陜西、江蘇、福建、云南等20個(gè)省份[3]。福建省自1873年廈門首次報(bào)道登革熱的暴發(fā)流行[4]，至今已發(fā)生過多起登革熱的局部暴發(fā)流行，引起嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題[5]。蚊媒控制不僅是處置這類暴發(fā)疫情的關(guān)鍵，也是預(yù)防其它輸入性蟲媒病毒病導(dǎo)致本地病例的核心。近年來國內(nèi)外部分研究表明，生態(tài)環(huán)境變化、區(qū)域間交通運(yùn)輸和人員交流，甚至蚊蟲防治措施的實(shí)施都會影響白紋伊蚊的種群遺傳結(jié)構(gòu)[6-7]。不同地理種群白紋伊蚊在生態(tài)習(xí)性、媒介效能方面的差異影響其流行病學(xué)特征[8]。因此，研究白紋伊蚊不同環(huán)境下遺傳結(jié)構(gòu)的差異和種群動態(tài)特征對于這些蟲媒病毒病的防控工作具有重要參考價(jià)值。

研究白紋伊蚊種群結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)發(fā)育分析的常用遺傳標(biāo)記包括：同工酶、線粒體DNA(mtDNA)、核糖體DNA(rDNA)、微衛(wèi)星等[9]。其中，最常見的靶基因是線粒體基因組細(xì)胞色素C氧化酶亞基I(mitochondrial cytochrome C oxidase subunit I，mtDNA-COI)，該基因具有序列保守、進(jìn)化速率恰當(dāng)、無重組等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于白紋伊蚊蚊種鑒定和進(jìn)化遺傳研究[10]。本研究首次嘗試擴(kuò)增白紋伊蚊mtDNA-COI基因全長，分析2015—2016年福建省白紋伊蚊mtDNA-COI基因序列的多態(tài)性，為福建省蚊媒監(jiān)測提供分子依據(jù)。

1 材料與方法

1.1樣本來源 選取福建省各登革熱監(jiān)測點(diǎn)2015-2016年送檢的白紋伊蚊雌性成蚊，共計(jì)12批，分別來自6個(gè)監(jiān)測點(diǎn)：福州臺江區(qū)(1)、連江縣(5)、廈門集美區(qū)(2)、寧德霞浦縣(1)、莆田涵江區(qū)(1)、建甌市(2)，其中連江縣樣品采集時(shí)間為2015年6月、7月、8月、10月及2016年(表1)。

1.2基因組DNA的提取 采用高鹽抽提法提取基因組DNA，簡述如下：取數(shù)只白紋伊蚊腿于1.5 mL離心管中，加400 μL消化液(10 mmol/L NaCl，10 mmol/L Tris(pH8.0)，10 mmol/L EDTA(pH8.0)，0.5% SDS)；加蛋白酶K(20 mg/mL)40 μL，55 ℃過夜；12 000 r/min離心2 min，轉(zhuǎn)移上清液到新的1.5 mL離心管；加400 μL醋酸鈉溶液(3 mol/L，pH5.2)，-20 ℃放置15 min；12 000 r/min離心20 min，取上清液到新的1.5 mL離心管；加800 μL無水乙醇，-20 ℃放置15 min；12 000 r/min離心20 min，棄上清；加500 μL無水乙醇洗滌1次，12 000 r/min離心5 min，棄上清；加70%無水乙醇500 μL洗滌2次，12 000 r/min離心5 min，棄上清，自然干燥后加50 μL雙蒸滅菌水重懸，-20 ℃保存。

1.3PCR擴(kuò)增和測序 根據(jù)白紋伊蚊線粒體基因組參比序列(GenBank：NC_006817)中mtDNA-COI基因編碼區(qū)(nt1436-2972)設(shè)計(jì)擴(kuò)增全長編碼區(qū)的引物。上游引物(COX1FL-1424F)：5′-CCAGCCATTTAATCGCGACA-3′和下游引物(COX1FL-2999R)：5′-TTCATTGCACTAACTCGCCA-3′由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以提取的白紋伊蚊基因組DNA為模版，進(jìn)行目的基因擴(kuò)增。擴(kuò)增試劑盒Premix TaqTM(Ex TaqTMVersion 2.0 plus dye)為大連TAKARA公司，反應(yīng)體系為50 μL：Premix Taq 25 μL，上下游引物(10 μmol/L)各2 μL，模版2 μL，ddH2O 19 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s；50 ℃退火90 s；72 ℃延伸30 s；共30個(gè)循環(huán)；72 ℃后延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，4 ℃保存，陽性產(chǎn)物送至鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司測序。

