庫蠓中蓋塔病毒的分離及其分子鑒定

董佩 李楠 何于雯 徐天剛 殷建忠 王靜林

650500 昆明醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院(董佩、殷建忠)；650224 昆明，云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院 云南省熱帶亞熱帶動物病毒重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(李楠、何于雯、王靜林)；266032 青島，中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心 (徐天剛)

庫蠓中蓋塔病毒的分離及其分子鑒定

董佩 李楠 何于雯 徐天剛 殷建忠 王靜林

650500 昆明醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院(董佩、殷建忠)；650224 昆明，云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院 云南省熱帶亞熱帶動物病毒重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(李楠、何于雯、王靜林)；266032 青島，中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心 (徐天剛)

目的探討1株(SZC30)云南省庫蠓分離病毒的分類及分子特征。方法2013年7月采用燈誘的方法在云南省曲靖市師宗縣五龍鄉(xiāng)采集庫蠓，采用BHK-21和C6/36細(xì)胞進(jìn)行病毒分離，陽性分離物腦內(nèi)接種1日齡乳鼠；分別用甲病毒屬和蓋塔病毒特異性引物對陽性分離物進(jìn)行RT-P C R擴(kuò)增、測序，用Clustal X1.83、BioEdit、DNAStar、 Mega5.1等生物信息學(xué)軟件進(jìn)行序列分析。結(jié)果采集到庫蠓共3 500只，庫蠓分為41批進(jìn)行病毒分離，其中分離到一株病毒(SZC30)對BHK-21與C6/36細(xì)胞產(chǎn)生明顯病變；分別用甲病毒屬和蓋塔病毒NS1特異性引物進(jìn)行RT-P C R擴(kuò)增結(jié)果為陽性；NS1基因序列分析結(jié)果顯示SZC30株病毒與YN0540及SC1210兩株中國分離的蓋塔病毒位于同一進(jìn)化分支內(nèi)，核苷酸同源性在97%～100 %之間，氨基酸同源性在97%～100%之間。結(jié)論從云南省采集庫蠓中分離到的SZC30株病毒為蓋塔病毒。

蓋塔病毒(Getah virus, GETV)屬于披膜病毒科甲病毒屬，為單股正鏈RNA病毒。該病毒感染豬、馬等家畜動物，能引起感染動物出現(xiàn)發(fā)熱、發(fā)疹、浮腫、后肢麻痹、精神不振等癥狀，嚴(yán)重者可致死亡[1]；此外豬妊娠前期感染可導(dǎo)致胚胎死亡、產(chǎn)死胎等[2]，給養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。血清學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示在人和其它多種動物檢測到GETV抗體[3-4]，證明了人和多種動物存在GETV感染[5]。1955年在馬來西亞橡膠園中的雪背庫蚊中首次分離到GETV[6]，隨后在東亞、東南亞、歐洲的東部以及大洋洲北部的蚊蟲也分離到GETV[7-8]。國內(nèi)在1964年海南省采集的蚊蟲中分離到第一株GETV(M1)，隨后在河南、陜西、云南等地采集的蚊蟲標(biāo)本中分離到多株GETV。迄今為止，國內(nèi)外還未見從蚊蟲以外其他媒介標(biāo)本中分離到GETV的報(bào)道。2013年7月本研究在云南省曲靖市師宗縣采集的庫蠓標(biāo)本中分離到1株病毒，并對該株病毒進(jìn)行了分子鑒定，現(xiàn)報(bào)道如下：

1 材料與方法

1.1蚊蟲采集2013年7月在云南省曲靖市師宗縣五龍鄉(xiāng)民房附近的豬圈、牛圈和雞圈采集庫蠓標(biāo)本，在下午19:00至次日早晨7:00采用誘蚊燈(12 V; 300 mA; Wuhan Lucky Star Environmental ProtectionTech Co., Ltd., Hubei, China)捕捉蠓蟲，次日清晨放入-20 ℃冰箱，20 min后取出，根據(jù)蠓蟲形態(tài)學(xué)特征在解剖鏡下進(jìn)行庫蠓鑒定，庫蠓未進(jìn)行具體種類鑒定。每管50～100只分裝，編號登記迅速置于液氮罐中帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.2病毒分離從液氮中取出庫蠓加1 ml細(xì)胞維持液[含2%青、鏈霉素(10 000U/L)雙抗、1%的谷氨酰胺]進(jìn)行研磨，4 ℃、16 000×g離心10 min。取150 μl研磨液上清接種生長至70%～80%的單層C6/36和BHK-21細(xì)胞，分別放入28 ℃和37 ℃恒溫箱中吸附，1 h后棄上清，加1 ml維持液放入恒溫箱繼續(xù)培養(yǎng)。每日觀察細(xì)胞病變(Cytopathic effect, CPE)情況，每代連續(xù)觀察7 d，連續(xù)盲傳3代，有病變者繼續(xù)傳代至出現(xiàn)規(guī)律病變。陽性分離物細(xì)胞培養(yǎng)上清30 μl/只進(jìn)行乳鼠腦內(nèi)接種毒力實(shí)驗(yàn)，觀察記錄乳鼠病變死亡情況。

