肝細胞癌中TLR3介導的間質微環(huán)境細胞改變

張崇輝，陳 莉

肝細胞癌中TLR3介導的間質微環(huán)境細胞改變

張崇輝1,2，陳 莉2

目的探討肝細胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)中Toll樣受體3(Toll-like receptor 3, TLR3)的表達及其與臨床病理特征、間質微環(huán)境的相關性。方法采用專利技術(CN101319971B)制備人體HCC組織芯片，應用免疫組化SP法染色檢測HCC細胞中TLR3的表達，同時檢測間質中各項指標。采用多因素相關分析HCC中TLR3表達與其臨床病理特征及間質微環(huán)境的關系。結果HCC中TLR3的陽性率為71.57%，與癌脈管侵犯(P=0.001)、肝硬化背景(P=0.007)、Edmondson分級(P=0.001)、TNM分期(P=0.000)呈負相關；與癌乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen, HBsAg)陽性呈正相關(P=0.000)；與間質浸潤的T細胞(P=0.002)和自然殺傷(natural killer, NK)細胞(P=0.000)呈正相關；與癌相關肌纖維母細胞(carcinoma-associated fibroblasts, CAFs)(P=0.000)和微血管密度(microvessel density, MVD)(P=0.000)呈負相關。結論TLR3對HCC間質微環(huán)境具有十分重要的影響。

肝腫瘤；肝細胞癌；TLR3；臨床病理特征；微環(huán)境；相關性

原發(fā)性肝細胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是世界上最常見的惡性腫瘤之一，其全球發(fā)病率和病死率分別為第5位和第3位[1]，中國是HCC的高危地區(qū)，其發(fā)病率和病死率均占第3位[2]。Toll樣受體(Toll-like receptors, TLR)是果蠅Toll蛋白的同源體，Toll樣受體3(Toll-like receptor 3, TLR3)為TLR家族的重要成員。目前，HCC中TLR3信號活化對癌間質微環(huán)境中細胞的影響尚不十分清楚。本實驗采用免疫組化SP法檢測102例HCC細胞中TLR3表達，以及CD3表達的T細胞與CD56表達的自然殺傷(natural killer, NK)細胞、間質中α-SMA表達的癌相關肌纖維母細胞(carcinoma-associated fibroblasts, CAFs)和血管生成相關指標CD34表達的微血管密度(microvessel density, MVD)，分析HCC中TLR3表達與HCC臨床病理特征、癌間質微環(huán)境的相關性，為臨床治療提供新靶點。

1 材料與方法

1.1材料收集南通市腫瘤醫(yī)院、南通大學附屬醫(yī)院和南通市第三人民醫(yī)院2003年1月～2004年12月手術切除的102例HCC石蠟標本。所有病例術前均未行放、化療處理。102例HCC患者年齡<50歲52例、≥50歲50例；男性84例、女性18例；乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen, HBsAg)陰性71例、陽性31例；生存時間<5年65例、≥5年37例。

1.2組織芯片制作及免疫組化染色利用鄂群、陳莉、金國華等發(fā)明的專利技術(CN101319971B，2010年)制備人體HCC組織芯片，免疫組化采用SP法染色。

1.3判斷標準免疫組化SP法染色呈棕黃色顆粒者為陽性，陽性細胞需結構清晰，著色明顯高于背景。TLR3、CD3、CD56和α-SMA免疫組化結果的判定標準參照文獻，根據(jù)著色強度進行評分：無陽性著色為0分、淡黃色1分、棕黃色2分、深棕色為3分；根據(jù)陽性細胞百分比進行評分：陽性細胞<5%為1分、5%～25%為2分、26%～50%為3分、>50%為4分。兩項得分相加作為最終判定標準：1分為陰性(-)、2分為弱陽性(+)、3分為中等陽性()、≥4分為強陽性()。血管內皮細胞CD34呈陽性，于100倍鏡下選取微血管最密集的3個視野計數(shù)微血管數(shù)目，即為MVD值。MVD分級為：<120為低、120～240為重、>240為高。

