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    食管鱗狀細(xì)胞癌中HIF-1α、CTSD表達(dá)和血管生成擬態(tài)的關(guān)系及其臨床意義

    2017-11-20 09:38:11周芳芳盧林明
    關(guān)鍵詞:擬態(tài)免疫組化陰性

    周芳芳,盧林明,陳 冰

    食管鱗狀細(xì)胞癌中HIF-1α、CTSD表達(dá)和血管生成擬態(tài)的關(guān)系及其臨床意義

    周芳芳,盧林明,陳 冰

    目的觀察食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)組織中缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α)、組織蛋白酶D(cathepsin D, CTSD)的表達(dá)情況,分析兩者表達(dá)與血管生成擬態(tài)(vasculogenic mimicry, VM)及ESCC臨床病理特征的關(guān)系。方法收集120例ESCC組織,采用CD34/PAS套染檢測ESCC VM情況;免疫組化EnVision兩步法檢測ESCC中VM標(biāo)志性分子血管內(nèi)皮鈣黏素(vascular endothelial cadherin, VE-cadherin)和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial grow factor, VEGF)以及HIF-1α、CTSD的表達(dá),分析HIF-1α和CTSD與ESCC臨床病理特征的關(guān)系及各指標(biāo)之間相關(guān)性。結(jié)果120例ESCC中HIF-1α和CTSD的表達(dá)與患者年齡、性別無關(guān);與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管癌栓形成、臨床分期、病理分級等有關(guān);120例ESCC中有25例存在VM;HIF-1α和CTSD在有VM組陽性率明顯高于無VM組,且均與VM表達(dá)呈正相關(guān);CTSD在HIF-1α陽性組的表達(dá)明顯高于HIF-1α陰性組,且兩者表達(dá)呈正相關(guān);VE-cadherin、VEGF在CTSD陽性組的表達(dá)率明顯高于CTSD陰性組,且與CTSD表達(dá)均呈正相關(guān),提示在ESCC中CTSD表達(dá)與VM的形成相關(guān)。結(jié)論CTSD有可能通過HIF-1α參與ESCC中VM形成過程,另外HIF-1α和CTSD高表達(dá)提示ESCC患者預(yù)后不良。

    食管腫瘤;鱗狀細(xì)胞癌;缺氧誘導(dǎo)因子-1α;組織蛋白酶D;血管生成擬態(tài)

    近年食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)病死率一直居高不下,多與其復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移相關(guān)。腫瘤的血管生成可以為腫瘤提供營養(yǎng),促進(jìn)其復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。血管生成擬態(tài)(vasculogenic mimicry, VM)是一種不同于傳統(tǒng)內(nèi)皮細(xì)胞源性的腫瘤新生血管,多種因子均參與VM形成,如缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α)[1-2]、遷移誘導(dǎo)蛋白7(migration inducing-protein 7, MIP7)[3]、血管內(nèi)皮鈣黏素(vascular endothelial cadherin, VE-cadherin)[4]和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial grow factor, VEGF)[5]。但任何一種因子均不能解釋VM發(fā)病機(jī)制,VM形成過程是否還涉及其他因子,有待于進(jìn)一步分析 。組織蛋白酶D(cathepsin D, CTSD)屬于天門冬氨酸水解酶,具有降解細(xì)胞外基質(zhì)和基膜功能,研究表明其[6-7]在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮一定作用。目前,關(guān)于CTSD與ESCC中VM之間關(guān)系報(bào)道較少,本文擬通過免疫組化EnVision兩步法檢測ESCC中HIF-1α、CTSD、VE-cadherin和VEGF表達(dá),并結(jié)合臨床病理特征,分析各項(xiàng)指標(biāo)之間相關(guān)性,探討CTSD是否參與ESCC VM形成,旨在為ESCC臨床診斷、抗血管治療及患者預(yù)后判斷提供新思路。