1.3RNA提取及cDNA合成取陽性分離物200 μl，采用RNAiso Plus(TaKaRa公司，大連寶生物工程有限公司)按照試劑盒說明書進(jìn)行總RNA提取，-80 ℃保存。用Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H-)試劑盒(TaKaRa公司，大連寶生物工程有限公司)按照說明書合成cDNA第一鏈。

1.4PCR擴(kuò)增分別采用甲病毒屬特異性引物M2W(引物序列5′YAG AGC DTT TTC GCA YST RGC HW3′)、cM3W(引物序列5′ACA TRA ANK GNG TNG TRT CRA ANC CDA YCC3′)[9]及GETV NS1基因特異性引物GETV1F(5′CGT TTC CCG CCT TTG AG3′)/GETV1R(5′GTT TGT GTT TCT TTG CGT CCT ACC3′)[10]進(jìn)行PCR擴(kuò)增；PCR擴(kuò)增體系為25 μl，即2 μl cDNA、12.5 μl 2×T5 Super PCR Mix、0.5 μl上下游引物、9.5 μl RNase-free ddH2O，擴(kuò)增條件為94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃30 s，57.2 ℃ 30 s，72 ℃ 75 s，35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增條帶，送昆明碩擎生物公司進(jìn)行測序。

1.5序列分析在GenBank中下載所有GETV NS1基因序列與庫蠓新分離病毒相應(yīng)的序列進(jìn)行比對、核苷酸和氨基酸同源性分析及遺傳進(jìn)化分析。具體分析如下：使用DNAStar 軟件中SeqMan進(jìn)行序列拼接，用Clustal X1.83軟件進(jìn)行病毒基因序列和推測的氨基酸序列的比對,使用DNAStar軟件進(jìn)行核苷酸和氨基酸序列的同源性分析，用Mega5.1軟件繪制基于Neighbor-joining(NJ)方法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，Bootstrap值為1 000。

2 結(jié)果

2.1病毒分離2013年7月在云南省曲靖市師宗縣五龍鄉(xiāng)豬圈、牛圈以及雞圈共采集庫蠓3 500只，庫蠓分41批進(jìn)行病毒分離，其中一株病毒(SZC30)對BHK-21和C6/36細(xì)胞產(chǎn)生明顯的病變，BHK-21細(xì)胞病變時(shí)間為1 d，細(xì)胞病變特點(diǎn)為產(chǎn)生明顯的變圓、腫脹、脫落，C6/36細(xì)胞病變時(shí)間為3 d，細(xì)胞病變特點(diǎn)為出現(xiàn)細(xì)胞圓縮、脫落、碎裂。將病毒腦內(nèi)接種乳鼠，2～3 d出現(xiàn)食欲不振、震顫、抽搐等中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，最后乳鼠死亡。

2.2病毒鑒定采用披膜病毒科甲病毒特異性引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，結(jié)果SZC30在430 bp處擴(kuò)增出特異性條帶，提示該病毒可能為甲病毒。序列測定，獲得430 bp核酸序列，經(jīng)Blast比對SZC30與蓋塔病毒KorS1010株核苷酸同源性最高，為100%，初步鑒定該庫蠓分離病毒為GETV。

表1 SZC30核苷酸與氨基酸序列同源性分析

注：右上方為核苷酸序列同源性， 左下方為氨基酸序列同源性分析

Note：The upper right is nucleotide sequence homology, the lower left is amino acid sequence homology

2.3GETVNS1基因核苷酸和氨基酸序列同源性分析選取中國3株GETV(分別為海南省M1株、四川省SC1210株、云南省YN0540株)、馬來西亞1株(MM2021株)、韓國1株(KorS1010株)及俄羅斯1株(LEIV 16275 Mag株)與庫蠓分離病毒株(SZC30)進(jìn)行核苷酸與氨基酸序列同源性分析(見表1)，SZC30與甲病毒屬GETV同源性最高，和國內(nèi)外其他GETV分離株核苷酸與氨基酸的同源性同為97%～100%。其中與馬來西亞原始株MM2021核苷酸同源性最低為97%，與海南分離株M1氨基酸同源性最低為97%，與韓國分離株KorS1010核苷酸與氨基酸同源性皆達(dá)到100%。

