IL-6基因單核苷酸多態(tài)性與中國(guó)漢族人群乙型肝炎易感性的相關(guān)性研究

朱秀云 汪文斐 吳偉剛 李紅春 劉威龍 張明霞 劉磊

518112 深圳市第三人民醫(yī)院 廣東省新發(fā)傳染病診治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(朱秀云、汪文斐、吳偉剛、李紅春、劉威龍、張明霞、劉磊)

IL-6基因單核苷酸多態(tài)性與中國(guó)漢族人群乙型肝炎易感性的相關(guān)性研究

朱秀云 汪文斐 吳偉剛 李紅春 劉威龍 張明霞 劉磊

518112 深圳市第三人民醫(yī)院 廣東省新發(fā)傳染病診治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(朱秀云、汪文斐、吳偉剛、李紅春、劉威龍、張明霞、劉磊)

目的白細(xì)胞介素-6(IL-6)在慢性病毒性肝炎發(fā)病機(jī)制和相關(guān)的肝臟疾病中有重要的作用，本文擬通過大樣本病例-對(duì)照研究以及臨床數(shù)據(jù)分析探討IL-6單核苷酸多態(tài)性與HBV感染易感性的相關(guān)性，從而達(dá)到能夠通過檢測(cè)機(jī)體IL-6基因的表達(dá)的水平來(lái)預(yù)防和治療HBV感染的目的。方法選取深圳地區(qū)漢族HBV病患者共計(jì)848例，對(duì)照組894例，抽提基因組DNA，運(yùn)用TaqMan探針的技術(shù)對(duì)上述標(biāo)本的rs1 800 796位點(diǎn)進(jìn)行基因分型。結(jié)果rs1 800 796位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性與HBV感染的易感性相關(guān)P=0.0003，OR=1.43，兩者之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論IL-6rs1 800 796位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性與漢族人群HBV感染的易感性相關(guān)。

乙型病毒性肝炎是由乙肝病毒(Hepatitis B virus HBV)引起的、以肝臟炎性病變?yōu)橹?，并可引起多器官損害的一種疾病[1-2]。近年來(lái)的研究表明宿主基因多態(tài)性與乙肝的易感性顯著相關(guān)[3-4]。乙肝易感基因的篩選和確定，不僅是預(yù)測(cè)診斷發(fā)生乙肝高危人群和制定相應(yīng)預(yù)防決策的依據(jù)，同時(shí)也是乙肝靶向基因和藥物治療的基礎(chǔ)。白細(xì)胞介素6(IL-6)是一種重要的多肽類細(xì)胞因子，具有參與調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、參與炎癥反應(yīng)等多種功能[5-6]。

本研究利用TaqMan探針技術(shù)對(duì)IL-6基因啟動(dòng)子區(qū)域翻譯起始位點(diǎn)上游-572位點(diǎn)rs1 800 796位點(diǎn)進(jìn)行基因分型，通過實(shí)驗(yàn)組HBV、HCV和HIV患者與健康對(duì)照組IL-6rs1 800 796位點(diǎn)的基因型分布分析，發(fā)現(xiàn)IL-6中的rs1 800 796位點(diǎn)與HBV的易感性相關(guān)。然后進(jìn)一步擴(kuò)大樣本通過實(shí)驗(yàn)組與健康對(duì)照組的比較，來(lái)證實(shí)rs1 800 796位點(diǎn)與HBV的相關(guān)性。最后通過比較健康對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組HBV患者血漿及細(xì)胞中IL-6基因表達(dá)的水平，進(jìn)一步證實(shí)IL-6基因ra1 800 796位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與HBV感染易感性的相關(guān)性。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象本研究所用血液標(biāo)本均取自深圳市第三人民醫(yī)院。根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)的樣本數(shù)估算，我們以符合統(tǒng)計(jì)學(xué)要求的樣本數(shù)量進(jìn)行基因多態(tài)性分析，擬入組HBV患者和健康對(duì)照兩個(gè)組別，選取了深圳地區(qū)漢族HBV病患者共計(jì)848例，所有病例均根據(jù)病史、臨床表現(xiàn)確診為HBV；對(duì)照組為健康體檢和義務(wù)獻(xiàn)血者894例，無(wú)HBV,HCV,HIV病史。人血液樣本200 μl 提取全基因組DNA，通過紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度均≥50 ng/μl，NanodropDNA測(cè)定儀測(cè)定DNA純度(OD260/280)。所有研究對(duì)象均簽署知情同意書，經(jīng)深圳市第三人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審查通過。

