1例嬰兒感染H9N2亞型禽流感病毒特征分析

黃一偉 陳柏塘 張恒嬌 謝群 李文超 李成華 張斯鈺 黃超洋 鄧志紅 張紅

410005 長(zhǎng)沙，湖南省疾病預(yù)防控制中心(黃一偉、張恒嬌、李文超、張斯鈺、黃超洋、鄧志紅、張紅)；423000 郴州市疾病預(yù)防控制中心(陳柏塘、謝群、李成華)

1例嬰兒感染H9N2亞型禽流感病毒特征分析

黃一偉 陳柏塘 張恒嬌 謝群 李文超 李成華 張斯鈺 黃超洋 鄧志紅 張紅

410005 長(zhǎng)沙，湖南省疾病預(yù)防控制中心(黃一偉、張恒嬌、李文超、張斯鈺、黃超洋、鄧志紅、張紅)；423000 郴州市疾病預(yù)防控制中心(陳柏塘、謝群、李成華)

目的對(duì)1株從11月齡感染人禽流感的嬰兒中分離的H9N2亞型禽流感病毒進(jìn)行全基因組特征分析，推測(cè)可能的感染來(lái)源。方法從流感哨點(diǎn)監(jiān)測(cè)醫(yī)院采集流感樣病例咽拭子標(biāo)本，采用細(xì)胞分離方法分離流感病毒，對(duì)細(xì)胞分離物采用血凝試驗(yàn)、血凝抑制試驗(yàn)和熒光PCR的方法進(jìn)行流感病毒的型別和亞型的鑒定，并對(duì)分離的病毒進(jìn)行全基因組序列測(cè)序，對(duì)測(cè)定的核酸序列和推導(dǎo)的氨基酸序列采用生物信息學(xué)軟件構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行比對(duì)分析。結(jié)果從1例嬰兒流感樣病例采集的標(biāo)本中分離到1株季節(jié)性流感無(wú)法分型的流感病毒，經(jīng)過(guò)熒光PCR方法分型，確認(rèn)為H9N2亞型禽流感病毒，病例確診為人感染H9N2禽流感病例。流行病學(xué)調(diào)查顯示，病例無(wú)明確的禽類接觸史和暴露史。病毒經(jīng)全基因組測(cè)序得到8條基因序列，Blast分析表明片段均為禽源，與湖南省活禽市場(chǎng)外環(huán)境中分離的H9N2亞型禽流病毒的核苷酸同源性為97.5%～99.8%，未發(fā)現(xiàn)與人流感病毒發(fā)生基因片段重配。病毒屬于基因型G57，推導(dǎo)的氨基酸序列分子特征分析顯示病毒為典型的禽類中H9N2亞型禽流感病毒特征。結(jié)論雖然病例無(wú)明確的禽類接觸史和暴露史，但分子溯源表明可能的感染來(lái)源仍為禽類。

禽流感是由甲型流感病毒引起的一種禽類傳染性疾病，引起該疾病病毒的某些亞型如H5、H7和H9亞型可偶爾突破宿主屏障感染人類。其中H9N2亞型病毒在活禽批發(fā)和零售市場(chǎng)中廣泛存在，是一種低致病性禽流感病毒，H9N2亞型禽流感病毒在新型禽流感病毒如H7N9和H10N8亞型的病毒產(chǎn)生過(guò)程中扮演著基因骨架的角色[1-2]。因此，H9N2亞型禽流感逐漸受到越來(lái)越多的關(guān)注。

最早的人感染H9N2禽流感實(shí)驗(yàn)室確診病例出現(xiàn)在1998年，郭元吉等[3]從廣東省的5名流感樣病例采集的標(biāo)本中分離出5株病毒。隨后在中國(guó)香港、孟加拉等地出現(xiàn)了一些零星病例的報(bào)道[4-6]。一些血清學(xué)研究表明人感染H9N2禽流感病毒的情況可能比報(bào)道的更多[7-8]。由于H9N2病毒突破宿主屏障感染人只導(dǎo)致輕微的臨床癥狀，因此存在一定的隱蔽性。2013年湖南省報(bào)告了全省首例人感染H9N2禽流感病例[9]。本研究是2015年湖南省發(fā)現(xiàn)的另外一例感染H9N2亞型的病例，病例具有特殊性，為小于1歲的嬰兒，為了進(jìn)一步追溯其可能的感染來(lái)源，本研究對(duì)從病例中分離的病毒進(jìn)行全基因組序列測(cè)定和分析。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本采集郴州市第一人民醫(yī)院作為流感監(jiān)測(cè)哨點(diǎn)醫(yī)院，根據(jù)原衛(wèi)生部辦公廳印發(fā)的《全國(guó)流感監(jiān)測(cè)方案(2010年版)》[10]要求，每周采集流感樣病例咽拭子標(biāo)本送郴州市疾病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行流感病毒分離試驗(yàn)。標(biāo)本嚴(yán)格按照中國(guó)疾病預(yù)防控制中心《全國(guó)流感監(jiān)測(cè)技術(shù)指南》[11]的要求采集和檢測(cè)，咽拭子標(biāo)本采集后，放入含采樣液3 ml采樣管中，4 ℃ 48 h內(nèi)運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室。標(biāo)本采集獲得患者家屬知情同意。本研究通過(guò)湖南省疾病預(yù)防控制中心倫理委員會(huì)審查同意。

