河北省2015—2016年諾如病毒感染性腹瀉疫情的病原分子特征分析

劉瑩瑩 于秋麗 蘇通 趙文娜 謝赟 鮑文 齊順祥

050021 石家莊，河北省疾病預防控制中心

河北省2015—2016年諾如病毒感染性腹瀉疫情的病原分子特征分析

劉瑩瑩 于秋麗 蘇通 趙文娜 謝赟 鮑文 齊順祥

050021 石家莊，河北省疾病預防控制中心

目的了解河北省諾如病毒(Norovirus, NoV)感染性腹瀉疫情的病原流行特點及基因型變異情況。方法收集2015年1月至2016年12月間，共8起感染性腹瀉疫情臨床標本和相關臨床信息，采用實時熒光RT-PCR法檢測NoV核酸，陽性標本經(jīng)傳統(tǒng)RT-PCR擴增衣殼蛋白區(qū)部分序列進行測序和系統(tǒng)進化分析。結果河北省2015年1月至2016年12月間共發(fā)生8起腹瀉疫情，病例265例，7起疫情中檢測到NoV核酸陽性病例53例，檢出率66.25%，罹患率波動在0.70%～8.13%，主要為小區(qū)居民、幼兒及學生。成功測序分型28份標本，基因型包括GⅠ.3型、GⅡ.2型、GⅡ.4型、GⅡ.13型和GⅡ.17型。結論河北省NoV感染性腹瀉疫情呈現(xiàn)病毒基因型多樣性。

諾如病毒(Norovirus，NoV)是導致全球急性胃腸炎散發(fā)和暴發(fā)的主要致病原之一，根據(jù)NoV聚合酶和結構蛋白氨基酸序列同源性，將NoV分為GⅠ～GⅦ共7 組和至少36種不同的基因型[1]，可感染人類的包括GⅠ、GⅡ 和GⅣ 組毒株，其中GⅠ有8個基因型(GⅠ.1～GⅠ.8)，GⅡ至少有21個基因型(GⅡ.1～GⅡ.21)。

NoV變異快和環(huán)境中穩(wěn)定的特點使其每隔幾年就有新變異株出現(xiàn)，不同國家和地區(qū)的NoV在不同時間流行的病毒株系不同，可進化逃避人群的免疫壓力，使其具有導致全球每2～3年周期性流行的潛能[2]。GⅡ.4基因型一直占據(jù)全球NoV暴發(fā)疫情的主導地位。2012年冬，世界多個國家和地區(qū)的NoV監(jiān)測網(wǎng)均監(jiān)測到NoV的高位流行，檢出了GⅡ.4/Sydney_2012新型變異株[3]；2014—2015年，GⅡ.17型代替了GⅡ.4型，成為亞洲部分地區(qū)的NoV暴發(fā)的主要病原體[4]；2016年底，我國以及德國、法國、日本等同期相繼報道了由重組NoV GⅡ.P16/GⅡ.2型導致的暴發(fā)疫情或感染病例[1, 4]，提示該型NoV有成為全球流行株的可能性。因此，詳細了解我省NoV感染性腹瀉疫情的病原流行特點及基因型演化情況，對采取有效預防措施控制NoV感染和暴發(fā)具有重大意義。

1 材料與方法

1.1資料來源收集河北省2015年1月至2016年12月間共8起NoV感染疑似聚集性/聚集性/暴發(fā)疫情處置資料。疑似聚集性疫情、聚集性疫情及暴發(fā)疫情定義詳見《諾如病毒感染暴發(fā)調(diào)查和預防控制技術指南(2015版)》[5]。

1.2病例搜索采用中國疾病預防控制中心編制的“諾如病毒急性胃腸炎暴發(fā)疫情個案調(diào)查表”，病例定義[5]為：急性胃腸炎病例，24 h內(nèi)出現(xiàn)排便≥3 次且有性狀改變(呈稀水樣便)，和/或24 h 內(nèi)出現(xiàn)嘔吐≥2 次者。

1.3標本采集及檢測疫情現(xiàn)場采集患者糞便/肛拭子和嘔吐物標本，置于病毒采樣管內(nèi)，-4 ℃條件下運輸，置-80 ℃冷柜保存待檢。

采用美國Promega公司Maxwell?16 Tissue LEV Total RNA Purification Kit試劑盒提取RNA，按試劑盒說明書操作。使用NoV GⅠ/GⅡ核酸檢測試劑盒(熒光定量PCR法，江蘇碩世生物科技有限公司)檢測，反應體系參照試劑盒說明。反應在ABI 7500熒光定量PCR儀上進行。

