晚期非小細(xì)胞肺癌中c-MET、ALK、ROS1基因突變的相關(guān)性及臨床意義

朱衛(wèi)東，石晨曦，李三恩，郭凌川

晚期非小細(xì)胞肺癌中c-MET、ALK、ROS1基因突變的相關(guān)性及臨床意義

朱衛(wèi)東，石晨曦，李三恩，郭凌川

目的探討晚期非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)中發(fā)生c-MET擴(kuò)增、ALK和ROS1基因重排的陽性率、基因變異，及其與臨床病理特征的相關(guān)性。方法采用熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization, FISH)檢測91例晚期NSCLC中c-MET、ALK、ROS1基因，分析發(fā)生c-MET擴(kuò)增、ALK/ROS1基因重排的陽性率及其相互間發(fā)生變異的相關(guān)性。結(jié)果NSCLC患者c-MET基因的陽性率為8.79%(8/91)，女性c-MET擴(kuò)增率顯著高于男性(19.4%vs1.82%，P=0.006)；≥60歲患者c-MET擴(kuò)增陽性率高于<60歲(8.89%vs7.5%)；Ⅲ期患者陽性率高于Ⅳ期患者(9.62%vs7.69%)；腺癌患者c-MET擴(kuò)增陽性率為9.2%，鱗癌患者中未發(fā)現(xiàn)c-MET擴(kuò)增。NSCLC中ALK和ROS1融合的陽性率分別為10%和13.3%，且發(fā)現(xiàn)1例患者同時存在c-MET擴(kuò)增和ROS1基因重排。結(jié)論NSCLC中c-MET基因擴(kuò)增陽性率與患者性別相關(guān)，女性患者發(fā)生率明顯高于男性，而與患者年齡、病理類型和臨床分期相關(guān)性不明顯。c-MET基因擴(kuò)增與ALK/ROS1基因重排的發(fā)生幾乎無共存，但并非完全排斥；該實驗首次發(fā)現(xiàn)1例患者同時存在c-MET擴(kuò)增和ROS1基因重排。

肺腫瘤；非小細(xì)胞肺癌；c-MET擴(kuò)增；病理特征；ALK融合；ROS1融合

肺癌在中國的發(fā)病率和病死率最高[1]，其中非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)占肺癌患者發(fā)病數(shù)的80%～85%。NSCLC驅(qū)動基因的靶向藥物因其靶點明確、療效好、副作用小，改變以往的肺癌治療模式，如針對EGFR的酪氨酸激酶抑制劑類藥物(易瑞沙、特羅凱、凱美納、阿法替尼)和針對ALK的抑制劑藥物(克唑替尼、色瑞替尼)，均有效改善NSCLC患者的生存期和生存質(zhì)量[2-3]。c-MET原癌基因又稱肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor, HGF)受體，與EGFR基因一樣位于7號染色體(7q21-31)。c-MET基因發(fā)生異常，如c-MET基因擴(kuò)增、突變、過表達(dá)等，均可導(dǎo)致HGF/MET通路的異常激活，參與腫瘤的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移[4]。由于c-MET基因在腫瘤生物學(xué)的重要作用，已成為NSCLC靶向治療的新熱點，大量臨床試驗正在研究如何抑制MET代謝通路來治療腫瘤。研究發(fā)現(xiàn)，除EGFR T790M突變外，c-MET基因擴(kuò)增也是導(dǎo)致NSCLC患者對EGFR-TKI藥物獲得性耐藥的機(jī)制之一[5]。同時，發(fā)生c-MET基因擴(kuò)增的NSCLC患者，與發(fā)生ALK融合和ROS1融合的NSCLC患者服用克唑替尼藥物均有顯著療效。本實驗通過熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization, FISH)法檢測NSCLC患者的c-MET基因擴(kuò)增，分析其與臨床病理特征的相關(guān)性，同時通過FISH法檢測ALK和ROS1基因融合，探討NSCLC患者中ALK融合基因和ROS1融合基因與c-MET擴(kuò)增的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1臨床資料收集2015年9月～2016年6月蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院保存的91例肺癌組織標(biāo)本。所有患者均由病理科確診為NSCLC，且臨床診斷分期為Ⅲ、IV期，其中石蠟包埋組織91例；男性55例，女性36例；年齡35～89歲，中位年齡60歲，<60歲40例，≥60歲45例；6例患者年齡不詳；病理類型：腺癌87 例，鱗癌4例。