1.2病毒分離和鑒定實(shí)驗(yàn)室收到標(biāo)本后立即進(jìn)行檢測(cè)或保存于-70 ℃直至檢測(cè)。經(jīng)鑒定流感病毒陽(yáng)性且使用紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)方法無(wú)法鑒定到季節(jié)性流感亞型的細(xì)胞上清液使用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法再進(jìn)行其他流感和禽流感病毒亞型的鑒定，具體步驟：取細(xì)胞培養(yǎng)上清液采用QIAamp Viral RNA Mini Kit試劑盒(QIAgen，Germany)提取核酸，核酸使用熒光RT-PCR法檢測(cè)A和B型，以及H1、H3、H5、H7、H9和N2亞型。檢測(cè)試劑為SuperScript III Platinum One-Step qRT-PCR試劑盒(Invitrogen，USA)，試驗(yàn)步驟和反應(yīng)條件參考試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.3基因組測(cè)序經(jīng)分離鑒定出的H9N2亞型禽流感毒株進(jìn)行全基因組測(cè)序。毒株核酸提取和擴(kuò)增采用QIAamp Viral RNA Mini Kit(QIAgen，Germany)與One step RT-PCR Kit(QIAgen，Germany)試劑盒，測(cè)序在AB 3730測(cè)序儀上完成，引物序列見(jiàn)參考文獻(xiàn)[12]。

1.4數(shù)據(jù)分析序列比對(duì)采用Muscle軟件，默認(rèn)參數(shù)。進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建使用MEGA 6.06軟件，采用最大似然法，采用Tamura-Nei模型，Bootstrap為1 000，其他為默認(rèn)參數(shù)。輔助進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建和氨基酸位點(diǎn)比對(duì)的其他毒株序列從GenBank上下載。用于氨基酸位點(diǎn)比對(duì)的H9N2病毒為從湖南省活禽市場(chǎng)外環(huán)境標(biāo)本中分離的毒株[13]，包括：A/Envir-onment/Hunan/18556/2014、A/Environment/Hunan/27408/2014、A/Environment/Hunan/27420/2014、A/Environment/Hunan/28034/2014、A/Environment/Hunan/18355/2014、A/Environment/Hunan/18498/2014、A/Environment/Hunan/21403/2014、A/Environment/Hunan/18489/2014、A/Environment/Hunan/18370/2014、A/Environment/Hunan/25998/2014和A/Environment/Hunan/28028/2014。

2 結(jié)果

表1 分離的H9N2亞型禽流感病毒與環(huán)境中病毒的蛋白質(zhì)關(guān)鍵位點(diǎn)比較

圖1 1株從嬰兒中分離的H9N2禽流感病毒HA、NA、PB2和PB1基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.1 Phylogenetic analysis of the HA, NA, PB2 and PB1 gene segments of the avian influenza H9N2 viruses isolated from an infant

2.1病例患兒，女，11個(gè)月齡，于2015年10月27日起發(fā)熱，體溫39.2 ℃；于28日在郴州市第一人民醫(yī)院兒童醫(yī)院就診，當(dāng)日除發(fā)熱咽部紅腫外還出現(xiàn)腹瀉癥狀。血常規(guī)檢查結(jié)果：白細(xì)胞7.9×109/L，中性粒細(xì)胞4.72×109/L，淋巴細(xì)胞2.18×109/L，單核細(xì)胞0.90×109/L，單核細(xì)胞比例11.8%，C反應(yīng)蛋白12.88 mg/L。同時(shí)，作為流感樣病例采集患兒的咽拭子標(biāo)本?；純后w溫28日晚恢復(fù)正常，29日起腹瀉癥狀逐漸減輕，11月1日痊愈。流行病學(xué)調(diào)查顯示，病例發(fā)病前10 d內(nèi)未到過(guò)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)、未接觸過(guò)家禽和鳥(niǎo)類、無(wú)明確的禽類接觸史和暴露史。

圖2 1株從嬰兒中分離的H9N2禽流感病毒PA、NP、M和NS基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.2 Phylogenetic analysis of the PA, NP, M and NS gene segments of the avian influenza H9N2 viruses isolated from an infant

