SRSF2在宮頸病變中的表達(dá)及其與HPV16感染的關(guān)系

謝淑琴+劉曉俊+鄭繪霞

【摘要】 目的：研究SRSF2在宮頸鱗狀細(xì)胞癌及宮頸上皮內(nèi)病變中的表達(dá)及其與HPV16感染的關(guān)系。方法：應(yīng)用免疫組織化學(xué)En Vision法檢測SRSF2蛋白在慢性宮頸炎、LSIL、HSIL、宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)情況。結(jié)果：SRSF2蛋白在慢性宮頸炎、LSIL、HSIL、宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中高表達(dá)率分別為0（0/35）、7.14%（5/70）、29.17%（21/72）、67.27%（37/55）。隨著宮頸上皮的病變程度增加，SRSF2蛋白的表達(dá)水平呈上升趨勢。慢性宮頸炎與LSIL比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），其余各組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。HPV16在慢性宮頸炎、LSIL、HSIL、宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中陽性表達(dá)分別為0（0/35）、11.43%（8/70）、41.67%（30/72）、76.37%（42/55），各組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。SRSF2蛋白表達(dá)與HPV16感染呈正相關(guān)（r=0.756，P<0.001）。結(jié)論：SRSF2蛋白的陽性率隨宮頸病變的發(fā)展呈增高趨勢，SRSF2蛋白表達(dá)與HPV16感染呈正相關(guān)，提示HPV16與SRSF2有協(xié)同致瘤作用，SR靶點(diǎn)可能成為HPV相關(guān)的宮頸腫瘤治療新途徑。

【關(guān)鍵詞】 宮頸鱗狀細(xì)胞癌； 宮頸上皮內(nèi)病變； SRSF2蛋白； HPV16

【Abstract】 Objective：To study the expression of SRSF2 in cervical squamous cell carcinoma and cervical intraepithelial lesion and its relationship with the infection of HPV 16.Method：Immunohistochemistry En Vision method was used to detect the expression of SRSF2 protein in chronic cervicitis，low squamous intraepithelial lesion（LSIL），high squamousintraepithelial lesion（HSIL） and cervical squamous cell carcinoma tissues.Result：The strong positive rates of SRSF2 protein in chronic cervicitis，LSIL，HSIL and cervical cancer were 0（0/35），7.14%（5/70），29.17%（21/72），67.27%（37/55）.The expression level of SRSF2 protein showed uptrend with the increase of the degree of cervical epithelial lesions.There was no significant difference between chronic cervicitis and LSIL（P>0.05），but the difference between the other groups was statistically significant（P<0.05）.The positive expression of HPV16 in chronic cervicitis，LSIL，HSIL and cervical squamous cell carcinoma tissues were 0（0/35），11.43%（8/70），41.67%（30/72），76.37%（42/55）.The differences between groups were statistically significant（P<0.05）.The expression of SRSF2 protein was positively correlated with HPV16 infection（r=0.756，P<0.001）.Conclusion：With the development of cervical lesions，the positive rate of conclusion SRSF2 protein is increased，the expression of SRSF2 protein is positively associated with HPV16 infection，suggesting that HPV16 and SRSF2 have synergistic tumorigenic effect，SR may become a target of HPV related cervical cancer treatment in new ways.

【Key words】 Cervical squamous cell carcinoma； Cervical intraepithelial lesion； SRSF2 protein； HPV16

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.20.008

高危型人乳頭狀瘤病毒（HPV）能引起生殖器腫瘤（如子宮頸癌）、頭頸部腫瘤、口咽癌等。人乳頭瘤病毒16型（HPV16）是最常見的高危型HPV。HPV的發(fā)生是由兩種病毒癌基因E6、E7驅(qū)動(dòng)的[1]，活動(dòng)期E6/E7 mRNA的轉(zhuǎn)錄可以產(chǎn)生兩種癌蛋白（E6和E7蛋白），癌蛋白可與宿主細(xì)胞的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白（抑癌蛋白如p53、RB等）相結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞周期控制失常，發(fā)生癌變[2]。絲氨酸/精氨酸豐富（SR）蛋白[SR剪接因子（srsfs）]是調(diào)控構(gòu)和選擇性剪接的關(guān)鍵分子，正確和精確的剪接是野生型蛋白表達(dá)的關(guān)鍵[3]。文獻(xiàn)報(bào)道SRSF2與MDS[4]、CMML[4]、PMF[5]等血液系統(tǒng)疾病的臨床表型和預(yù)后密切相關(guān)，而在實(shí)體腫瘤中鮮有報(bào)道。本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色法研究SRSF2在宮頸鱗狀細(xì)胞癌和宮頸上皮內(nèi)病變中的表達(dá)，術(shù)前或活檢前均經(jīng)過高危型HPVE6/E7 mRNA檢測及HPV16、18/45基因型檢測，研究HPV16感染在宮頸癌和宮頸上皮內(nèi)瘤變中的表達(dá)，并分析SRSF2的表達(dá)與HPV16感染的相關(guān)性，現(xiàn)報(bào)道如下。endprint