    接受日期:2017-07-14

    1 材料與方法

    1.1臨床資料收集2012年6月~2014年6月皖南醫(yī)學(xué)院附屬弋磯山醫(yī)院ESCC手術(shù)切除標(biāo)本120例,其中男性96例,占80%;女性者24例,占20%;年齡42~77歲;所有患者術(shù)前均行活檢,無家族史,術(shù)后經(jīng)由3位長期從事病理診斷的高年資醫(yī)師確診為ESCC,手術(shù)前均無放、化療史。根據(jù)腫瘤的分化程度組織學(xué)分級:高分化31例,中分化70例,低分化19例;根據(jù)腫瘤浸潤食管壁深度:浸潤至黏膜層及淺肌層68例,深肌層及外膜層52例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者41例,無轉(zhuǎn)移者79例;有脈管癌栓形成47例,無脈管癌栓形成73例;根據(jù)TNM分期臨床分期:Ⅰ+Ⅱ期70例,Ⅲ+Ⅳ期50例。

    1.2主要試劑兔抗人VE-cadherin多克隆抗體以及鼠抗人單克隆抗體VEGF購自Lifespan Bioscience公司,鼠抗人單克隆抗體CD34、CTSD和HIF-1α均購自北京中杉金橋公司;DAB顯色試劑盒和二抗試劑盒均購自福州邁新公司,PAS染色試劑盒購自上海貝索生物公司。

    1.3方法

    1.3.1免疫組化 采用10%中性福爾馬林固定新鮮ESCC切除標(biāo)本,常規(guī)石蠟包埋組織,4 μm厚連續(xù)切片,常規(guī)烤片、脫蠟、水化、抗原修復(fù)后,按照免疫組化EnVision兩步法試劑盒說明書檢測ESCC組織中HIF-1α、CTSD、VEGF和VE-cadherin的表達(dá),實(shí)驗(yàn)用已知陽性切片作為對照,陰性以PBS代替一抗作為對照。

    1.3.2CD34/PAS雙染 根據(jù)免疫組化EnVision兩步法對CD34進(jìn)行染色,并經(jīng)DAB顯色,根據(jù)PAS試劑盒依次滴加0.5%高碘酸1滴,還原10 min;水流沖洗10 min后將切片平放于避光濕盒中,滴加Schiff試劑1滴,置于37 ℃孵箱反應(yīng)20 min,待目測組織變紅,細(xì)蒸餾水沖洗20 min終止反應(yīng);再滴加Mayer蘇木精染液1滴,復(fù)染細(xì)胞核2 min;溫水返藍(lán)1 min,常規(guī)脫水、封固。正常胃黏膜呈紫紅色為PAS陽性對照片。

    1.4結(jié)果判斷

    1.4.1免疫組化染色判斷 CTSD、VEGF陽性信號均定位于胞質(zhì),VE-cadherin陽性信號定位胞膜/胞質(zhì),HIF-1α陽性信號定位胞核。每例標(biāo)本選擇含有陽性細(xì)胞的高倍視野(×400)5個(gè),每視野200個(gè)細(xì)胞,根據(jù)陽性染色強(qiáng)度進(jìn)行評分:陰性為0分,淡黃色為1分,深黃色為2分,棕色為3分;根據(jù)陽性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行評分:≤10%為0分,10%~30%為1分, 30%~70%為2分,≥70%為3分。將兩項(xiàng)積分相乘得出總分:<3分為陰性,≥3分為陽性。

    1.4.2CD34/PAS雙染VM評判法 顯微鏡下VM由腫瘤細(xì)胞圍城管腔,無內(nèi)皮細(xì)胞;腔內(nèi)有或無紅細(xì)胞;PAS部分或全部陽性;免疫組化CD34陰性均可判定為VM。VM的評判由三位長期從事病理診斷的高年資醫(yī)師采用盲法讀片。

    1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 22.0進(jìn)行分析,實(shí)驗(yàn)指標(biāo)陽性差異采用χ2檢驗(yàn),當(dāng)理論值較小時(shí),采用校正χ2檢驗(yàn);相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析;以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1HIF-1α和CTSD表達(dá)與ESCC臨床病理特征的關(guān)系120例ESCC中HIF-1α陽性51例(42.5%)(圖1),CTSD陽性57例(47.5%)(圖2);HIF-1α和CTSD陽性在不同年齡組和不同性別之間表達(dá)差異無顯著性(P均>0.05,表1),但HIF-1α、CTSD陽性在浸潤至深肌層及外膜層組、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組、Ⅲ+Ⅳ期組、低分化組、脈管癌栓形成組明顯增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05,表1)。