2.2病毒分離和基因序列分析病例咽拭子經(jīng)過(guò)2代MDCK細(xì)胞分離培養(yǎng)鑒定出流感病毒，經(jīng)季節(jié)性流感血清鑒定試劑盒鑒定季節(jié)性流感A型H1亞型、H3亞型，B型Yamagata系和Victoria系均為陰性。故采用熒光PCR方法進(jìn)行分型，結(jié)果A型、H9亞型和N2亞型為陽(yáng)性，確認(rèn)為H9N2亞型禽流感病毒，病毒命名為A/Hunanchenzhou/45789/2015。病毒經(jīng)過(guò)全基因組測(cè)序，8條序列通過(guò)美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心網(wǎng)站Blast分析表明，片段與禽類/環(huán)境中分離的H9N2亞型禽流感病毒99%同源。8條基因片段均是禽源，與湖南省活禽市場(chǎng)環(huán)境中分離的H9N2病毒同源性較高，與湖南活禽市場(chǎng)外環(huán)境中分離的H9N2病毒A/environment/Hunan/28028/2014同源性為97.5%～99.8%，未發(fā)現(xiàn)與人流感病毒發(fā)生基因片段重配。進(jìn)一步構(gòu)建基因進(jìn)化樹(shù)分析顯示(圖1A和1B)，HA和NA基因?qū)儆赮280分支，8條基因片段共同分析，在進(jìn)化樹(shù)中與A/chicken/Zhejiang/HJ/2007在同一分支中，表明病毒為基因型G57(圖1和圖2)[14]。

2.3氨基酸位點(diǎn)分析對(duì)病毒核苷酸推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行分子特征分析，與環(huán)境中分離株相比，本次人中分離的病毒在HA分子受體結(jié)合位點(diǎn)158位、190位以及HA分子切割位點(diǎn)上不同，見(jiàn)表1。HA分子連接肽位點(diǎn)為R-S-S-R結(jié)構(gòu)。HA分子的受體結(jié)合位點(diǎn)，226位為氨基酸L，NA分子有63-65位點(diǎn)的缺失，未發(fā)現(xiàn)奧司他韋耐藥性位點(diǎn)。M2分子115位為N的位點(diǎn)顯示病毒表現(xiàn)為對(duì)金剛烷胺類藥物的抗性。

3 討論

2013年，湖南省通過(guò)流感哨點(diǎn)監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)了全省首例H9N2病例，2015年，通過(guò)同樣途徑再次發(fā)現(xiàn)一例H9N2病例。病例的臨床表現(xiàn)為典型上呼吸道癥狀，對(duì)從病例中分離的H9N2亞型禽流感病毒進(jìn)行全基因組測(cè)序，分析顯示，病毒全部8條基因片段與當(dāng)前活禽市場(chǎng)中分離的禽流感病毒序列高度同源。與2013年發(fā)現(xiàn)的病例相比，本研究病例具有以下三個(gè)特點(diǎn)：一是患者年齡小，為不滿1歲嬰兒，目前是湖南省確診年齡最小的人禽流感病例。二是流行病學(xué)調(diào)查未發(fā)現(xiàn)可能的感染來(lái)源。病例年齡較小，活動(dòng)范圍和能力有限，并無(wú)活禽市場(chǎng)暴露史。三是基因組序列分析顯示與2013年病例的病毒序列以及環(huán)境中分離的H9N2病毒高度同源，未發(fā)生基因重配，病毒序列和推導(dǎo)的氨基酸序列未出現(xiàn)明顯的變化。

本研究報(bào)道的H9N2人禽流感病例為不滿1歲嬰兒，2013年湖南省發(fā)現(xiàn)的首例病例為7歲兒童，近期我國(guó)安徽、江西、廣東等多省報(bào)道的人感染H9N2禽流感，病例也均為兒童，這與H5N1和H7N9禽流感在人群年齡分布上存在差異[15-16]。H5N1在中國(guó)大陸地區(qū)主要感染青壯年，H7N9則主要感染中老年人。但由于目前國(guó)內(nèi)對(duì)于H9N2在兒童中感染情況缺乏全面深入的研究報(bào)道，因此現(xiàn)有研究顯示的H9N2易感染兒童這一特點(diǎn)，究竟是否確實(shí)是兒童對(duì)H9N2病毒更為易感，或者僅僅是因?yàn)槌扇烁腥綡9N2后癥狀輕微導(dǎo)致就診率低，還值得進(jìn)一步研究。分離到的病毒分子特征分析顯示HA分子連接肽位點(diǎn)為陸地禽類病毒特征，HA分子的受體結(jié)合位點(diǎn)表現(xiàn)出病毒對(duì)于人類受體親和性的特征[17]，病毒表現(xiàn)為對(duì)金剛烷胺類藥物的抗性，但未發(fā)現(xiàn)奧司他韋耐藥性位點(diǎn)。病毒為典型的禽類中H9N2亞型禽流感病毒特征。