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年1月-2016年12月在山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)院手術(shù)或經(jīng)過活檢后存檔的石蠟包埋的慢性宮頸炎、低級(jí)別鱗狀上皮病變（low squamous intraepithelial lesion，LSIL）、高級(jí)別鱗狀上皮病變（high squamousintraepithelial lesion，HSIL）和宮頸鱗狀細(xì)胞癌標(biāo)本232例，年齡44～76歲，平均年齡52歲，其中慢性宮頸炎35例，LSIL 70例，HSIL 72例，宮頸鱗狀細(xì)胞癌55例。所有患者術(shù)前或活檢前均經(jīng)過高危型HPVE6/E7 mRNA檢測及HPV16、18/45基因型檢測，所有患者術(shù)前均未進(jìn)行抗腫瘤治療。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)En Vision法 將蠟塊標(biāo)本切成2 μm厚，經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，3%H2O2去除內(nèi)源性酶，高壓處理熱修復(fù)抗原，加一抗（兔單克隆抗體SRSF2，Abcam，ab204916）后4 ℃過夜，PBS沖洗后滴加二抗，室溫條件下DAB顯色，中性樹膠封片。PBS液做陰性對照。

1.2.2 將采集的宮頸細(xì)胞樣本用APTIMA法進(jìn)行高危型HPVE6/E7mRNA檢測及HPV16、18/45基因型檢測，由自動(dòng)化檢測平臺(tái)Panther直接出結(jié)果。

1.3 判定標(biāo)準(zhǔn) 免疫組織化學(xué)陽性信號(hào)呈棕黃色。SRSF2陽性部位定于細(xì)胞核，根據(jù)染色程度和染色細(xì)胞百分率進(jìn)行組織學(xué)評分：深棕黃色為3分，棕黃色為2分，淡棕黃色為1分，細(xì)胞基本不著色為0分；陽性細(xì)胞率≥51%為3分、26%～50%為2分、6%～25%為1分、≤5%為0分。陽性細(xì)胞率評分與每張切片著色程度的乘積為最后得分：0～1分為陰性（-），2～3分為弱陽性（+），4～6分為陽性（++），6分以上為強(qiáng)陽性（+++），將陰性和弱陽性統(tǒng)一判定為低表達(dá)，陽性和強(qiáng)陽性統(tǒng)一判定為高表達(dá)。在雙盲條件下，每張切片由兩名病理醫(yī)師分別計(jì)數(shù)并進(jìn)行結(jié)果判斷。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，采用 字2檢驗(yàn)、Spearman秩和檢驗(yàn)等方法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SRSF2在不同宮頸病變組織中的表達(dá) SRSF2在慢性宮頸炎中無陽性表達(dá)，隨著宮頸上皮病變程度增加，SRSF2的表達(dá)水平呈上升趨勢，在LSIL、HSIL、宮頸鱗狀細(xì)胞癌高表達(dá)率分別為7.14%（5/70）、29.17%（21/72）、67.27%（37/55）。SRSF2在慢性宮頸炎與LSIL高表達(dá)率均明顯低于HSIL和宮頸鱗狀細(xì)胞癌，不同宮頸病變兩兩比較，慢性宮頸炎與LSIL比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.167>0.05），其余各組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見圖1和表1。

2.2 HPV16在不同宮頸病變組織中的表達(dá) HPV16在慢性宮頸炎、LSIL組、HSIL組、宮頸鱗癌組陽性表達(dá)率分別為0（0/35）、11.43%（8/70）、41.67%（30/72）、76.37%（42/55）。不同宮頸病變組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

2.3 SRSF2蛋白表達(dá)與HPV16感染的相關(guān)性 相關(guān)性分析結(jié)果顯示：在各宮頸病變組織中SRSF2蛋白的陽性表達(dá)與HPV16感染（陽性）呈正相關(guān)（r=0.756，P<0.001）。見表3。

3 討論

近年來由于檢測技術(shù)和診斷水平的提高以及人們防治癌癥意識(shí)的增強(qiáng)，宮頸癌在大多數(shù)發(fā)展中國家的發(fā)病率有所下降[6]，但是每年仍有近30萬婦女死于宮頸癌，而子宮頸上皮內(nèi)病變的發(fā)病率呈逐年上升趨勢。HPV的感染在宮頸上皮內(nèi)瘤變最終演進(jìn)為浸潤癌的過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，高危型如HPV-16持續(xù)感染的HSIL病例，發(fā)展為浸潤癌的幾率更大[7]。HPV相關(guān)腫瘤的發(fā)生是由HPV E6和E7癌蛋白驅(qū)動(dòng)的。APTIMA HPV16、18/45基因型檢測法是一種針對致癌基因E6/E7 mRNA來檢測HPV16、18/45的方法。本研究發(fā)現(xiàn)HPV16在慢性宮頸炎組織中幾乎無表達(dá)（0/35），而在LSIL、HSIL、宮頸鱗狀細(xì)胞癌組陽性表達(dá)率較高（分別為8/70、30/72、42/55），提示HPV16感染與高級(jí)別病變和宮頸鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系，與相關(guān)研究結(jié)果一致。

