HIV感染者外周血濾泡輔助性T細(xì)胞亞群變化特征研究

趙爽 陳威巍 趙敏

100039 北京大學(xué)302臨床醫(yī)學(xué)院(趙爽)；100039 北京，解放軍第302醫(yī)院感染性疾病診療與研究中心(趙敏、陳威巍)

HIV感染者外周血濾泡輔助性T細(xì)胞亞群變化特征研究

趙爽 陳威巍 趙敏

100039 北京大學(xué)302臨床醫(yī)學(xué)院(趙爽)；100039 北京，解放軍第302醫(yī)院感染性疾病診療與研究中心(趙敏、陳威巍)

目的探討HIV感染者外周血濾泡輔助性T細(xì)胞(Tfh)及其亞群分布情況以及與病情進(jìn)展的相關(guān)性。方法采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)20例未經(jīng)治療的HIV感染者，20例經(jīng)HAART后病毒完全抑制的HIV感染者，以及15例健康人外周血 Tfh及其亞群的頻率,分析其與病毒載量、CD4 T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)及血漿丙種免疫球蛋白濃度的相關(guān)性。結(jié)果與健康對(duì)照組相比，未治療組外周血Tfh17頻率明顯降低(P<0.05)，與血漿丙種免疫球蛋白濃度呈負(fù)相關(guān)，并與外周血CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)呈正相關(guān)，與病毒載量呈負(fù)相關(guān);Tfh2頻率與血漿丙種免疫球蛋白及病毒載量呈正相關(guān)，并與外周血CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)呈負(fù)相關(guān)；Tfh1頻率在HIV感染者中明顯升高(P<0.05)，與在未治療組中與血漿丙種免疫球蛋白濃度和病毒載量呈負(fù)相關(guān)，與外周血CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)呈正相關(guān)。結(jié)論Tfh亞群分布失衡，可能與HIV感染者持續(xù)性免疫激活狀態(tài)和疾病進(jìn)展有關(guān)。

人類免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus, HIV)感染機(jī)體后，患者表現(xiàn)出細(xì)胞及體液免疫功能缺陷和以高丙種球蛋白血癥為突出特征的異常免疫激活。異常免疫激活是 HIV 病理機(jī)制的標(biāo)志，持續(xù)性的抗原刺激，腸道細(xì)菌易位等因素可能是造成異常免疫激活的原因[1]。目前認(rèn)為異常免疫激活很可能是獨(dú)立于病毒復(fù)制之外的、介導(dǎo)機(jī)體免疫缺陷及疾病進(jìn)展的重要因素。

濾泡輔助性T細(xì)胞(Follicular helper T cells，Tfh)，是發(fā)揮B細(xì)胞輔助作用的主要T細(xì)胞群。已有研究發(fā)現(xiàn)HIV感染者外周血Tfh頻率明顯降低且功能受損，且在HIV感染者體液免疫失調(diào)及HIV特征性的全身免疫激活中發(fā)揮重要作用。但HIV感染時(shí)Tfh亞群變化及意義尚未見報(bào)道，本研究將探究HIV感染者外周血Tfh亞群的變化，并結(jié)合抗病毒治療后狀態(tài)探討各Tfh亞群變化的意義。

1 材料與方法

表1 各組研究對(duì)象一般資料對(duì)比

注：3組性別分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義：χ2=0.404，P=1.000；3組年齡分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義：P=0.2171.未治療組與治療組用藥前的CD4計(jì)數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義：P=0.6191；未治療組與治療組基線病毒載量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義：P=0.497

Notes: There was no significant difference in gender between the three groups: χ2=0.404，P=1.000；There was no significant difference in age between the three groups:P=0.2171. There was no significant difference in CD4 count between the untreated and the baseline data of the treated group:P=0.6191; There was no significant difference in viral load between the untreated and the baseline data of the treated group:P=0.6191

1.1研究對(duì)象研究對(duì)象為解放軍第302醫(yī)院2016 年3月至2017年3月收治的HIV感染者40例及同期體檢的健康成人15例。40例HIV感染者均為HIV確證試驗(yàn)陽性且無其他疾病及機(jī)會(huì)性感染者，均符合艾滋病診療指南(2015版)診斷標(biāo)準(zhǔn)。其中未治療組20例，治療組20例，選取HAART1年以上(44.26±12.89月)且病毒載量<40 拷貝/ml的患者。健康對(duì)照組15例，既往無免疫相關(guān)性疾病及其他基礎(chǔ)疾病，入組前2周無急性感染性疾病，未使用免疫抑制劑。3組之間性別、年齡的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳細(xì)情況見表1。