雖然前述研究表明從患者體內(nèi)分離的病毒與活禽市場(chǎng)中病毒高度同源，但流行病學(xué)調(diào)查并未發(fā)現(xiàn)直接的感染途徑。盡管一般認(rèn)為活禽市場(chǎng)禽流感病毒污染嚴(yán)重[18]，活禽市場(chǎng)暴露史是人感染禽流感的風(fēng)險(xiǎn)因素之一，但仍有很大一部分病例未發(fā)現(xiàn)暴露源。本研究報(bào)道的病例為嬰兒，活動(dòng)范圍受限，沒(méi)有明顯的活禽市場(chǎng)暴露史。雖然分子溯源顯示其可能的感染來(lái)源仍為禽類，但人感染禽流感的途徑仍存在很多未知因素，這也需要我們繼續(xù)深入探索。

本研究病例拓寬了我們對(duì)人禽流感的認(rèn)知領(lǐng)域，禽流感病毒以不經(jīng)意的方式感染人類，如果患者僅表現(xiàn)為輕癥，很可能并不會(huì)前去醫(yī)院就診，受限于目前的流感監(jiān)測(cè)體系，感染病例很難全部被實(shí)驗(yàn)室診斷。而禽流感病毒一旦與人流感病毒發(fā)生重配，就可能產(chǎn)生新型的流感病毒，存在引發(fā)流感大流行的未知風(fēng)險(xiǎn)。不斷出現(xiàn)的人禽流感病例，提示人感染禽流感病毒的風(fēng)險(xiǎn)持續(xù)存在。只有不斷加強(qiáng)監(jiān)測(cè)，及時(shí)發(fā)現(xiàn)病例，及早對(duì)傳染病進(jìn)行控制，防止二代病例的發(fā)生，同時(shí)通過(guò)對(duì)病例中分離的病毒進(jìn)行基因分析，發(fā)現(xiàn)可能的變異位點(diǎn)，才能為流感大流行預(yù)測(cè)預(yù)警提供科學(xué)依據(jù)。

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2017-07-04)

(本文編輯：唐瀏英)

CharacteristicsofanavianinfluenzaA(H9N2)virusisolatedfromaninfant

HuangYiwei,ChenBaitang,ZhangHengjiao,XieQun,LiWenchao,LiChenhua,ZhangSiyu,HuangChaoyang,DengZhihong,ZhangHong

HunanProvincialCenterforDiseaseControlandPrevention,Changsha410005,China(HuangYW,ZhangHJ,LiWC,ZhangSiyu,HuangCY,DengZH,ZhangH);ChenzhouCenterforDiseaseControlandPrevention,Chenzhou423000,China(ChenBT,XieQ,LiCH)HuangYiweiandChenBaitangcontributedequallytothearticle

ZhangHong,Email: 931525821@qq.com

ObjectiveTo analyze the genome characteristics of an avian influenza A (H9N2) virus isolated from an 11-month-old infant, and to look for possible sources of infection.MethodsThroat swabs were collected from an infant with influenza-like illness in influenza sentinel surveillance hospitals and isolated for influenza viruses using cells. The isolates were identified for influenza virus types and subtypes by the method of hemagglutination assay, hemagglutination inhibition assay and fluorescence PCR. Whole genome sequencing of the isolated virus was carried out. The genome nucleic acid sequences and the deduced amino acid sequences were analyzed by comparing the phylogenetic trees which were constructed by bioinformatics software.ResultsA seasonal un-typed influenza virus was isolated from the infant with influenza like illness. With fluorescent PCR method , it was identified as H9N2 subtype of avian influenza virus and the case was confirmed as a human infected with an avian influenza A(H9N2) virus. Epidemiological studies revealed that the case had no clear history of poultry contact and exposure. Blast analysis shows that eight segments of the viral genome are avian origin, and 97.5%-99.8% homology with that of viruses isolated from the live-poultry markets. The virus belongs to G57 genotype, deduced amino acid sequence analysis shows that the virus has typical low pathogenic avian influenza characteristics.ConclusionsAlthough the case does not have a clear history of contact or exposure to poultry, molecular traceability suggests that possible sources of infection may be still from poultry.

Avian Influenza; Infant; H9N2; Nucleotide sequence

黃一偉與陳柏塘對(duì)本文有同等貢獻(xiàn)

張紅，Email: 931525821@qq.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2017.05.009

禽流感；嬰兒；H9N2；核苷酸序列

湖南省科技廳資助一般項(xiàng)目(2014SK3246)；湖南省衛(wèi)生廳重點(diǎn)課題(A2011-006)

FundprogramsHunan Provincial Science and Technology Department Research Project (2014SK3246), Hunan Provincial Health and Family Planning Commission Key Research Project (A2011-006).