福州地區(qū)重癥呼吸道感染患兒中4種人冠狀病毒的檢測與分析

修文瓊 鄭奎城 吳冰珊 黃萌 謝劍鋒 康育蘭 劉光華

350001 福州，福建省疾病預防控制中心 福建省人獸共患病研究重點實驗室(修文瓊、鄭奎城、吳冰珊、黃萌、謝劍鋒)；350001 福州，福建醫(yī)科大學教學醫(yī)院福建省婦幼保健院(康育蘭、劉光華)

福州地區(qū)重癥呼吸道感染患兒中4種人冠狀病毒的檢測與分析

修文瓊 鄭奎城 吳冰珊 黃萌 謝劍鋒 康育蘭 劉光華

350001 福州，福建省疾病預防控制中心 福建省人獸共患病研究重點實驗室(修文瓊、鄭奎城、吳冰珊、黃萌、謝劍鋒)；350001 福州，福建醫(yī)科大學教學醫(yī)院福建省婦幼保健院(康育蘭、劉光華)

目的了解4種人冠狀病毒(HCoV-HKU1、HCoV-NL63、HCoV-OC43、HCoV-229E)在福州急性重癥下呼吸道感染患兒中的感染狀況及臨床意義。方法收集2007年11月至2015年1月因呼吸道感染住進醫(yī)院兒科重癥監(jiān)護病房的小兒鼻咽抽取物標本，共計266份。通過RT-PCR法先用一對通用引物對人冠狀病毒pol基因片段進行檢測。測序并BLAST比對分析8份陽性產(chǎn)物。對用HCoV通用引物檢測陽性的標本，再分別用兩種人新型冠狀病毒HCoV-HKU1和HCoV-NL63的特異性引物進行擴增檢測。對這8株病毒進行系統(tǒng)進化分析。結(jié)果檢出8例HCoV感染陽性病例,檢出率3.0%。其中2例感染HCoV-HKU1，1例感染HCoV-NL63，1例感染HCoV-229E，4例感染HCoV-OC43。在這266例住院患兒中HCoV-HKU1感染的檢出率約為0.75%；HCoV-NL63和HCoV-229E感染的檢出率約為0.38%；HCoV-OC43感染的檢出率約為1.50%。檢測出兩例HCoV-HKU1與人副流感病毒3型(HPIV-3)的混合感染。系統(tǒng)進化分析表明這8株HCoV分成4簇，2株HCoV-HKU1屬于HKU1基因型A。結(jié)論4種人冠狀病毒可能是兒童下呼吸道感染中較為重要的病原。

呼吸道感染是兒童住院治療的首要疾病, 發(fā)病率高，死亡率也很高。目前還有超過40%的呼吸道感染的病因未知，下呼吸道感染更是人類主要疾病負擔，成為兒童發(fā)病和住院的主要原因。人類呼吸道感染病原復雜，大部分由病毒引起。人冠狀病毒(Human coronaviruses, HCoV)屬冠狀病毒科冠狀病毒屬，通常引起普通感冒、下呼吸道感染或肺炎，也可引起腹瀉或胃腸炎，甚至腦膜腦炎等。HCoV-229E[1]和HCoV-OC43[2]都是1960s被發(fā)現(xiàn)的。2002—2003年SARS[3]冠狀病毒的出現(xiàn)推進了研究者對在人和動物中發(fā)現(xiàn)新型冠狀病毒的興趣。繼SARS-CoV之后，又有兩種新的引起呼吸系統(tǒng)疾病的HCoVs(HCoV-NL63和HCoV-HKU1)被相繼發(fā)現(xiàn)。HCoV-NL63[4]是2004年由荷蘭科學家發(fā)現(xiàn)的，引起感冒、咳嗽、發(fā)熱、痰多、咽痛和鼻炎等，但小孩和老人感染可出現(xiàn)嚴重的下呼吸道癥狀，以支氣管炎和毛細支氣管炎多見，還可引起結(jié)膜炎，甚至腹瀉。HCoV-HKU1[5]是2005年由中國香港科學家發(fā)現(xiàn)的，引起流涕、發(fā)熱、咳嗽和喘鳴，疾病表現(xiàn)為支氣管炎、肺炎和重癥肺炎，也可引起胃腸疾病。