本研究獲得解放軍第302醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受試對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2儀器與試劑FACS CantoⅡ流式細(xì)胞儀、CD3-BV510、CD4-PE/Cy7、CD127-BV421、CD25-APC、CXCR3-PerCP/Cy5.5單克隆抗體均為美國(guó)BD公司產(chǎn)品。CXCR5-FITC、CCR6-PE單克隆抗體為美國(guó)Biolegend公司產(chǎn)品。淋巴細(xì)胞分離液為德國(guó)GE Healthcare 公司產(chǎn)品。HIV-1病毒載量測(cè)定使用的全自動(dòng)核酸分離純化系統(tǒng)為德國(guó)BIO-RAD公司產(chǎn)品(CFX96 Real-Time Ststem)，HIV-1核酸定量檢測(cè)試劑盒為德國(guó)Qiagen公司產(chǎn)品。

1.3外周血Tfh細(xì)胞、Th細(xì)胞及其亞群的檢測(cè)留取研究對(duì)象清晨外周空腹靜脈血 4 ml，EDTA 抗凝，F(xiàn)icoll 密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cell, PBMC)。

向PBMC懸液中分別加入CD3-BV510、CD4-PE/Cy7、CD127-BV421、CD25-APC、CXCR3-PerCP/Cy5.5、CXCR5-AF488和CCR6-PE單克隆抗體，避光孵育 25 min，在 PBS 洗滌后進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)，使用flowjo V10分析Tfh(CD3+CD4+CXCR5+)及其亞群Tfh1(CXCR3+CCR6-)、Tfh2(CXCR3-CCR6-)、Tfh17(CXCR3-CCR6+)的頻率。

1.4血漿病毒載量測(cè)定血漿HIV RNA 病毒載量采用 RT-PCR 方法，使用全自動(dòng)核酸分離純化系統(tǒng)(COBAS AMPLICOR)和核酸提取試劑盒，提取病毒 RNA并測(cè)定病毒載量。最低檢測(cè)下限(LDL)為40拷貝/ml。

1.5臨床數(shù)據(jù)血漿丙種免疫球蛋白等項(xiàng)目由302醫(yī)院臨檢中心檢測(cè)。

圖1 Tfh及其亞群流式分析圖Fig.1 The frequency of Tfh and its subsetsanalyzed byflow cytometry

圖2 HIV感染未治療組，治療組及健康對(duì)照組Tfh頻率及其亞群分布Fig.2 The frequency of Tfh and its subsets in treated and untreated HIV+ patients and healthy controls

2 結(jié)果

2.13組Tfh及Th細(xì)胞亞群分布的情況未治療組、治療組和健康對(duì)照組之間性別及年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，未治療組與治療組基線CD4計(jì)數(shù)及病毒載量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義：P=0.497(見表1)。流式細(xì)胞術(shù)分析Tfh及其各細(xì)胞亞群圈門策略見圖1。比較Tfh的頻率，未治療組明顯低于治療組和健康對(duì)照組(P=0.014和P=0.013)，而治療組與健康對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.861)(圖2 A)。HIV感染未治療組及治療組Tfh1占總Tfh比例較健康對(duì)照組明顯升高(P=0.001和P=0.001)，未治療組及治療組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.9445)；未治療組Tfh17占總Tfh比例較健康對(duì)照組明顯降低(P=0.012)，治療組較未治療組明顯升高(P=0.028)，治療組及健康對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.649)；Tfh2占Tfh比例在各組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.855)(圖2B)。