1.2方法

1.2.1c-MET基因擴(kuò)增檢測 應(yīng)用FISH法檢測MET基因的拷貝數(shù)。組織標(biāo)本的MET擴(kuò)增檢測使用Vysis MET SpectrumRed FISH Probe和CEP7 (D7Z1) FISH Probe(Abbott Molecular Inc)。石蠟切片脫蠟采用環(huán)保型脫蠟液，脫蠟30 min(10 min，3次)后浸入100%乙醇脫水1 min，2次；胃蛋白酶消化處理(25 mg/40 mL)；70%、85%和100%乙醇梯度脫水，取10 μL探針滴加在載玻片上，蓋上蓋玻片，封片膠密封；置于Thermobrite原位雜交儀(Abbot)75 ℃變性5 min，37 ℃雜交過夜；然后將切片置洗滌液Ⅰ，輕輕振蕩，使蓋玻片與載玻片分離；立即將載玻片浸入72 ℃洗滌緩沖液Ⅱ中，2 min；室溫暗處干燥加10 μL DAPI(1 000 ng/mL)染色，封固；-20 ℃放置至少30 min；熒光顯微鏡(Olympus BX43)下觀察結(jié)果。

1.2.2FISH法檢測ALK和ROS1融合 91例NSCLC中隨機(jī)選取30例肺腺癌標(biāo)本，采用FISH法分別檢測ALK、ROS1基因融合。ALK融合的FISH檢測使用Vysis LSI ALK雙色分離探針(Abbott Molecular Inc)，該探針在ALK基因斷點的3’端300 kb的片段標(biāo)記為橙色信號，5’端442 kb的片段標(biāo)記為綠色信號。ROS1融合的FISH檢測使用Vysis 6q22 ROS1雙色分離探針(Abbott Molecular Inc)，該探針在ROS1基因斷點的3’端557 kb的片段標(biāo)記為綠色信號，5’端317 kb的片段標(biāo)記為橙紅色信號。具體操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.3結(jié)果判斷

1.3.1c-MET基因擴(kuò)增判斷 計數(shù)100個腫瘤細(xì)胞中MET信號和CEP7信號的數(shù)量，若MET/CEP7比值≥2.0，則為陽性；若MET/CEP7比值<2.0且平均MET拷貝數(shù)≥5.0，則為陽性；若MET/CEP7比值<2.0且平均MET拷貝數(shù)<5.0，則為陰性。

1.3.2ALK與ROS1融合判斷 正常細(xì)胞核中，ALK雙色分離斷裂探針雜交后，會產(chǎn)生2個橙色和綠色融合信號；當(dāng)存在ALK斷裂易位時，雜交后的信號會產(chǎn)生1個橙色信號和1個綠色分離信號。在100倍油鏡下采集圖像。ALK融合陽性的結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：計數(shù)50個腫瘤細(xì)胞，陽性細(xì)胞≥50%為陽性，<10%為陰性；若陽性細(xì)胞≥10%且<50%，則需要重新計數(shù)50個腫瘤細(xì)胞，統(tǒng)計這100個腫瘤細(xì)胞，陽性細(xì)胞≥15%為陽性，<15%為陰性。ROS1的判讀標(biāo)準(zhǔn)：計數(shù)100個腫瘤細(xì)胞，觀察橙綠分離信號，陽性細(xì)胞≥15%為陽性；<15%為陰性

1.4統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，計數(shù)資料用χ2檢驗或Fisher確切概率法，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1c-MET基因擴(kuò)增與NSCLC臨床病理特征的關(guān)系91例NSCLC患者中，有8例c-MET基因擴(kuò)增(圖1)，陽性率為8.79%。55例男性NSCLC患者中，僅1例c-MET擴(kuò)增，陽性率為1.82%；36例女性患者中，有7例c-MET擴(kuò)增，陽性率為19.4%。<60歲的NSCLC患者c-MET擴(kuò)增陽性率為7.5%(3/40)，≥60歲的NSCLC患者c-MET擴(kuò)增陽性率為8.89%(4/45)；腺癌組織中c-MET擴(kuò)增陽性率為9.2%(8/87)，鱗癌組織中無c-MET擴(kuò)增；Ⅲ期NSCLC患者c-MET擴(kuò)增陽性率為9.62%(5/52)，Ⅳ期NSCLC患者c-MET擴(kuò)增陽性率為7.69%(3/39)。由于陽性例數(shù)少，用Fisher確切概率法檢測其余臨床病理資料的相關(guān)性，Cappuzzo標(biāo)準(zhǔn)的擴(kuò)增陽性與患者性別相關(guān)(P=0.006)，女性患者c-MET擴(kuò)增陽性率明顯高于男性；c-MET擴(kuò)增與其他病理資料無顯著相關(guān)(表1)。