    2.2ESCC中存在VM現(xiàn)象120例ESCC中,有25例(25/120,20.4%)具有典型VM結(jié)構(gòu)。VM是由腫瘤細(xì)胞構(gòu)成的管腔樣結(jié)構(gòu),該管腔樣結(jié)構(gòu)無內(nèi)皮細(xì)胞,腔內(nèi)可見紅細(xì)胞或無紅細(xì)胞,腫瘤細(xì)胞和紅細(xì)胞之間被PAS陽性物質(zhì)分開,且VM周圍無壞死的腫瘤細(xì)胞及炎細(xì)胞浸潤(圖3)。不論管腔內(nèi)有無紅細(xì)胞,管壁出現(xiàn)CD34陽性的血管,均為內(nèi)皮依賴性血管(圖4)。

    2.3ESCC中CTSD表達(dá)與VM的相關(guān)性120例ESCC中有VM組CTSD陽性率明顯高于無VM組,兩者之間呈正相關(guān)(r=0.375,P=0.000,表2)。

    2.4ESCC中CTSD表達(dá)與VM標(biāo)志性分子HIF-1α、VE-cadherin、VEGF的相關(guān)性120例ESCC中HIF-1α陽性組CTSD陽性率明顯高于HIF-1α陰性組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,兩者呈正相關(guān)(r=0.296,P=0.001)。另外,VE-cadherin陽性率40.8%(49/120)(圖5)。CTSD陽性組VE-cadherin的表達(dá)明顯高于CTSD陰性組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,兩者呈正相關(guān)(r=0.466,P=0.000)。VEGF陽性率51.7%(62/120)(圖6)。CTSD陽性組VEGF的表達(dá)明顯高于CTSD陰性組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,兩者呈正相關(guān)(r=0.452,P=0.000,表3)。

    3 討論

    ESCC是常見的消化道惡性腫瘤之一,易局部浸潤和轉(zhuǎn)移,因此其病死率較高;腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移與其血管生成關(guān)系密切。VM是一種不依賴于內(nèi)皮細(xì)胞新的血液供應(yīng)模式。研究表明[8-9],VM與腫瘤惡性程度有關(guān),往往生長越快惡性程度越高,侵襲性越強(qiáng)的腫瘤形成VM的可能性越大,甚至VM可以做為惡性腫瘤預(yù)后不良指標(biāo)。本組結(jié)果顯示,在ESCC中CTSD和HIF-1α陽性與患者年齡、性別無關(guān),但與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、癌栓形成、臨床分期、病理分級等有關(guān);提示其參與ESCC的轉(zhuǎn)移與浸潤。因此,CTSD有可能參與ESCC VM形成過程,同時(shí)也證實(shí)HIF-1α參與VM形成以及可以做為預(yù)后不良指標(biāo)。

    表1 HIF-1α和CTSD表達(dá)與ESCC臨床病理特征的關(guān)系

    ①②③④⑤⑥

    圖1ESCC中HIF-1α呈陽性,EnVision兩步法圖2ESCC中CTSD呈陽性,EnVision兩步法圖3ESCC中VM(箭頭所示),CD34呈陰性,EnVision兩步法圖4ESCC中內(nèi)皮性血管(箭頭所示),CD34呈陽性,EnVision兩步法圖5ESCC中VE-cadherin呈陽性,EnVision兩步法圖6ESCC中VEGF呈陽性,EnVision兩步法