絲氨酸/精氨酸豐富（SR）蛋白[SR剪接因子（srsfs）]調(diào)控mRNA的轉(zhuǎn)錄、加工、輸出、穩(wěn)定及翻譯等。目前發(fā)現(xiàn)的有9種經(jīng)典的SR蛋白，命名為SRSF1至SRSF9[8]。SR蛋白家族成員的過度異常表達(dá)在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中至關(guān)重要[9]。Fischer等[10]研究表明SRSFl、SRSF2和SRSF3在惡性卵巢組織腫瘤中高表達(dá)，與其進(jìn)展密切相關(guān)。Stickeler等[11]研究顯示SRSFl、SRSF2和SRSF6在乳腺癌中高表達(dá)。Mole等[3]的研究結(jié)果表明SRSF1、SRSF2、SRSF3在宮頸鱗狀細(xì)胞癌中高表達(dá)，而SRSF2能促進(jìn)HPV16陽性宮頸鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展，沉默SRSF2能夠?qū)е掳┘?xì)胞克隆減少、細(xì)胞凋亡增加，這說明SRSF2在宮頸鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。本研究結(jié)果顯示，宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織與HSIL組織中SRSF2的高表達(dá)率（37/55、21/72）均顯著高于LSIL和慢性宮頸炎組織中（5/70、0/35），與Mole等[3]的相關(guān)研究一致；在慢性宮頸炎與LSIL SRSF2的高表達(dá)率（0/33、5/70）比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），而LSIL與HSIL及HSIL與宮頸鱗狀細(xì)胞癌SRSF2的高表達(dá)率比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或<0.01），這提示SRSF2可能成為預(yù)測宮頸癌前病變的一個(gè)重要標(biāo)志物。

Melanie等[12]證明靶向沉默SRSF2導(dǎo)致HPV16 E6/E7mRNA顯著降低，使宮頸癌細(xì)胞增殖增長減速。有研究表明，SRSF2可以直接調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄延伸[13]，也能調(diào)節(jié)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子SP1的表達(dá)，而SP1能反式激活HPV16 P97啟動(dòng)子[14]。此外，SRSF2還能提高E6E7mRNA的穩(wěn)定性[15]，可能與以下機(jī)制有關(guān)：當(dāng)HPV基因組插入到宿主基因組時(shí)，3端癌蛋白R(shí)NA的加工發(fā)生在整合點(diǎn)下游的宿主基因組的多聚腺苷酸化位點(diǎn)，這樣SRSF2就可以直接選擇性地剪接的病毒/基因組基因整合點(diǎn)下游區(qū)外顯子或3端非翻譯區(qū)[16]；SRSF2還能與其同源部位如相關(guān)微管蛋白Tau蛋白結(jié)合[17]，而Tau蛋白能夠防止mRNA的降解，提高E6/E7 mRNA的穩(wěn)定性；E6/E7重組雙順反子mRNA的5端含有提前終止密碼子，而SRSF2可以通過靶向調(diào)節(jié)E6/E7mRNA的無義介導(dǎo)的mRNA降解（nonsense-mediated mRNA decay，NMD）途徑[18]防止提前終止密碼子介導(dǎo)的E6/E7蛋白的生成減少。這些均提示SRSF2在HPV16陽性宮頸癌細(xì)胞中的致癌性及兩者間的協(xié)同致瘤作用。目前SRSF2在髓系腫瘤中的研究較多，而在實(shí)體腫瘤中鮮有報(bào)道，其作用機(jī)制復(fù)雜[19]。本研究結(jié)果顯示，SRSF2蛋白的表達(dá)與HPV16感染存在明顯的正相關(guān)，在HSIL、宮頸鱗狀細(xì)胞癌中HPV的陽性率高達(dá)41.67%（30/72）、76.37%（42/55），而在HPV陽性的HSIL和宮頸癌組織中SRSF2高表達(dá)的病例數(shù)所占比例高達(dá)70.00%（21/30）、88.10%（37/42），進(jìn)一步證實(shí)了SRSF2在HPV16陽性宮頸病變的發(fā)生發(fā)展中的重要作用。由于SR蛋白活性抑制劑是一個(gè)成熟的相關(guān)抗病毒藥物的靶點(diǎn)，調(diào)節(jié)SR激酶的藥物已經(jīng)成功地應(yīng)用于抑制HIV和丙型肝炎病毒的復(fù)制[20]，這很有可能成為HPV相關(guān)的腫瘤治療新途徑。endprint