表1 c-MET擴(kuò)增與NSCLC臨床病理特征的關(guān)系

2.2ALK、ROS1融合與NSCLC臨床病理特征的相關(guān)性從91例NSCLC中隨機(jī)選取30例肺腺癌標(biāo)本，其中男性17例，女性13例；<60歲者8例，≥60歲者22例；有4例為c-MET擴(kuò)增陽性。應(yīng)用FISH法檢測30例肺腺癌標(biāo)本的基因。結(jié)果顯示：ALK融合陽性為10%(3/30)(圖2)，ROS1融合陽性率13.3%(4/30)(圖3)。ALK融合在女性、<60歲和Ⅲ期NSCLC患者的陽性率高于男性。ROS1融合在女性NSCLC患者的陽性率高于男性，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義；ROS1融合在≥60歲的NSCLC患者中陽性率明顯高于<60歲的患者，Ⅳ期陽性率高于Ⅲ期(表2)。

①②③圖1 c?MET基因擴(kuò)增，紅色為c?MET基因信號，綠色為CEP7信號，F(xiàn)ISH法圖2 ALK陽性細(xì)胞，見橙綠信號分離，F(xiàn)ISH法圖3 ROS1陽性細(xì)胞，見橙綠信號分離，F(xiàn)ISH法

表2 ALK、ROS1融合與NSCLC臨床病理特征的相關(guān)性

2.3c-MET基因與ALK、ROS1融合的相關(guān)性分析c-MET擴(kuò)增與ALK、ROS1融合共存的病例較少，但并非完全排斥。本實驗發(fā)現(xiàn)，有1例患者同時存在ROS1融合和c-MET擴(kuò)增陽性(表3)。

表3 c-MET基因與ALK、ROS1融合的相關(guān)性

3 討論

多項研究表明，由于實驗者采用檢測方法和判斷標(biāo)準(zhǔn)的不同，EGFR野生型的NSCLC患者c-MET擴(kuò)增率為2.4%～21%，在EGFR-TKI耐藥患者中可達(dá)15%～22%[6]。本組91例NSCLC中，c-MET的擴(kuò)增陽性率為8.79%，符合既往研究結(jié)果。由于本組患者是否對EGFR-TKI藥物產(chǎn)生耐藥的臨床資料尚不清楚，因此數(shù)據(jù)未顯示TKI耐藥NSCLC患者與非選擇NSCLC患者的c-MET擴(kuò)增差異。此外，王杰等[7]認(rèn)為c-MET的擴(kuò)增與NSCLC患者性別、年齡、吸煙狀態(tài)、腫瘤組織類型和臨床分期無相關(guān)性。本實驗通過Fisher確切概率法檢驗，首次發(fā)現(xiàn)c-MET擴(kuò)增與患者性別相關(guān)，女性NSCLC患者的c-MET擴(kuò)增陽性率明顯高于男性。分析其原因，可能是本組NSCLC患者例數(shù)較少，尤其是女性患者只有36例，過少的例數(shù)可能導(dǎo)致結(jié)果的偏移。