表1 實(shí)驗(yàn)組IL-6rs1 800 796位點(diǎn)多態(tài)性與HBV,HCV,HIV易感性之間的關(guān)系

1.2研究方法

1.2.1 樣本收集:用肝素鋰抗凝管收集研究對(duì)象靜脈血2～3 ml，200 μl全血用于提取全基因組DNA，通過紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度均≥50 ng/μl，NanodropDNA測(cè)定儀測(cè)定DNA純度(OD260/280)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)材料:(1)全血DNA抽提試劑盒 QIAamp DNA Blood Mini kit購(gòu)自德國(guó)Qiagen 公司；(2)TaqMan 探針基因分型試劑盒購(gòu)自美國(guó)ABI公司。

1.2.3 方法:(1)提取全血中人基因組的DNA 嚴(yán)格按照Qiagen全血DNA抽提試劑盒說(shuō)明書操作提取基因組DNA。(2)利用TaqMan探針進(jìn)行基因分型。PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5′-3′外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，讀取擴(kuò)增后信號(hào)后，ABI7500PCR儀將擴(kuò)增前的本底信號(hào)去除，通過儀器檢測(cè)熒光值的變化，便可得到相應(yīng)SNP位點(diǎn)的分型結(jié)果。(3) PBMC的分離、培養(yǎng)、及刺激6～8 ml全血用密度梯度離心的方法分離PBMC，將PBMC鋪到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，對(duì)照組加入終濃度為10 mg/L的HBV核心抗原，刺激72 h后收集細(xì)胞提取RNA，細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行ELSIA檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1基因組DNA純度鑒定提取人血液樣本2 ml提取全基因組DNA，通過紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度均≥50 ng/μl，NanodropDNA測(cè)定儀測(cè)定DNA純度(OD260/280)在1.80～2.00之間隨機(jī)選取稀釋的12份DNA標(biāo)本工作液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果提示基因組DNA完整性良好。

2.2rs1800796位點(diǎn)的多態(tài)性與HBV,HCV,HIV疾病易感性的相關(guān)性分析為了分析rs1 800 796位點(diǎn)的多態(tài)性與病毒感染的易感性之間的關(guān)系，我們運(yùn)用TaqMan探針的技術(shù)對(duì)HBV，HCV，HIV患者組和健康組rs1 800 796位點(diǎn)進(jìn)行基因分型，結(jié)果顯示rs1 800 796位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性與HBV感染的易感性相關(guān)P=0.0003，OR=1.43，兩者之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與HCV和HIV感染組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。同時(shí)在HBV患者組和健康對(duì)照組rs1 800 796位點(diǎn)中基因型CC，CG，GG的分布具有顯著的差異，在HBV患者中基因型CC的的比例明顯高于基因型(CG+GG)P=0-0004，OR=1.53，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示rs1 800 796位點(diǎn)的等位基因C與增加HBV感染的風(fēng)險(xiǎn)。