1.3統(tǒng)計學方法運用統(tǒng)計學軟件SPSS 19.0進行統(tǒng)計學分析。采用χ2檢驗分析HCC中各指標免疫組化檢測結果，運用Spearman等級相關分析HCC中有關指標間的相互關系。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1TLR3表達與HCC臨床病理特征的關系102例HCC中TLR3主要表達于腫瘤細胞的胞膜或胞質(圖1)，檢測的陽性率為71.57%(73/102)。TLR3表達在脈管侵犯陽性組與陰性組、伴與不伴肝硬化組、Edmondson不同分級組、TNM不同分期組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且呈顯著負相關(P<0.05)；在HBsAg陰性組和陽性組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且呈顯著正相關。HCC中TLR3表達在患者性別、年齡、腫瘤直徑、瘤結數(shù)目及血清甲胎蛋白(α-fetoprotein, AFP)值組中的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05,表1)。

2.2HCC中TLR3表達與癌間質微環(huán)境的相關性

2.2.1HCC中TLR3表達與癌間質免疫活性細胞反應的相關性 HCC間質中免疫活性細胞均定位于細胞胞質(圖2)。在HCC中TLR3表達與CD3陽性的T細胞、CD56陽性的NK細胞呈正相關(表2)。

2.2.2HCC中TLR3表達與癌間質中CAFs反應的相關性 HCC間質中CAFs顯示α-SMA陽性，定位于胞質(圖3)。在HCC中TLR3表達與α-SMA陽性的CAFs呈負相關(表3)。

2.2.3HCC中TLR3表達與間質MVD的相關性 HCC間質CD34表達于血管內皮細胞質或胞膜(圖4)。HCC中TLR3在不同MVD的癌中表達差異有顯著統(tǒng)計學意義，且HCC中TLR3表達與MVD呈顯著負相關(表4)。

表1 TLR3表達與HCC臨床病理特征的關系

表2 HCC中TLR3表達與癌間質免疫活性細胞反應的相關性

表3 HCC中TLR3表達與癌間質CAFs反應的相關性

表4 HCC中TLR3表達與間質MVD的相關性

①②A②B③④圖1 HCC中TLR3表達定位于胞質，呈棕黃色顆粒，SP法 圖2 HCC中免疫活性細胞的表達，SP法：A．CD3陽性的T細胞；B．CD56陽性的NK細胞 圖3 HCC中α?SMA表達的CAFs，SP法 圖4 HCC中CD34表達于血管內皮細胞質或胞膜，計數(shù)MVD，SP法

3 討論

TLR家族能同時調節(jié)天然免疫和獲得性免疫[3]，已知TLR家族表達于各種免疫細胞，甚至還表達于非免疫細胞中[4]。TLR3是TLR家族的重要成員之一，最近的研究已證實TLR3在HCC癌細胞中有一定的表達，活化的TLR3信號導致NF-κB感應，分泌炎癥細胞因子，影響癌微環(huán)境中多種細胞活力[5]。本組在102例HCC中檢測73例TLR3表達于癌細胞胞膜和胞質中，陽性率為71.57%，略高于Yuan等[5]報道的65%，可能與本組收集的HCC病例臨床Ⅰ～Ⅱ級比例較高有關，也可能與本地區(qū)HCC常伴有乙肝病毒(hepatitis B virus, HBV)感染，病毒雙鏈激活TLR3引起其表達增加等有關。

已知雙鏈RNA(double stranded RNA, dsRNA)是TLR3的配體，而dsRNA常是病毒基因組的成分，包括HBV在內的多種病毒在其復制期間均會合成dsRNA。此外，癌細胞壞死或調亡后釋放出的信使RNA(messenger RNA, mRNA)或其他RNA可形成雙鏈結構，都可成為TLR3的配體并與其結合[6]，如本組分析顯示TLR3表達與HBsAg呈正相關。雖然肝炎、肝硬化是HCC發(fā)生、發(fā)展的主要因素，但TLR3可能通過間質微環(huán)境中免疫活性細胞抗病毒免疫反應和抑制CAFs減少基質分泌，如膠原、層粘連蛋白和纖維連接蛋白，抑制HCC間質纖維化。因此，TLR3表達與HCC肝硬化背景呈負相關。由于TLR3表達抑制CAFs，使其基質降解酶(如金屬蛋白酶[7]等)生成減少，而基質降解酶的主要功能是破壞腫瘤細胞與周圍的組織學屏障，因此TLR3表達與HCC脈管侵犯、Edmondson分級和TNM分期呈負相關。由此證明TLR3在抑制惡性腫瘤細胞的生物學行為方面發(fā)揮重要作用[4,8-10]。