2.4GETVNS1系統(tǒng)進(jìn)化分析下載GenBank中國分離株M1、YN0540、SC1210等11株GETV及1株甲病毒屬基孔肯雅病毒(CHIKV)S27-African prototype的NS1基因序列，與庫蠓分離SZC30株病毒 NS1核苷酸序列一起構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(見圖1)，新分離株SZC30與11株GETV病毒位于同一進(jìn)化分支內(nèi)；進(jìn)一步分析結(jié)果顯示庫蠓分離病毒SZC30株與2005年中國GETV分離株YN0540及2012年中國GETV分離株SC1210位于同一小的進(jìn)化分支內(nèi)，表明它們親緣關(guān)系較近。

注：毒株標(biāo)識從左到右為病毒種類、編號、宿主及基因序列號；▲ 為本研究分離病毒株圖1 庫蠓分離的蓋塔病毒NS1遺傳進(jìn)化分析Note: Markers of virus strains from left to right are species, code, host and gene sequence number; ▲ indicates the virus isolate in this studyFlg. 1 Phylogenctic analysis of NS1 gene of Getah virus irus isolated from Culicoides

3 討論

本次在云南省師宗縣五龍鄉(xiāng)采集的庫蠓中分離到的SZC30病毒能引起B(yǎng)HK21和C6/36細(xì)胞產(chǎn)生明顯的細(xì)胞病變，在BHK-21細(xì)胞上病變較為迅速(接種后1 d)，乳鼠腦內(nèi)接種引起乳鼠發(fā)病死亡，這些特點(diǎn)與甲病毒屬病毒相似[11]；采用甲病毒屬特異引物擴(kuò)增陽性，這些結(jié)果提示該庫蠓分離病毒可能為甲病毒屬病毒。進(jìn)一步采用GETV NS1基因特異引物擴(kuò)增結(jié)果為陽性，序列分析結(jié)果提示庫蠓分離病毒SZC30與國內(nèi)分離的GETV YN0540及SC1210位于同一進(jìn)化分支內(nèi)，核苷酸和氨基酸同源性均高于97%，提示云南庫蠓分離病毒SZC30株為GETV，但庫蠓是否為GETV的一種新的傳播媒介還有待進(jìn)一步研究。

GETV對馬、豬等脊椎動物的影響較大，能夠引起馬發(fā)熱、發(fā)疹以及豬的繁殖障礙，是一種重要的家畜動物傳染病病原體[12]。2005年云南省分離出YN0540和YN0542兩株GETV，近幾年對云南省德宏州、西部邊境等地區(qū)進(jìn)行蟲媒病毒調(diào)查研究，也分離出多株GETV[13-15]，本研究在云南庫蠓中分離到GETV，表明了GETV在云南分布廣泛，為云南省動物疫病防控提供科學(xué)依據(jù)，今后應(yīng)加強(qiáng)云南省GETV傳播媒介種類及相關(guān)疫病的研究。

[1] 韋鵬建, 馮若飛, 馬忠仁. 蓋他病毒研究進(jìn)展[J]. 動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2010, 31(8): 97-100. doi:10.16437/j.cnki.1007-5038.2010.08.015.

[2] Kumanomido T, Wada R, Kanemaru T, et al. Clinical and virological observations on swine experimentally infected with Getah virus[J]. Vet Microbiol, 1988, 16(3):295-301. doi: org/10.1016/0378-1135(88)90033-8.

[3] 蔣廉華, 趙春生, 徐春華, 等. 海南省1株甲屬蟲媒病毒的分離鑒定及其血清抗體調(diào)查[J].中國獸醫(yī)學(xué)報(bào), 1999, 19(6): 549-551. doi: 10.16303/j.cnki.1005-4545.1999.06.009.

[4] Zhai YG, Wang HY, Sun XH, et al. Complete sequence characterization of isolates of Getah virus (genus Alphavirus, family Togaviridae) from China.[J]. J Gen Virol, 2008, 89(Pt 6): 1446-1456. doi: 10.1099/vir.0.83607-0

[5] 李元元, 劉紅, 李曉龍, 等. 蓋塔病毒分子進(jìn)化及其遷徙[J]. 中國人獸共患病學(xué)報(bào), 2017, 33(04):293-299. doi: 10.3969/j.issn.1002-2694.2017.04.001.

[6] 金奇. 醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)[M]. 科學(xué)出版社, 2001:403-420.