表2 驗(yàn)證組IL-6rs1 800 796位點(diǎn)多態(tài)性與HBV易感性之間的關(guān)系

表3 以性別和年齡分層分析rs1 800 796位點(diǎn)基因分布的差異

2.3IL-6基因rs1800796位點(diǎn)的多態(tài)性與HBV易感性的驗(yàn)證基因多態(tài)性需要大樣本估算，故針對(duì)此單一位點(diǎn)rs1800796我們采用了基于TaqMan 探針技術(shù)的Real-time PCR基因分型，擴(kuò)大樣本(病例組848人，對(duì)照組894人)進(jìn)行驗(yàn)證。rs1 800 796位點(diǎn)基因型在此人群中仍具有哈迪溫伯格平衡。在驗(yàn)證人群中，乙肝患者C等位基因頻率為81.1%，健康對(duì)照為75.0%，兩組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0003，OR=1.43，95%CI=1.21～1.68)(表2)。進(jìn)一步證實(shí)了在漢族人群中IL-6基因rs1 800 796位點(diǎn)等位基因C與HBV易感性增加的風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)。

2.4以年齡和性別分層研究rs1800796多態(tài)性與HBV易感性的關(guān)系根據(jù)性別分層研究，我們發(fā)現(xiàn)一個(gè)有趣的現(xiàn)象，與健康對(duì)照組男女比例相比，實(shí)驗(yàn)人群和驗(yàn)證人群中的HBV患者中男性居多(表3)，最近的研究發(fā)現(xiàn)在男性HBV患者中rs1 800 796位點(diǎn)的G等位基因高于健康人群，提示我們r(jià)s1800796G等位基因可能是HBV感染的一個(gè)保護(hù)基因，但是卻是肝癌的一個(gè)危險(xiǎn)標(biāo)記。

2.5在血漿和細(xì)胞水平研究rs1800796基因多態(tài)性對(duì)IL-6分泌的影響為了研究rs1 800 796位點(diǎn)的多態(tài)性對(duì)IL-6基因表達(dá)的影響，我們檢測(cè)了健康組和HBV組人群血漿中IL-6的水平，發(fā)現(xiàn)HBV感染的患者中rs1800796GG基因型血漿中的IL-6含量低于rs1800796CC基因型，但是倆者之間的差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1 A)。PBMC在HBV核心抗原的刺激下，IL-6基因表達(dá)的水平在CC基因型明顯高于GG基因型，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(圖1B)。

圖1 基因型對(duì)IL6基因表達(dá)的影響. A 不同基因型的HBV患者和健康對(duì)照(HC)中血漿中IL6水平. B 不同基因型的純化的CD14+細(xì)胞中IL6水平Fig.1 Influence of SNP rs1800796 on IL6 gene production. A Plasma IL-6 levels in controls and chronic hepatitis B cases with different rs1800796 genotype. B IL-6 production by purified CD14+ monocytes with different rs1800796 genotypes

3 討論

隨著基因組流行病學(xué)的發(fā)展，乙肝候選易感基因也逐漸被確認(rèn)，分析研究這些基因在乙肝發(fā)生發(fā)展中的作用已經(jīng)成為當(dāng)前該領(lǐng)域一個(gè)重要的研究方向[7]。彭等的研究發(fā)現(xiàn)HIV/AIDS患者體內(nèi)Th17及Th1應(yīng)答失衡可能與IL6的表達(dá)失調(diào)相關(guān)[8]。屈等的研究也發(fā)現(xiàn)，慢性乙型肝炎患者經(jīng)IFNα治療過程中NK細(xì)胞也發(fā)揮了重要的作用[9]。