核酸陽性標本采用美國Invitrogen公司SuperScript?Ⅲ Reverse Transcriptase進行反轉錄。應用Promega公司GoTaq?Colorless Master Mix體系，進行RT-PCR擴增。引物序列見《諾如病毒感染暴發(fā)調(diào)查和預防控制技術指南(2015版)》[5]，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，具體反應步驟參照試劑盒說明。

1.4序列測定與分析PCR陽性產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司純化和測序。根據(jù)NoV衣殼蛋白區(qū)的核苷酸序列對病毒進行基因分型，采用DNAStar、Mega5.2等生物信息學軟件對序列進行同源性比較和構建系統(tǒng)進化樹。進化樹中所有參考株序列均來自源于GenBank 數(shù)據(jù)庫。

2 結果

2.1疫情概況河北省2015年1月至2016年12月間共發(fā)生8起腹瀉暴發(fā)/聚集(疑似聚集性)疫情，其中，2015年5起，2016年3起，波及人口11 396人，其中病例265例，無死亡病例，罹患率波動在0.70%～8.13%。疫情流行期最短4 d，最長9 d，中位數(shù)6 d。8起疫情的分布在承德(3起)、石家莊(2起)、滄州(1起)、廊坊(1起)和保定(1起)。疫情發(fā)生地點分別為4個住宅小區(qū)、2 所幼兒園和2所中學。病例主要為小區(qū)居民(63.02%, 167/265)，其次為幼兒(19.24%, 51/265)及學生(17.74%, 47/265)。疫情主要發(fā)生在4月至6月和12月，病例的主要臨床表現(xiàn)有腹痛(100%)、腹瀉(87.79%)、惡心嘔吐(48.09%)、發(fā)熱(10.69%)等。

2.2實驗室檢測結果采集8起疫情中患者糞便/肛拭子和嘔吐物標本共計80份，其中7起疫情檢測到NoV核酸陽性標本共53份，陽性檢出率66.25%，其中GⅠ 4份(7.55%, 4/53份)，GⅡ 48份(90.56%, 48/53份)，其中2015年滄州的一起疫情檢測GⅠ+GⅡ混合感染1份(1.89%, 1/53份)，并成功測得28株NoV株序列，見表1。

2.3同源性及進化樹分析系統(tǒng)進化分析顯示，本研究測得的28株NoV株序列分別分布在GI.3c型、GⅡ.2型、GⅡ.4 Sydney型、GⅡ.13型和GⅡ.17型分支上(圖1)。

3株GI.3c型毒株來自滄州華油疫情，同源性達到98.9%～99.3%，與2013 年山東株的親緣關系較近，同源性達到98.6%～100.0%。

GII.2型7株，其中6株來自廊坊廣陽疫情，同源性達到99.2%～100.0%，與2016年中國(廣東、香港)、法國等新報道的GⅡ.P16/GⅡ.2型病毒株親緣關系較近，同源性高達98.6%～98.9%，而來自保定高碑店疫情的1株毒株，則與2013年山東株GⅡ.2型的親緣關系較近，同源性為96.1%，兩起疫情毒株的同源性為94.4%～95.3%。2016年中國(廣東、香港)、法國等新報道的GⅡ.P16/GⅡ.2型病毒株與2013年GⅡ.2型的山東株的同源性為96.8%～97.9%。

表1 2015—2016年8起諾如病毒感染性腹瀉疫情核酸檢測陽性結果

保定高碑店疫情1株GII.4/Sydney_2012新型變異株，與2014 年的安徽株和2016 年的中國臺灣株親緣關系較近，同源性達到94.0%～94.7%。

GII.13型3株，2株來自滄州華油疫情，同源性為99.6%，與來自承德雙灤區(qū)疫情的1株同源性達到99.6%～100.0%， 兩起疫情毒株均與2013年的山東株和2010年的尼泊爾株親緣關系較近，同源性達96.9%～100.0%。

GII.17型14株，其中4株來自滄州華油疫情，同源性達到99.6%～100.0%，其余10株來自石家莊新華區(qū)疫情，同源性100.0%，兩起疫情毒株的同源性達到99.6%～100%，與2014—2016年中國(北京、廣州、香港、臺灣)、美國及韓國報道的各毒株親緣關系均較近，同源性達到96.3%～100.0%。