[7] Kobayashi D, Isawa H, Ejiri H, et al. Complete genome sequencing and phylogenetic analysis of a Getah virus strain (Genus Alphavirus, Family Togaviridae) isolated from Culex tritaeniorhynchus Mosquitoes in Nagasaki, Japan in 2012[J]. Vector Borne Zoonotic Dis, 2016, 16(12): 769-776. doi: 10.1089/vbz.2016.2017

[8] Brown C M, Timoney P J. Getah virus infection of Indian horses[J]. Trop Anim Health Prod, 1998, 30(4): 241-252. doi: 10.1023/A:1005079229232

[9] 王煥琴, 劉衛(wèi)濱, 楊冬榮, 等. 河北省蟲媒病毒分離鑒定[J]. 中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志, 2006, 20(1):52-55. doi: 10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2006.01.015

[10] 張雨, 司炳銀, 常國輝, 等. WJBC株蓋塔病毒基因組序列測定及與其他甲病毒的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系[J]. 軍事醫(yī)學(xué), 2011, 12: 892-895. doi: 10.3969/j.issn.1674-9960.2011.12.004

[11] 王靜林, 張海林, 孫肖紅, 等. 首次從云南蚊蟲分離到辛德畢斯病毒及其鑒定[J]. 中國人獸共患病學(xué)報(bào), 2008, 24(1):1-4. doi: 10.3969/j.issn.1002-2694.2008.01.001.

[12] 陸瑩梅, 魏建超, 夏鵬, 等. 蓋他病毒E2蛋白的表達(dá)純化以及RT-PCR檢測方法的初步建立[D]. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué), 2015, 23(2):15-20. doi: 10.3969/j.issn.1674-6422.2015.02.003.

[13] 馮云, 張海林, 付士紅, 等. 云南省德宏州2007年和2010年蚊蟲及蚊媒病毒調(diào)查[J]. 中華流行病學(xué)雜志, 2014, 35(5): 528-532. doi: 10.3760/cma.j.issn.0254-6450.2014.05.013.

[14] 馮云, 付士紅, 楊衛(wèi)紅, 等. 云南省西部邊境新分離蚊媒病毒分子生物學(xué)特征分析[J]. 國際病毒學(xué)雜志, 2014, 21(5): 193-198. doi: 10.3760/cma.j.issn.1673-4092.2014.05.001.

[15] 趙秋敏, 郭曉芳, 左曙青, 等. 云南省蚊媒病毒分離物的初步鑒定[J]. 寄生蟲與醫(yī)學(xué)昆蟲學(xué)報(bào), 2015, 22(1):12-17. doi: 10.3969/j.issn.1005-0507.2015.01.003.

2017-06-09)

(本文編輯：呂新軍)

IsolationandidentificationofGetahvirusfromCulicoidesinYunnan

DongPei,LiNan,HeYuwen,XuTiangang,YinJianzhong,WangJinglin

SchoolofPublicHealth,KunmingMedicalUniversity,Kunming650500,China(DongP,YinJZ);YunnanKeyLaboratoryofTropicalandSubtropicalSciencesofYunnanAnimalScienceandVeterinaryInstitute,Kunming650224,China(LiN,HeYW,WangJL);ChinaAnimalHealthandEpidemiologyCenter,Qingdao266032,China(XuTG)

WangJinglin,Email:wangjl107@163.com;YinJianzhong,Email:yinjianzhong2005@sina.com

ObjectiveTo discuss the taxonomy and molecular characteristics of one virus strain (SZC30) isolated fromCulicoidesin Yunnan.MethodsCulicoideswere collected with light trap method in the Wulong Village of Shizong County of Yunnan Province in July, 2013. BHK-21 and C6/36 cells were used for virus isolation. The positive isolates were inoculated into brain of one-day suckling mice. Alphavirus and Getah virus specific primers were used to amplify the genome of the virus isolation by RT-PCR. The products of RT-PCR were sequenced. Clustal X1.83, DNAStar, Mega5.1 were used for bioinformatics analysis.ResultsTotally 3 500 culicoides were collected and divided into 41 batches for virus isolation. One isolate (SZC30) produced cytopathic effect (CPE) on BHK-21 and C6/36 cells; the result of RT-PCR with Alphavirus and Getah virus NS1 specific primer were positive; the sequence analysis of NS1 gene suggested that SZC30 and two Getah virus strains (YN0540,SC1210) from China were in the same evolutionary branching, the nucleotide homology were 97%-100%, and the amino acid was 97%-100%.ConclusionsSZC30 isolated in Yunnan province was identified as Getah virus.

Getah virus;Culicoides; Isolation; Identification

王靜林，Email: wangjl107@163.com；殷建忠，Email: yinjianzhong2005@sina.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2017.05.006

蓋塔病毒；庫蠓；分離；鑒定

國家自然科學(xué)基金(31460669)；云南省科技廳青年基金(2014FD075)；國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(2016YFD0500303、2017YFF0210200)

FundprogramsNational Natural Science Foundation(31460669); Yunnan Provincial Science and Technology Department Youth Foundation(2014FD075); National Key Research and Development Projects(2016YFD0500300, 2017YFF0210200)