因此，研究4種人類非SARS冠狀病毒在各地的流行狀況和臨床相關(guān)性以評估HCoVs感染的臨床意義是非常必要的。本研究從2007年11月至2015年1月采集了因呼吸道感染住進福建省婦幼保健院兒科重癥監(jiān)護病房(PICU)的小兒鼻咽抽取物標本共266份，用分子生物學方法對4種HCoVs進行檢測和基因序列比對分析研究，以便了解4種人類呼吸道HCoVs，尤其是兩種新型HCoVs在本地區(qū)小兒中的感染情況。

1 材料與方法

1.1研究對象采集因急性下呼吸道感染住進PICU的患兒的鼻咽抽取物(Nasopharyngeal aspirates, NPA)標本，共計266份。采樣之前已征得患兒父母的知情同意和醫(yī)院倫理委員會的批準?；颊吣挲g從9 d到12歲半，平均年齡6.1月，中位年齡72.0 d。74.6%為男孩，25.4%為女孩。

1.2研究方法

1.2.1 標本處理：在3 ml 左右DMEM采樣液中加入NPA標本，在生物安全柜里反復吹打，并加入200 U/ml青霉素和200 U/ml鏈霉素，分裝數(shù)管，-70 ℃保存。

1.2.2 病毒RNA提取：將標本進行兩次凍融，然后10 000×g離心15 min，吸取上清。用德國Qiagen 公司的QIAamp Viral RNA Mini Kit，提取病毒RNA。

1.2.3 RT-PCR產(chǎn)物的擴增：采用的一對人冠狀病毒通用引物[5]為5′-GGTTGGGACTATCCTAAGTGT GA-3′，5′-CCATCATCAGATAGAATCATCATA-3′，擴增產(chǎn)物為pol基因的一段，長440 bp；一對新型人冠狀病毒HCoV-HKU1的特異性引物[6]為5′-TAGTGGTATGGATACTGCCTTGT-3′，5′-GCTTTAACATTTCAGMATTACCA-3′, 擴增產(chǎn)物長950 bp；另一對新型人冠狀病毒HCoV-NL63的特異性引物[6]為5′-ACACAGCTGAATCTTAAGTATGC-3′，5′-TCACATTTGGGATAATCCCA-3′，擴增產(chǎn)物長251 bp。引物由TaKaRa(大連)有限公司合成。

1.2.4 其他幾種呼吸道病毒的檢測：對檢測出HCoVs的8例陽性標本也進行了4種常見呼吸道病毒—呼吸道合胞病毒(RSV),甲1、甲3和乙型流感病毒,人副流感病毒(HPIV)1～4型和呼吸道腺病毒(R-ADV)的檢測。應用熒光定量RT-PCR法檢測流感病毒和HPIV1～4型，應用熒光定量PCR法檢測R-ADV，試劑盒均購自上海之江生物技術(shù)有限公司；應用RT-PCR方法[7]檢測RSV、人偏肺病毒(hMPV)[8]；應用PCR法檢測人博卡病毒(HBoV)[9]、WU多瘤病毒(WUPyV)[10]和KI多瘤病毒(KIPyV)[11]。

1.2.5 RT-PCR產(chǎn)物的純化及序列測定：由鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司對RT-PCR的擴增產(chǎn)物進行純化和序列測定。

1.2.6 基因比對分析：將所測得的序列在GenBank中進行Blast初步比對分析。多序列比對由DNAStar完成，系統(tǒng)進化分析采用MEGA6.06軟件，以鄰接法(Neighbor-Joining method)構(gòu)建，Bootsrap值設(shè)定為1 000。

2 結(jié)果

表1 HCoVs檢測陽性患兒臨床資料

表2 8株福州HCoV的pol基因片段Blast比對分析結(jié)果

2.1RT-PCR檢測從266例患兒中檢測到8例HCoV感染陽性病例，經(jīng)基因序列測定分析得到證實，檢出率3.0%。其中4例檢出HCoV-OC43(FZ13, FZ15, FZ20, FZ134)，檢出率1.5%；2例檢出HCoV-HKU1(FZ90, FZ96)，檢出率0.75%；1例檢出HCoV-NL63(FZ68)，檢出率0.38%；還有1例檢出HCoV-229E(FZ74)，檢出率0.38%。

2.2陽性病例的臨床癥狀這8例患兒都因為感染導致支氣管炎、毛細支氣管炎或重癥肺炎而住進福建省婦幼保健院兒科重癥監(jiān)護病房?；純旱呐R床癥狀和臨床診斷見表1，這幾例感染人冠狀病毒的患兒都在春季或冬季發(fā)病。