1.4mtDNA-CO I基因序列分析 應(yīng)用Bioedit軟件查看雙向測序峰圖，核對序列，與參比序列進(jìn)行多序列比對。從GenBank下載白紋伊蚊mtDNA-COI基因的72種單倍體型序列(GenBank：KC690896-KC690961，AB907796-AB907801)[11-12]，埃及伊蚊mtDNA-COI基因序列(GenBank：AY056597)作為外群，應(yīng)用Mega 6.0[13]構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。采用基于Kimura雙參數(shù)校正模型的最大似然法(maximum likelihood，ML)，并用Bootstraping法對系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行評估，Bootstrap步數(shù)設(shè)置為1 000。

2 結(jié) 果

2.1白紋伊蚊mtDNA-COI基因片段的PCR擴(kuò)增 提取福建省6個(gè)登革熱監(jiān)測點(diǎn)2015—2016年送檢的12批白紋伊蚊雌性成蚊腿的基因組DNA，擴(kuò)增全長mtDNA-COI基因。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，約在1 500 bp處可見單一條帶，與預(yù)期片段大小吻合(圖1)。

M：DL2000 marker；1-12號泳道樣品編號依次為：JO-2015, TJ-2015, JM-2015, HJ-2015, JO-2016, XP-2016, JM-2016, LJ-2016, LJ-2015-Jun, LJ-2015-Jul, LJ-2015-Aug, LJ-2015-OctM: DL2000 marker; Lane 1-12: A. albopictus samples from JO-2015, TJ-2015, JM-2015, HJ-2015, JO-2016, XP-2016, JM-2016, LJ-2016, LJ-2015-Jun, LJ-2015-Jul, LJ-2015-Aug, LJ-2015-Oct圖1 白紋伊蚊全長mtDNA-COI基因擴(kuò)增Fig.1 PCR amplification of full-length mtDNA-COI genes from A. albopictus

2.2白紋伊蚊mtDNA-COI基因變異分析 分別采用擴(kuò)增引物對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，經(jīng)過拼接，片段長度在1 476 bp—1 494 bp之間(GenBank)。與白紋伊蚊參比序列(GenBank：NC_006817)進(jìn)行多序列比對，結(jié)果顯示序列相似性均達(dá)99%，共確認(rèn)9個(gè)變異位點(diǎn)(1505C/T、1580C/G、1678C/A、1706G/A、1804G/A、1966C/T、2104G/A、2296T/C、2805T/C)(表1)。來自福建省6個(gè)登革熱監(jiān)測點(diǎn)的12個(gè)白紋伊蚊樣本之間，mtDNA-COI基因遺傳距離在0.00-0.002，觀察到僅在4個(gè)位點(diǎn)(1804G、2104G、2296T、2805T)存在一個(gè)或多個(gè)變異，其余5處位點(diǎn)均一致。

2.3系統(tǒng)發(fā)育分析 從GenBank下載已知白紋伊蚊mtDNA-COI基因的72種單倍體型序列(這些單倍體型分別來自中國、日本、新加坡、意大利、美國、哥斯達(dá)尼加、巴拿馬等)，并以埃及伊蚊相應(yīng)序列(GenBank：AY056597)作為外群，以共有片段1 388 bp的序列構(gòu)建出系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)。從圖2中看出，來自福建省登革熱監(jiān)測點(diǎn)的這12條序列分屬3個(gè)單倍體型。HJ-2015、JO-2015、JO-2016屬于H03單倍體型，LJ-2015-Aug屬于H02單倍體型，鄰近的單倍體型有H25、H62。其余8條序列JM-2015、JM-2016、LJ-2016、TJ-2015、XP-2016、LJ-2015-Jun、LJ-2015-Jul、LJ-2015-Oct屬于H08單倍體型，在進(jìn)化樹的上下游為H12、H13等單倍體型。值得注意的是，連江縣的5個(gè)批次樣品，分屬H02和H08單倍體型，除了2015年8月樣品LJ-2015-Aug為H02單倍體型，其余樣品均為H08單倍體型。

圖2 福建省登革熱監(jiān)測點(diǎn)白紋伊蚊COI基因的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic analysis on COI genes of A. albopictus from dengue surveillance sites in Fujian