3 討論

以往報道的資料表明，NoV具有感染劑量低和傳染性強等特點，可在空間相對封閉的情況下迅速傳播，常引起急性胃腸炎暴發(fā)流行，其所帶來的社會恐慌和社會經(jīng)濟負擔巨大[3]。2015年1月至2016年12月間，河北省共發(fā)生8起NoV感染性腹瀉疫情，發(fā)生地點主要在居民區(qū)、幼兒園和中學，與其他國家和地區(qū)的相關報道較為相近[6-9]。其中7起疫情檢出NoV核酸陽性標本53份，陽性檢出率66.25%，確定這些疫情均為NoV感染所致。

本研究經(jīng)測序成功分型28份標本，基因型包括GI.3型、GⅡ.2型、GⅡ.4型、GⅡ.13型和GⅡ.17型。2015年1月至2016年12月間，河北省大部分胃腸炎疫情均由單一型別引起，有2起疫情檢測出至少兩種型別毒株，2015年滄州疫情分別檢測出GⅠ.3型、GⅡ.13型和GⅡ.17型，2016年保定疫情檢測出GⅡ.2型和GⅡ.4型兩種型別，表明NoV感染性腹瀉疫情具有基因型多樣性。但由于每起疫情成功測到的序列較少，只能說明可能存在多種型別的NoV感染，而不能完全確證是哪種型別為主而導致的疫情，或者不排除其中某種型別僅屬于散發(fā)。NoV復雜多變的基因型對疾病防控措施是一個很大的挑戰(zhàn)，所以更加需要完善NoV感染性腹瀉監(jiān)測網(wǎng)絡，加強長期病原學監(jiān)測，及時發(fā)現(xiàn)流行型別的動態(tài)變化及變異變遷規(guī)律。

注：● 表示河北毒株圖1 NoV ORF2區(qū)核苷酸序列系統(tǒng)進化樹Note: ● indicates Hebei virus strainsFig.1 Phylogenetic tree based on partial ORF2 gene sequences from NoV strains

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2017-03-28)

(本文編輯：呂新軍)

AnalysisofmolecularcharacteristicsofaggregationepidemicinducedbynorovirusinfectioninHebeiprovince,2015-2016

LiuYingying,YuQiuli,SuTong,ZhaoWenna,XieYun,BaoWen,QiShunxiang

HebeiProvincialCenterforDiseaseControlandPrevention,Shijiazhuang050021,China

QiShunxiang,Email:hbcdc999@163.com

ObjectiveTo understand epidemiological characteristics of the pathogens and evolution of the genotype associated with infectious diarrhea epidemic caused by norovirus in Hebei Province.MethodsA total of 8 infectious diarrhea outbreaks caused by norovirus were reported from Jan 2015 to Dec 2016, of which epidemic treatment materials and specimens were collected at the same time. Norovirus nucleic acid was detected by using real-time PCR, and the partial ORF2 of the all positive specimens were amplified by RT-PCR and sequenced. Phylogenetic tree was constructed by using Mega5.2 based on partial ORF2 sequences of norovirus to perform phylogenetic analysis.ResultsA total of 8 norovirus outbreaks, involving 265 cases who were mainly for residential inhabitents, children and students, were reported during this period, and the overall attack rate ranged from 0.70% to 8.13%. The overall positive detection rate of norovirus was 66.25%. The PCR products were sequenced，and sequencing result were obtained for 28 samples, which included GⅠ.3, GⅡ.2, GⅡ.4, GⅡ.13 and GⅡ.17.ConclusionsMultiple genotypes of infectious diarrhea outbreaks caused by norovirus were found in Hebei province.

Norovirus; Outbreaks; Genotypes; Molecular characteristics

齊順祥，Email: hbcdc999@163.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2017.05.012

諾如病毒；暴發(fā)；基因型；分子特征

國家“十二五”重大科技專項子課題(2013ZX10004202)；河北省科技支撐計劃項目(14277761D)；河北省醫(yī)學科學研究重點課題(20160059)

FundprogramsNational Science and Technology Major Project of China (2013ZX10004202); The Science and Technology Support Project of Hebei Province (14277761D); Major Medical and Scientific Research Projects of Hebei Province (20160059)