克唑替尼是一種口服的TKI，對應(yīng)肺癌驅(qū)動基因：ALK重排(3%～5%)、ROS1重排(1%～2%)和MET擴(kuò)增多個靶點。在NSCLC中，ALK重排的克唑替尼在晚期NSCLC患者的治療有顯著療效，2011年已被美國食品藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)用于ALK陽性的轉(zhuǎn)移性NSCLC治療。2016年FDA又批準(zhǔn)克唑替尼用于ROS1陽性的轉(zhuǎn)移性NSCLC治療。臨床試驗顯示ROS1陽性進(jìn)展期NSCLC患者服用克唑替尼，客觀緩解率可達(dá)72%，中位無進(jìn)展生存期達(dá)19.2個月。但它在c-MET陽性的晚期NSCLC中的作用依然處于探索階段。有研究報道：在ALK重排陰性、MET擴(kuò)增陽性的NSCLC患者口服克唑替尼后，出現(xiàn)良好的臨床表現(xiàn)。本實驗ALK融合的陽性率為10%，在年輕、女性患者中的陽性率較高，與之前報道一致[8]。ROS1融合的陽性率為13.3%，女性NSCLC陽性率高于男性，跟文獻(xiàn)報道一致；與患者年齡顯著相關(guān)，≥60歲的NSCLC患者中陽性率明顯高于<60歲患者，而大多數(shù)研究報道顯示ROS1重排更易發(fā)生于年輕患者[9-10]，但也有報道ROS1重排在年紀(jì)大的患者中更容易出現(xiàn)，如潘放等[11]發(fā)現(xiàn)ROS1重排在男性、>59歲的NSCLC患者中高發(fā)。多項數(shù)據(jù)顯示ALK融合和ROS1融合的陽性率分別為3%～5%和1%～2%，造成不同差異的原因與人種、研究人群的選擇及不同的檢測方法有關(guān)。總之，約33.3%(10/30)的NSCLC患者存在上述3種基因的異常狀態(tài)，且各基因間幾乎不同時出現(xiàn)，與相關(guān)報道一致。然而也存在ROS1融合和c-MET 擴(kuò)增共存的病例，意味著約33.3%的NSCLC患者可以使用靶向藥克唑替尼進(jìn)行治療。

綜上所述，c-MET基因擴(kuò)增在NSCLC疾病的發(fā)生和進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，c-MET基因擴(kuò)增應(yīng)作為常規(guī)的基因檢測項目，尤其在女性患者c-MET擴(kuò)增率高的人群，可考慮c-MET、ALK和ROS1為靶點的分子病理聯(lián)合檢測，增加NSCLC患者個體化用藥的機(jī)會。

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Analysisofc-MET,ALK,ROS1variantsinnon-smallcelllungcanceranditsclinicalsignificance

ZHU Wei-dong, SHI Chen-xi, LI San-en, GUO Ling-chuan

(DepartmentofPathology,theFirstAffilirtedHospitalofSoochowUniversity,Suzhou215000,China)

PurposeThe aim was to examine c-MET, ALK, ROS1 variants in advanced non-small cell lung cancer (NSCLC) patients, and to analysis the association of c-MET, ALK, ROS1 variants with the clinical and pathological features.MethodsThe c-MET, ALK, ROS1 were detected by fluorescence in situ hybridization (FISH) in the 91 cases of NSCLC specimens. The correlation of c-MET gene amplification with clinicopathological features and the ALK, ROS1 fusions was analyzed.ResultsThe positive rate of c-MET gene amplification was 8.79% (8/91) , the positive rates on male and female were 1.82% and 19.4%, respectively. In <60-years-old and≥60-years-old NSCLC patients, the positive rates were 7.5% and 8.89%, resepectively. The positive rate was higher in stage Ⅲ than stage IV (9.62%vs7.69%), the c-MET gene amplification was detected in 9.2% adenocarcinoma patients but none in squamous carcinoma patients. The detection rates of ALK fusions and ROS1 fusions were 10% and 13.3%, respectively. One patient was detected the coexistence of MET with ROS1 fusion.ConclusionThe c-MET gene amplification is correlated with gender, but not with age, histological types and clinical stages. C-MET amplification, ALK fusions and ROS1 fusions are almost no coexistence, but not completely mutually exclusive. To they knowledge, this is the first case report the coexistence of MET amplification with ROS1 fusion in NSCLC.

lung neoplasm; non-small cell lung cancer; c-MET gene amplification; clinicopathologic features; ALK fusions; ROS1 fusions

時間：2017-9-18 6:23 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170918.0623.012.html

接受日期：2017-06-20

蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科，蘇州 215000

朱衛(wèi)東，男，主管技師。E-mail: 16586088@qq.com

R 734.2

A

1001-7399(2017)09-0997-04

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.09.012