2.3其它病毒混合感染情況對8例HCoV陽性標本進行了4種常見呼吸道病毒—呼吸道合胞病毒(RSV)、流感病毒(包括甲1、甲3和乙型)、人副流感病毒(HPIV)1-4型和呼吸道腺病毒(R-ADV)以及其他幾種呼吸道新病毒的檢測，發(fā)現(xiàn)兩例HKU1與HPIV-3混合感染。這幾種呼吸道新病毒包括人偏肺病毒(hMPV)[8]、人博卡病毒(HBoV)[9]、WU多瘤病毒(WUPyV)[10]和KI多瘤病毒(KIPyV)[11]。

注：◆ 表示福州株圖1 福州8株HCoV pol基因系統(tǒng)進化分析Note:◆ indicates tbe strains of FuzhouFig.1 Phylogenetic analysis of pol genes of HCoV Fuzhou strains

2.4序列比對和系統(tǒng)進化分析檢測出的8株HCoV的pol基因片段的Blast比對結(jié)果見表2。序列比對表明福州的2株HCoV-HKU1pol基因片段堿基序列有4處不同。用于確認HCoV-HKU1的950 bp的核酸片段位于28 232～29 181 nt，含有部分M基因和N基因，福州2株HCoV-HKU1的950 bp的核酸片段序列完全相同。4株人冠狀病毒HCoV-OC43福州株FZ13、FZ15、FZ20和FZ134的核苷酸序列之間各有2、3個堿基不同。

將在福州地區(qū)檢測出的8株HCoVpol基因片段核苷酸序列進行比對分析。多序列比對由DNAStar完成，系統(tǒng)進化分析采用MEGA6.06軟件。圖1顯示所檢測出的8株HCoV與GenBank中4種HCoV代表株的親緣關(guān)系，可見總共聚成了4簇。其中2株FZ90和FZ96與HCoV-HKU1的3種基因型聚成一簇，可見這2株與HKU1基因型A關(guān)系最近；4株FZ13、FZ15、FZ20和FZ134與HCoV-OC43中國上海株、中國北京株、巴黎株、馬來西亞株和美國株聚成一簇；1株FZ68與肯尼亞、中國北京和HCoV- NL63的標準株(GenBank序列號：NC_005831)等聚成一簇；還有1株FZ74與HCoV-229E美國SC1212株(GenBank序列號：KY369911)等聚成一簇。從圖中可以看出HCoV-HKU1和HCoV-OC43的親緣關(guān)系相對較近，HCoV- NL63和HCoV-229E的親緣關(guān)系相對較近。

3 討論

最近幾年，又出現(xiàn)一種新型HCoV—中東呼吸綜合癥(Middle East respiratory syndrome, MERS)病毒[12]，嚴重、急性的冠狀病毒引起的呼吸道感染再次受到高度關(guān)注。HCoV-NL63繼2004年首次被報道后，相繼有十幾個國家和地區(qū)[13-15]隨后也進行了報道。在不同國家和地區(qū)HCoV-NL63感染的檢出率大約在1.2%～9.3%之間。中國香港、臺灣、北京、重慶、深圳等地都有過報道，各地區(qū)HCoV-NL63活動高峰也不太相同，一般認為流行季節(jié)在冬春季，但香港報道在春夏有一高峰期，重慶則在夏秋季，福州檢出的這例發(fā)生在春季，檢出率偏低。HCoV-HKU1繼2005年首次被報道后，也有不少國家和地區(qū)的學者[15-17]對其進行了檢測和研究，不同國家、地區(qū)HCoV- HKU1感染的檢出率差別較大，大約在0.6%～14.9%之間，此病毒在4個季節(jié)都可出現(xiàn)感染，有研究認為高峰期在秋冬季，北京則有報道這兩種新型HCoV感染的高峰大致相同，都在夏季[16]，福州檢出的這2例則發(fā)生在春季，與長沙的報道相同[17]。