腫瘤微環(huán)境是指腫瘤在其逐漸發(fā)展過程中形成的自己獨特的組織內環(huán)境。HCC細胞及其與微環(huán)境之間的動態(tài)變化是細胞存活、生長、增殖、上皮-間充質轉化(epithelial-mesenchymal transitions, EMT)乃至HCC復發(fā)轉移所必需的[11-12]。

在腫瘤局部免疫中以殺傷性T細胞和NK細胞為代表的免疫殺傷細胞對腫瘤生長及轉移發(fā)揮重要作用。T細胞常處于機體免疫系統(tǒng)與腫瘤相互作用的最前沿，其組成和功能在一定程度上反映了機體抗腫瘤反應的性質、強度和總體水平。Faraji等[13]的研究顯示CD8+T細胞的功能正向影響cadml對腫瘤細胞肺轉移的抑制作用。Bidwell等[14]的研究顯示乳腺癌患者去除CD8+T細胞和NK細胞能恢復骨轉移，同時能顯著惡化無轉移患者的預后。Giuliani等[15]在最近的研究中發(fā)現(xiàn)，抗腫瘤藥物來那度胺發(fā)揮抗腫瘤活性的重要途徑是通過激活NK細胞。本實驗中TLR3表達與T細胞及NK細胞均呈正相關，提示TLR3與T細胞及NK細胞對HCC的生物學影響具有協(xié)同作用。

CAFs是腫瘤微環(huán)境的中心成分。HCC微環(huán)境中表達α-SMA的CAFs，同時具有分泌大量細胞外基質與促進基質沉積形成HCC硬化背景的能力[16]。本文中TLR3表達與CAFs呈負相關，系TLR3可能通過間質微環(huán)境中免疫活性細胞抗病毒免疫反應和抑制CAFs以減少基質分泌來抑制HCC間質纖維化。

血管再生是HCC浸潤、擴散和轉移的基礎。異常的腫瘤血管形成，一方面直接給腫瘤細胞提供營養(yǎng)物質，另一方面為腫瘤細胞血道轉移提供阻力最小的通道，使腫瘤細胞更易進入血循環(huán)形成轉移。Guo等[17]的研究表明HCC細胞中發(fā)揮抗血管生成作用正是通過激活TLR3的機制。本組HCC中TLR3表達與MVD呈負相關，提示癌細胞TLR3表達能抑制血管生成。

綜上所述，TLR3作為一種還有待進一步深入分析的新型抗體，可輔助用于對HCC患者臨床病理特征及間質微環(huán)境的評估；同時表明TLR3是HCC靶向性治療中較好的靶點，如能與HCC微環(huán)境的特點相結合，有利于獲得更多的治療效果好、毒副作用低的精準靶向性抗HCC藥物，開拓出新的HCC治療思路，對提高HCC治療的效果并最終徹底掌控HCC具有重要的戰(zhàn)略意義。

[1] Torzilli G, Donadon M, Belghiti J,etal. Predicting individual survival after hepatectomy for hepatocellular carcinoma: a novel nomogram from the “HCC east & west study group”[J]. J Gastrointest Surg, 2016,20(6):1154-1162.

[2] Chen W Q, Zheng R S, Baade P D,etal. Cancer statistics in China, 2015[J]. CA Cancer J Clin, 2016,66(2):115-132.

[3] Lee S O, Brown R A, Razonable R R. Association between a functional polymorphism in Toll-like receptor 3 and chronic hepatitis C in liver transplant recipients[J]. Transpl Infect Dis, 2013,15(2):111-119.

[4] Chen L, Xu Y Y, Zhou J M,etal. TLR3 dsRNA agonist inhibits growth and invasion of HepG2.2.15 HCC cells[J]. Oncol Rep, 2012,28(1):200-206.

[5] Yuan M M, Xu Y Y, Chen L,etal. TLR3 expression correlates with apoptosis, proliferation and angiogenesis in hepatocellular carcinoma and predicts prognosis[J]. BMC Cancer, 2015,15:245.

[6] Xu Y Y, Chen L, Wang G L,etal. A synthetic dsRNA, as a TLR3 pathwaysynergist, combined with sorafenib suppresses HCCinvitroandinvivo[J]. BMC Cancer, 2013,13:527.

[7] Qiao A X, Gu F, Guo X J,etal. Breast cancer-associated fibroblasts: their roles in tumor initiation, progression and clinical applications[J]. Front Med, 2016,10(1):33-40.