3 討 論

國內(nèi)外不同團(tuán)隊(duì)先后開展了關(guān)于白紋伊蚊mtDNA-COI基因特征的研究，但分析的片段大都在400—700 bp之間[14-17]，由于該基因本身相對保守，且蚊媒樣品來源受到地域限制，能夠提供的信息有限。近幾年，Zhong等[11]將研究對象的地理范圍擴(kuò)大，首次對來自中國、日本、新加坡、意大利、美國等地白紋伊蚊樣品擴(kuò)增了1 433 bp的片段，確定66種單倍體型(H01—H66)，其中包括來自福建廈門的樣品。隨后日本學(xué)者Futami等[12]對哥斯達(dá)尼加、巴拿馬采集的白紋伊蚊進(jìn)行了類似研究，擴(kuò)增了1 390 bp的片段，確定了另外6種單倍體型(H67—H72)。因此，鑒于福建省開展登革熱蚊媒監(jiān)測10余年，尚未明確我省存在哪些單倍體型的白紋伊蚊，本研究的首要目標(biāo)，即是確定各登革熱監(jiān)測點(diǎn)明確存在的白紋伊蚊單倍體型別。

首先，我們設(shè)計(jì)引物并擴(kuò)增了白紋伊蚊的全長mtDNA-COI基因，選擇2015—2016年各登革熱監(jiān)測點(diǎn)送檢的部分批次成蚊，擴(kuò)增得到12條片段，測序后片段長度在1 476—1 494 bp之間。初步同源性分析顯示，所得12條mtDNA-COI片段與白紋伊蚊參考序列(GenBank：NC_006817)的同源性達(dá)99%。在發(fā)現(xiàn)的9個(gè)堿基差異位點(diǎn)中，核苷酸序列1505C、1580C、1678C、1706A、1966C位點(diǎn)上，6個(gè)登革熱監(jiān)測點(diǎn)的12個(gè)白紋伊蚊樣本序列表現(xiàn)出一致性突變，而核苷酸序列1804G、2104G、2296T、2805T位點(diǎn)上，12個(gè)白紋伊蚊樣本序列表現(xiàn)出多態(tài)性(表1)。福建省6個(gè)監(jiān)測點(diǎn)白紋伊蚊樣本間多序列比對結(jié)果顯示，白紋伊蚊樣本mtDNA-COI基因遺傳距離在0.00-0.002之間，遺傳距離極小，說明監(jiān)測期間各監(jiān)測點(diǎn)白紋伊蚊同源性較高。與Zhong等在廈門29只樣品中發(fā)現(xiàn)11個(gè)可變位點(diǎn)的結(jié)果接近，但低于深圳40只樣品發(fā)現(xiàn)24個(gè)可變位點(diǎn)的結(jié)果[11，18]。

表1 福建省登革熱監(jiān)測點(diǎn)白紋伊蚊樣品信息及COI基因變異位點(diǎn)
Tab.1 List of A. albopictus samples collected from dengue surveillance sites in Fujian Province and variation sites of mtDNA-COI gene

樣品編號Sample采集地點(diǎn)Collectionsites采集時(shí)間ColletiontimeGenBank登錄號GenBankNo．COI單倍體型Haplotype變異位點(diǎn)Variationsites150515801678170618041966210422962805參比序列臺灣臺北NC＿006817CCCAGCGTTTJ?2015福州臺江區(qū)2015年5月KY971597H08TGAG—T—C—LJ?2015?Jun福州連江縣2015年6月KY971599H08TGAG—T—C—LJ?2015?Jul福州連江縣2015年7月KY971600H08TGAG—T—C—LJ?2015?Aug福州連江縣2015年8月KY971601H02TGAGAT——CLJ?2015?Oct福州連江縣2015年10月KY971602H08TGAGAT——CLJ?2016福州連江縣2016年KY971596H08TGAGAT——CJM?2015廈門集美區(qū)2015年7月KY971594H08TGAGAT——CJM?2016廈門集美區(qū)2016年KY971595H08TGAGAT——CXP?2016寧德霞浦縣2016年KY971598H08TGAGAT——CHJ?2015莆田涵江區(qū)2015年6月KY971591H03TGAGAT——CJO?2015南平建甌市2015年6月KY971592H03TGAG—TAC—JO?2016南平建甌市2016年KY971593H03TGAGAT——C

注：所有位點(diǎn)均參照GenBank登錄號NC_006817

Note: The variation sites are listed according to the sequence of NC_006817 in GenBank.