    表2 ESCC中CTSD表達(dá)與VM相關(guān)性

    表3 ESCC中CTSD與HIF-1α、VE-cadherin、VEGF表達(dá)的相關(guān)性

    在惡性腫瘤VM形成過程中除腫瘤細(xì)胞自身變形外,細(xì)胞外基質(zhì)降解重塑也是其關(guān)鍵步驟。因此,經(jīng)典VM形成機(jī)制認(rèn)為[10-13]HIF-1α間接或直接誘導(dǎo)VE-cadherin和VEGF表達(dá),然后通過各級信號級聯(lián)反應(yīng)最終激活基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMP),從而降解細(xì)胞外基質(zhì),促進(jìn)腫瘤細(xì)胞游離并圍成血管樣的通道從而形成VM。缺氧是惡性腫瘤常見微環(huán)境,在惡性腫瘤中,缺氧誘導(dǎo)CTSD表達(dá)重新分布并升高,此外CTSD和MMP同樣具有降解細(xì)胞外基質(zhì),促使其重塑作用。然而,CTSD與ESCC VM之間關(guān)系目前尚不清楚,本組結(jié)果顯示ESCC中CTSD在VM組的陽性率顯著高于無VM組;且HIF-1α、VE-cadherin和VEGF在CTSD陽性組的表達(dá)率均明顯高于CTSD陰性組,并且均與CTSD呈正相關(guān);眾多研究表明由缺氧誘導(dǎo)形成VM的經(jīng)典信號通路中,VEGF[14]、VE-cadherin[15]是關(guān)鍵性因子,提示CTSD可能通過促進(jìn)腫瘤中VE-cadherin、VEGF表達(dá),從而參與ESCC中VM形成。

    綜上所述,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示在ESCC中CTSD可能在缺氧誘導(dǎo)下促進(jìn)VEGF、VE-cadherin表達(dá)等參與ESCC VM形成,從而促進(jìn)ESCC轉(zhuǎn)移和浸潤,同時(shí)也證實(shí)CTSD、HIF-1α和VM三者可以聯(lián)合檢測作為預(yù)后不良的指標(biāo),但CTSD和VM之間具體信號通路及機(jī)制目前尚不清楚,對于CTSD在VM形成中的作用及兩者之間可能存在的信號通路是我們今后分析的重點(diǎn)。另外,進(jìn)一步探討CTSD與VM的關(guān)系對于臨床抗腫瘤血管治療和相關(guān)藥物開發(fā)具有重要指導(dǎo)意義。

    [1] Li S, Meng W, Guan Z,etal. The hypoxia-related signaling pathways of vasculogenic mimicry in tumor treatment[J]. Biomed Pharmacother, 2016,80:127-135.

    [2] Geis T, Popp R, Hu J,etal. HIF-2alpha attenuates lymphangiogenesis by upregulating IGFBP1 in hepatocellular carcinoma[J]. Biol Cell, 2015,107(6):175-188.

    [3] 廖世平,高 青. 血管生成擬態(tài)及相關(guān)蛋白Mig-7、MMP-2 在胃癌組織中的表達(dá)及臨床意義[J]. 細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志, 2013,29(2):194-196.

    [4] Hendrix M J, Seftor E A, Meltzer P S,etal. Expression and functional significance of VE-cadherin in aggressive human melanomacells: role in vasculogenic mimicry[J]. Proc Nat Acad Sci USA, 2001,98(14):8018-8023.

    [5] Raja R, Kale S, Thorat D,etal. Hypoxia-driven osteopontin contributes to breast tumor growth through modulation of HIF-1α-mediated VEGF-dependent angiogenesis[J]. Oncogene, 2013,33(16):2053-2064.

    [6] 展翼翼,達(dá)春麗,劉春玲. 肺腺癌中CD44v6和組織蛋白酶D的表達(dá)及臨床意義[J]. 中國老年學(xué)雜志, 2017,37(1):119-121.

    [7] 張志林,肖 蓉,李慶偉. 組織蛋白酶D的功能多樣性[J]. 中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào), 2014,30(7):647-654.

    [8] Mao X G, Xue X Y, Wang L,etal. CDH5 is specifically activated inglioblastoma stemlike cells and contributes to vasculogenic mimicry induced by hypoxia[J]. Neuro Oncol, 2013,15(7):865-879.