根據(jù)病毒基因組的序列，科學家將HCoV-229E和HCoV-NL63歸類為α類冠狀病毒，將HCoV-OC43和HCoV-HKU1歸類為β類冠狀病毒[18]。研究以上4種非SARS的HCoVs的流行和臨床相關(guān)性以評估HCoV感染的臨床意義是非常必要的。美國學者[19]曾對一年收集到的1 000多份下呼吸道標本用RT-PCR方法進行HCoVs的檢測，檢出率約為5.0%，其中HCoV-NL63、HCoV-HKU1、HCoV-OC43和HCoV-229E感染的檢出率分別約為2.2%、0.12%、2.0%和0.65%。HCoVs的感染主要發(fā)生在冬季，41%有下呼吸道感染(LRTI)，26%有嘔吐和腹瀉，8%有腦膜腦炎。因此認為HCoVs除了與兒童上下呼吸道感染有關(guān)外，還可能與胃腸道疾病和神經(jīng)系統(tǒng)疾病有關(guān)。日本學者曾經(jīng)對4種HCoV進行了長達4年的研究[20]，HCoVs感染可能的檢出率約為7.6%，其中HCoV- NL63、HCoV-HKU1、HCoV-OC43和HCoV-229E感染的檢出率分別約為3.1%、1.9%、1.8%和0.9%，都高于中國福州的檢出率，原因有待進一步探討。雖然福州的檢出率偏低，但本研究表明這4種HCoV都是福州兒童下呼吸道感染可能的病原，其中兩例HCoV-HKU1都發(fā)現(xiàn)與HPIV-3混合感染，是否混合感染引起臨床癥狀加重，值得繼續(xù)深入系統(tǒng)的研究。

由于RNA聚合酶較低的忠實性，RNA病毒在復制過程中基因序列較易發(fā)生點突變。冠狀病毒在基因組復制過程中存在一個復制中間體導致在復制過程中發(fā)生重組的機會增大，再加上冠狀病毒是目前已知RNA病毒中基因組最大的病毒，復制的不穩(wěn)定性隨之增加，因此冠狀病毒有著相當高的遺傳多樣性。本研究表明福州的2株HCoV-HKU1與北京報道的57株都屬于基因型A[16]，有報道長沙的12株屬于基因型B[17]。福州地區(qū)是否有基因型B的存在也值得進一步的檢測與研究。

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2017-04-28)

(本文編輯：呂新軍)

DetectionoffourhumancoronavirusesinrespiratoryinfectionsinchildreninFuzhou,China

XiuWenqiong,ZhengKuicheng,WuBingshan,HuangMeng,XieJianfeng,KangYulan,LiuGuanghua

FujianCenterforDiseaseControlandPreventionFujianKeyLaborotaryofZoonoses,Fuzhou350001,China(XiuWQ,ZhengKC,WuBS,HuangM,XieJF);FujianProvincialMaternityandChildHealthHospital,FujianMedicalUniversity,Fuzhou350001,China(KangYL,LiuGH)

XiuWenqiong，Email: 401864347@qq.com;LiuGuanghua,Email:liugh1962815@hotmail.com

ObjectiveIn this study, we tested for the presence of four human coronaviruses (HCoVs) in children with respiratory tract disease in Fuzhou, Fujian, China.MethodsNasopharyngeal aspirates were collected from children with respiratory tract disease from Nov, 2007 to Jan, 2015. A total of 266 clinical samples were tested for HCoVs using reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). The positive products were sequenced and compared with those in GenBank by BLAST. The positive samples were then tested for HCoV-HKU1 and HCoV-NL63 using RT-PCR method . We compared the 440 bppolgene sequence of the 8 HCoV isolates in Fuzhou, China to other HCoV isolates documented in the GenBank database by using MEGA software version 6.06 and the neighbor-joining method .ResultsHCoVs were detected in 8 patients (3.0%) out of the 266 children. Two of 266 (0.38%) were positive for HCoV-HKU1; 1 of 266(0.38%)were positive for HCoV-NL63; 1 of 266 (0.38%) were positive for HCoV-229E; 4 of 266 (1.5%)were positive for HCoV-OC43. All of children who were positive for HCoV had respiratory illness. Two HCoV-HKU1 were found to co-infect with human parainfluenza virus type 3 (HPIV-3). The 8 HCoV strains in our study fell into four clusters. Two strains of HCoV-HKU1 were genotype A.ConclusionsHCoV infections were probably associated with upper and lower respiratory illness in children. Additional studies are needed to investigate the potential roles of these HCoVs in diseases.

Respiratory tract infections; Human coronavirus; HCoV-HKU1; HCoV-NL63; HCoV-OC43; HCoV-229E

修文瓊，Email: 401864347@qq.com；劉光華，Email:liugh1962815@hotmail.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2017.05.011

呼吸道感染；人冠狀病毒；HCoV-HKU1；HCoV-NL63；HCoV-OC43；HCoV-229E

福建省自然科學基金 (2014J01279)

FundprogramsNatural Science Foundation of Fujian Provinces(2014J01279)