在非漢族人群中IL-6基因的其他SNP位點(diǎn)與活動(dòng)性結(jié)核的相關(guān)性也有報(bào)道，與加拿大土著居民比較發(fā)現(xiàn)，其rs1800795 G位點(diǎn)具有較高的等位基因頻率，提示其可能與結(jié)核的易感性相關(guān)。但是在印度和哥倫比亞居民中結(jié)果卻不相同[10]。產(chǎn)生這些差異的根本原因目前還不是很清楚，或許是某些技術(shù)原因抑或是樣本的數(shù)目太少，進(jìn)一步可能的解釋是每個(gè)研究中種族的構(gòu)成不同。在漢族人群中，rs1 800 796位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性與上述的假設(shè)一致，在一些研究中發(fā)現(xiàn)，此位點(diǎn)的多態(tài)性與其他一些炎癥疾病的易感性相關(guān)，包括Ⅱ型糖尿病，特發(fā)性膜性腎病，冠心病和慢性牙周炎[11]。相比之下，其他族裔中rs1800795和rs1 800 797位點(diǎn)存在顯著變異，但是這兩個(gè)已經(jīng)確定的位點(diǎn)的變異在漢族人群中并不常見。這表明rs1 800 796位點(diǎn)在漢族人群中是包括分枝桿菌感染在內(nèi)的炎癥性疾病易感性的遺傳變異的基礎(chǔ)。

本研究利用TaqMan探針技術(shù)對(duì)IL-6基因啟動(dòng)子區(qū)域翻譯起始位點(diǎn)上游-572位點(diǎn)rs1 800 796位點(diǎn)進(jìn)行基因分型，通過實(shí)驗(yàn)組HBV、HCV和HIV患者與健康對(duì)照組IL-6rs1 800 796位點(diǎn)的基因型分布分析，發(fā)現(xiàn)IL-6中的rs1 800 796位點(diǎn)與HBV的易感性相關(guān)。然后進(jìn)一步擴(kuò)大樣本通過實(shí)驗(yàn)組與健康對(duì)照組的比較，來(lái)證實(shí)rs1 800 796位點(diǎn)與HBV的相關(guān)性。最后通過比較健康對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組HBV患者血漿及細(xì)胞中IL-6基因表達(dá)的水平，進(jìn)一步證實(shí)IL-6基因rs1 800 796位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性影響了IL-6基因的表達(dá)水平。

綜上所述，IL-6基因rs1800796單核苷酸多態(tài)性可能與漢族人群乙肝的易感性有關(guān)，rs1800796G等位基因可能為HBV感染的一個(gè)保護(hù)基因；因此其多態(tài)性檢測(cè)科作為一種遺傳標(biāo)記進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)早期發(fā)現(xiàn)乙肝易感人群以及對(duì)乙肝防治工作具有重要意義。本研究深入地揭示宿主IL6基因遺傳易感性在乙型肝炎中發(fā)生發(fā)展中的作用，為乙型肝炎易感人群的預(yù)防干預(yù)決策及結(jié)核病基因型特異性個(gè)體化治療提供理論依據(jù)。IL-6基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控是由基因序列的多個(gè)位點(diǎn)相互作用進(jìn)行調(diào)控的，因涉及人種差異，需要在不同國(guó)家，不同種族進(jìn)行大樣本的研究，以進(jìn)一步揭示該基因多態(tài)性與結(jié)核易感性的關(guān)系。

[1] Liang X, Bi S, Yang W, et al. Epidemiological serosurvey of hepatitis B in China-declining HBV prevalence due to hepatitis B vaccination[J].Vaccine,2009,27(47):6550-6557. doi: 10.1016/j.vaccine.2009.08.048.

[2] Busch K, Thimme R. Natural history of chronic hepatitis B virus infection[J]. Med Microbiol Immunol. 2015,204(1):5-10. doi: 10.1007/s00430-014-0369-7.

[3] Li N, Gao YF, Zhang TC, et al. Relationship between interleukin 18 polymorphisms and susceptibility to chronic hepatitis B virus infection[J]. World J Hepatol 2012,4(3):105-109. doi: 10.4254/wjh.v4.i3.105.

[4] Thursz M, Yee L, Khakoo S. Understanding the host genetics of chronic hepatitis B and C[J]. Semin Liver Dis, 2011, 31(2):115-127. doi: 10.1055/s-0031-1276642.

[5] Johnson C, Han Y, Hughart N, et al. Interleukin-6 and its receptor, key players in hepatobiliary inammation and cancer[J]. Transl Gastrointest Cancer 2012,1(1):58-70. doi: 10.3978/j.issn.2224-4778.2011.11.02.