    [9] Wang S Y, Ke Y Q, Lu G H,etal. Vasculogenic mimicry is a prognostic factor for postoperative survival inpatients with glioblastoma[J]. J Neuro Oncol, 2013,112(3):339-345.

    [10] 倪小晴,張佐陽,吳繼鋒. HIF-1α蛋白在胃癌中的表達(dá)及其與Wnt信號通路、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)系[J]. 臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志, 2014,30(2):140-144.

    [11] Zhu W, Sun W, Zhang J T,etal. Norcantharidin enhances TIMP-2 anti-vasculogenic mimicry activity for human gallbladder cancersthrough downregulating MMP2 and MT1-MMP[J]. Int J Oncol, 2015,46(2):627-640.

    [12] 李欣焱,吳淑華,孫晨博,等. Raptor、Rictor與結(jié)直腸癌血管生成的相關(guān)性及其臨床意義[J]. 臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志, 2017,33(2):129-134.

    [13] Liu X, Wang J, Li S,etal. Histone deacetylase 3 expression correlates with vasculogenic mimicry through the phosphoinositide3-kinase/ERK-MMP-laminin5γ2 signaling pathway[J]. Cancer Sci, 2015,106(7):857-866.

    [14] Liang X, Xu F, Ma C,etal. VEGF signal system: the application of antiangiogenesis[J]. Curr Med Chem, 2014,21(7):894-910.

    [15] Tang N N, Zhu H, Zhang H J,etal. HIF-1alpha induces VE-cadherin expression and modulates vasculogenic mimicry in esophagealcarcinoma cells[J]. World J Gastroenterol, 2014,20(47):17894-17904.

    CorrelationoftheexpressionofHIF-1αandCTSDwithvasculogenicmimicryanditsclinicopathologicalfeaturesinesophagealsquamouscellcarcinoma

    ZHOU Fang-fang, LU Lin-ming, CHEN Bing

    (DepartmentofPathology,WannanMedicalCollege,Wuhu241000,China)

    PurposeTo investigate the expression of vasculogenic mimicry (VM) and hypoxia inducible factor-1α (HIF-1α), cathepsin D (CTSD) in esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) and its relationship with clinicopathological parameters.Methods120 specimens of primary ESCC and their clinical data were collected. Dual staining of CD34 and PAS were performed to validate the existence of VM in ESCC. Immunohistochemical of EnVision two-step method was used to detect the expression of VM-related markers vascular endothelial cadherin (VE-cadherin) and vascular endothelial grow factor (VEGF), HIF-1α and CTSD in 120 cases of ESCC. The relationship between HIF-1α, CTSD and clinical pathological parameters were analyzed.ResultsThe positive rate of HIF-1α, CTSD was correlated with infilatrating, lymph node metastasis, clinical stage and cancer embolus. VM existed in 25 of 120 cases. The expression of HIF-1α and CTSD in cases with VM was obviously higher than that without VM, the expression of HIF-1α and CTSD was positively correlated with VM in ESCC. The expression of CTSD in case with HIF-1α was obviously lower than that without HIF-1α, the expression of CTSD was positively correlated with HIF-1α in ESCC. The expression of VE-cadherin and VEGF in cases with CTSD was obviously higher than that without CTSD, the level of VE-cadherin and VEGF expression was positively correlated with CTSD in ESCC.ConclusionCTSD may promote VM formation in ESCC via HIF-1α. High expression of HIF-1α and CTSD indicate poor prognosis of ESCC patients.

    esophageal neoplasm; squamous cell carcinoma; hypoxia inducible factor-1α; cathepsin D; vasculogenic mimicry

    時(shí)間:2017-9-18 6:23 網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170918.0623.008.html

    R 735.1

    A

    1001-7399(2017)09-0977-05

    10.13315/j.cnki.cjcep.2017.09.008

    2017年安徽高校自然科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(KJ2017A249)、2017年皖南醫(yī)學(xué)院中青年科研基金(WK201710)

    皖南醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室,蕪湖 241000

    周芳芳,女,碩士,助教。E-mail: zff2468@163.com

    盧林明,男,碩士,副教授,通訊作者。E-mail: 3156214539@qq.com

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