[8] Xu Y Y, Chen L, Zhou J M,etal. Inhibitory effect of dsRNA TLR3 agonist in a rat hepatocellular carcinoma model[J]. Mol Med Rep, 2013,8(4):1037-1042.

[9] Tao S S, Zhu L X, Lee P,etal. Negative control of TLR3 signaling by TICAM1 down-regulation[J]. Am J Respir Cell Mol Biol, 2012,46(5):660-667.

[10] Patel A K, Hackam A S. A novel protective role for the innate immunity Toll-like receptor 3 (TLR3) in the retina via Stat3[J]. Mol Cell Neurosci, 2014,63:38-48.

[11] Leonardi G C, Candido S, Cervello M,etal. The tumor microenvironment in hepatocellular carcinoma[J]. Int J Oncol, 2012,40(6):1733-1747.

[12] 吳文涌，孟翔凌，齊 勇，等. 人肝細胞癌中LC3B和p62的表達及意義[J]. 臨床與實驗病理學雜志, 2016,32(4):366-369.

[13] Faraji F, Pang Y, Walker R C,etal. Cadm1 Is a metastasis susceptibility gene that suppresses metastasis by modifying tumor interaction with the cell-mediated immunity[J]. PLoS Genet, 2012,8(9):e1002926.

[14] Bidwell B N, Slaney C Y, Withana N P,etal. Silencing of Irf7 pathways in breast cancer cells promotes bone metastasis through immune escape[J]. Nat Med, 2012,18(8):1224-1231.

[15] Giuliani M, Janji B, Berchem G. Activation of NK cells and disruption of PD-L1/PD-1 axis: two different ways for lenalidomide to block myeloma progression[J]. Oncotarget, 2017,8(14):24031-24044.

[16] Ostman A. Cancer-associated fibroblasts: recent developments and emerging challenges[J]. Semin Cancer Biol, 2014,25:1-2.

[17] Guo Z Y, Chen L, Zhu Y Y,etal. Double-stranded RNA-induced TLR3 activation inhibits angiogenesis and triggers apoptosis of human hepatocellular carcinoma cells[J]. Oncol Rep, 2012,27(2):396-402.

CorrelationofTLR3withthealterationofstromalcellsintumormicroenvironmentofhepatocellularcarcinoma

ZHANG Chong-hui1,2, CHEN Li2

(1DepartmentofPathology,ChangzhouChildren’sHospital,Changzhou213003,China;2DepartmentofPathologicalAnatomy,MedicalSchoolofNantongUniversity,Nantong226001,China)

PurposeTo analyse the correlation between the Toll-like receptor 3 (TLR3) expression and clinic pathologic factors, stromal microenvironment in hepatocellular carcinoma (HCC).MethodsThe tissue microarrays of human HCC were prepared with self-owned patent technology. The expression of TLR3 in HCC cells as well as various indexes in HCC stroma was examined with immunohistochemistry of SP. The correlation between TLR3 expression with the clinic pathologic factors of HCC, and the correlation between TLR3 expression with the reaction of stromal cells in HCC microenvironment were analyzed by multi-factor correlation analysis. Results The positive expression rate of TLR3 in HCC was 71.57%. The expression of TLR3 in HCC had negative correlation with vascular invasion (P=0.001), cirrhosis (P=0.007), Edmondson′s grades (P=0.001) and staging of TNM (P=0.000). It had positive correlation with hepatitis B surface antigen (HBsAg) (P=0.000). It had positive correlation with T cells (P=0.002) and natural killer (NK) cells (P=0.000). It had negative correlation with carcinoma-associated fibroblasts (CAFs) (P=0.000) and microvessel density (MVD) (P=0.000).ConclusionTLR3 has an important influence on the interstitial microenvironment of HCC.

hepatocellular neoplasm； hepatocellular carcinoma； Toll-like receptor 3； clinicopathologic factors； microenvironment； correlation

時間：2017-9-18 6:23 網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170918.0623.010.html

R 735.7

A

1001-7399(2017)09-0987-05

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.09.010

接受日期：2017-06-27

1常州市兒童醫(yī)院病理科，常州 213003

2南通大學醫(yī)學院病理解剖學系，南通 226001

張崇輝，男，碩士，副主任醫(yī)師。E-mail: zch101@163.com

陳 莉，女，博士，教授，通訊作者。Tel:(0513)85051729，E-mail: bl1@ntu.edu.cn