[6] Dienz O, Rincon M. The effects of IL-6 on CD4 T cell responses[J]. Clin Immunol 2009,130(1):27-33. doi: 10.1016/j.clim.2008.08.018.

[7] Kamatani Y, Wattanapokayakit S, Ochi H, et al. A genome-wide association study identies variants in the HLA-DP locus associated with chronic hepatitis B in Asians[J]. Nat Genet 2009,41(5): 591-595. doi: 10.1038/ng.348.

[8] 彭巧麗, 張明霞, 李桂英等. HIV/AIDS患者體內(nèi)Th17及Th1應(yīng)答失衡[J]. 中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志，2010, 24(1):17-20. doi:10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2010.01.007.

[9] 屈曉晶 路遙 曹衛(wèi)華等. 慢性乙型肝炎患者NK細(xì)胞功能與干擾素療效相關(guān)性研究[J].中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志, 2017,31(4): 333-337. doi: 10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2017.04.013.

[10] Rantala A, Lajunen T, Juvonen R, et al. Association of IL-6 and IL-6R gene polymorphisms with susceptibility to respiratory tract infections in young Finnish men[J]. Hum Immunol, 2011, 72(1):63-68. doi: 10.1016/j.atherosclerosis.2011.10.039.

[11] Pan M, Gao S P, Jiang M H, et al. Interleukin 6 promoter polymorphisms in normal han chinese population: frequencies and effects on inflammatory markers[J]. J Investig Med, 2011,59(2):272. doi: 10.231/JIM.0b013e318206ffad.

2017-05-17)

(本文編輯：陳培莉)

AssociationofsinglenucleotidepolymorphismofIL-6genewithsusceptibilitytohepatitisBvirus

ZhuXiuyun,WangWenfei,WuWeigang,LiHongchun,LiuWeilong,ZhangMingxia,LiuLei

ThirdPeople’sHospitalofShenzhen,GuangdongKeyLaboratoryforDiagnosis&TreatmentofEmergingInfectiousDiseases.Shenzhen(518112)China

ObjectiveLeukocyte mediated IL-6 (IL-6) plays an important role in chronic viral hepatitis pathogenesis and related liver diseases, We did a large sample-size case-control study and clinical data analysis to find association between IL-6 single nucleotide polymorphism and HBV susceptibility, and to achieve the detection of the body on the expression of IL-6 for the prevention and treatment of HBV infection.MethodsTotally 848 HBV patients and 894 healthy controls in Shenzhen were selected and rs1800796 genotypes were determined by TaqMan assays.ResultsThe result showed that rs1800796 polymorphism was associated with susceptibility to HBV infection (P=0.0003, odds ratio (OR)=1.43, the difference was statistically significant.ConclusionsThe single nucleotide polymorphism of IL-6rs1800796 locus was associated with the susceptibility of HBV infection in Chinese population, and the rs1800796 G allele is a protective gene for HBV infection.

Single nucleotide polymorphism；Interleukin-6；Hepatitis B virus

劉磊，Email:liulei3322@aliyun.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2017.05.004

單核苷酸多態(tài)性；白細(xì)胞介素6；肝炎病毒,乙型

廣東省自然科學(xué)基金(2015A030313692); 深圳市肝膽疾病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目(ZDSYS201504301534057)；深圳市科技計(jì)劃項(xiàng)目(JCYJ20160427183548637，JCYJ20160427152106244)；深圳市衛(wèi)生計(jì)生系統(tǒng)科研項(xiàng)目(201501029)

FundprogramsGuangdong Natural Science Foundation(2015A030313692)Shenzhen Key Laboratory of Hepatobiliary Diseases(ZDSYS201504301534057)；Shenzhen Science and Technology Plan Project(JCYJ20160427183548637，JCYJ20160427152106244)；Shenzhen Health and Family Planning Program(201501029)