然后，通過與目前已知的72種白紋伊蚊mtDNA-COI單倍體型參比序列進(jìn)行種系發(fā)生分析，本研究首次確定了2015-2016年福建省登革熱監(jiān)測點(diǎn)的白紋伊蚊mtDNA-COI基因單倍體型(圖2)。共發(fā)現(xiàn)3種單倍體型，即H02、H03、H08。其多樣性低于文獻(xiàn)報(bào)道中廣州6種、廈門11種單倍體型，而與江蘇2種單倍體型接近[11]。對照Zhong等觀察到的結(jié)果，其中H08單倍體型為廈門獨(dú)有(29只廈門樣品中有9只屬于H08型)，本研究中12批次樣品也有8份為H08型。因此，H08單倍體型是否為福建省特有，需要今后更多序列數(shù)據(jù)證明。同時(shí)，本研究中有3份樣品屬于H03單倍體型。該型別在Zhong等觀察到的結(jié)果屬于優(yōu)勢型，總共346份樣品中有113份屬于H03，并且在廣州、廈門、江蘇樣品中占優(yōu)勢(20/32、9/29、23/30)。從以上數(shù)據(jù)看來，H03單倍體型極有可能是國內(nèi)的優(yōu)勢基因型。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)唯一一份樣品LJ-2015-Aug屬于H02型，而該單倍體型根據(jù)文獻(xiàn)僅出現(xiàn)于來自廣州的樣品，如果能夠得到其它證據(jù)的支持，表明福建省可能發(fā)生過不同遺傳背景的白紋伊蚊入侵事件。從這個(gè)角度來看，鑒于目前白紋伊蚊孳生地在全球不斷擴(kuò)張的事實(shí)，國內(nèi)外研究人員按照統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)和單倍體型分型方案，將有助于精確定位白紋伊蚊的來源、遷徙路線及種群進(jìn)化，科學(xué)評估新的種群入侵可能帶來的危害。

綜上所述，本研究首次擴(kuò)增比較來自福建省各登革熱監(jiān)測點(diǎn)白紋伊蚊mtDNA-COI全長片段序列，觀察到各監(jiān)測點(diǎn)之間樣品同源性較高，并且參照國內(nèi)外現(xiàn)有的72種mtDNA-COI單倍體型確定了各監(jiān)測點(diǎn)的基因型，為今后在分子水平持續(xù)進(jìn)行蚊媒監(jiān)測、推動蟲媒病毒病防控奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

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陽帆, 張仁利, 劉陽,等. 深圳市白紋伊蚊細(xì)胞色素C氧化酶亞基Ⅰ基因多態(tài)性分析[J]. 中國媒介生物學(xué)及控制雜志, 2015, 26(4): 337-340.

GeneticdiversityofcytochromeCoxidasesubunitIgenesinAedesalbopictusfromdenguesurveillancesitesinFujianProvince,China

YOU Li-bin1, ZHU Ying1, HE Wen-xiang1, WENG Yu-wei1,2, WANG Jin-zhang1, KAN Nai-peng1, ZHANG Yong-jun1,2

(1.FujianCenterforDiseaseControlandPrevention,Fuzhou350001,China;2.FujianProvincialKeyLaboratoryofZoonosisDiseaseResearch,Fuzhou350001,China)

The mosquitoAedesalbopictusis the primary vector for dengue virus transmission in Fujian Province. Despite that active dengue surveillance has been launched in several sites since 2005, the genetic diversity ofA.albopictusfrom these sites remains exclusive. In this study, mosquito pools collected from dengue surveillance sites during 2015-2016 were randomly selected, the full-length mitochondrial cytochrome C oxidase subunit I (mtDNA-COI) were amplified and sequenced. Preliminary sequence alignment of 12 amplicons with the reference sequence indicated 99% homology at nucleotide level, due to variations at 9 nucleotide sites. Three haplotypes, namely H02, H03 and H08, were determined based on phylogenetic analysis with 72 reference sequences of known haplotypes. These observations facilitate surveillance and control of arboviral diseases in Fujian.

Aedesalbopitus; mitochondrial cytochrome C oxidase subunit I; genetic diversity; phylogenetic analysis

Zhang Yong-jun,Emial:zhangyj@fjcdc.com.cn

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.10.004

福建省科技廳引導(dǎo)性項(xiàng)目(No. 2016Y0011)和福建省醫(yī)學(xué)創(chuàng)新課題(No. 2015-CXB-13)聯(lián)合資助

張擁軍，Email：zhangyj@fjcdc.com.cn

1.福建省疾病預(yù)防控制中心，福州 350001；

2.福建省人獸共患病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州 350001

373

A

1002-2694(2017)10-0872-05

Supported by the Department of Science and Technology, Fujian Province (No. 2016Y0011) and the Innovative Project of Medical Science of Fujian Province (No. 2015-CXB-13)

2017-01-12編輯李友松