2.2HIV感染者外周血中Tfh亞群與CD4T細(xì)胞計(jì)數(shù)及病毒載量之間的關(guān)系HIV感染未治療組Tfh17和Tfh1頻率與CD4 T細(xì)胞計(jì)數(shù)呈正相關(guān)(r=0.6792，P=0.0006；r=0.3352，P=0.0075，圖3 A、3C)，而與病毒載量呈負(fù)相關(guān)(r=0.5258，P=0.0173;r=0.2231，0.0478,圖3D、3F)，治療組Tfh17頻率與CD4 T細(xì)胞計(jì)數(shù)也呈正相關(guān)(r=0.4724，P=0.0354，圖中未顯示);而TFh1與其呈負(fù)相關(guān)(r=0.2286，P=0.0330,圖中未顯示)。HIV感染未治療組Tfh2頻率與CD4T 細(xì)胞計(jì)數(shù)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.7213，P=0.0005，圖3B)，與病毒載量相關(guān)性檢驗(yàn)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(r=0.4351，P=0.0552，圖3E)；治療組Tfh2頻率與CD4 T細(xì)胞計(jì)數(shù)呈正相關(guān)(r=0.4447，P=0.0494,圖中未顯示)。

圖3 HIV感染未治療組中Tfh各亞群頻率與CD4 T細(xì)胞計(jì)數(shù)及病毒載量的相關(guān)性Fig.3 The correlation of frequency of tfh subsets and CD4+T cell counts or viral load in untreated HIV+ patients

圖4 HIV感染未治療組中Tfh各亞群頻率與血漿丙種免疫球蛋白的相關(guān)性Fig.4 The correlation of frequency of tfh subsets and plasma-immunoglobulin in untreated HIV+ patients

2.3HIV感染者外周血Tfh細(xì)胞亞群與血漿丙種免疫球蛋白濃度的相關(guān)性HIV感染未治療組Tfh17和Tfh1頻率均與血漿丙種免疫球蛋白濃度呈負(fù)相關(guān)(r=-0.5603，P<0.0r=0.3672，P=0.0216,圖4 A、4C)。HIV感染未治療組Tfh2頻率與血漿丙種免疫球蛋白濃度呈正相關(guān)(r=0.6391，P=0.0103,圖3B)。治療組中各群細(xì)胞頻率與血漿丙種免疫球蛋白濃度相關(guān)性檢驗(yàn)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖中未顯示)。

3 討論

定植于淋巴濾泡的CD4+CXCR5+ Tfh是主要輔助B細(xì)胞產(chǎn)生抗體的T細(xì)胞亞群，在生發(fā)中心形成和B細(xì)胞分化中起重要作用。而外周血中的高表達(dá)CXCR5的CD4+T細(xì)胞與淋巴結(jié)中Tfh功能相似, 故研究者認(rèn)為其是Tfh的記憶形式[2]。外周血Tfh根據(jù) CXCR3 和CCR6的不同表達(dá)情況又可分為Tfh1、 Tfh2和Tfh17三個(gè)亞群。其中Tfh2及Tfh17可以誘導(dǎo)B細(xì)胞產(chǎn)生免疫球蛋白以及通過細(xì)胞因子促進(jìn)同種型轉(zhuǎn)換，具有B細(xì)胞輔助功能[3]。Tfh1/2/17與輔助性 T(Th)細(xì)胞1/2/7相互對(duì)應(yīng)，可分別分泌IFN-r(Tfh1)、IL-4(Tfh2)以及IL-17和IL-21(Tfh17)[2]。

本研究發(fā)現(xiàn)未經(jīng)治療的HIV感染者外周血Tfh數(shù)量明顯減少，且其亞群存在明顯的頻率失衡。Tfh17頻率在未治療的HIV感染者外周血中明顯降低，在治療組中可以部分逆轉(zhuǎn)，并且與CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)呈正相關(guān)關(guān)系，說明Tfh17的減少確實(shí)與HIV感染疾病進(jìn)展密切相關(guān)。經(jīng)有效抗病毒治療后，Tfh亞群失衡得到部分恢復(fù)，且與免疫重建程度密切相關(guān)。HIV感染者的外周血中不成熟的B細(xì)胞明顯擴(kuò)增，而靜息記憶B細(xì)胞群比健康人大大減少[4]。Tfh17分泌重要的B細(xì)胞輔助因子IL-21，而IL-21在免疫球蛋白類別轉(zhuǎn)換，B細(xì)胞分化及記憶B細(xì)胞的存活等方面均有重要作用[5]。因此，HIV感染者Tfh17數(shù)量的減少可能造成了B細(xì)胞表型及體液免疫功能的異常。

另一方面，Tfh17分泌IL-17，在機(jī)體抵抗細(xì)菌及真菌感染及促進(jìn)黏膜修復(fù)中發(fā)揮重要作用[6]。已有研究發(fā)現(xiàn)Th17細(xì)胞在HIV感染中明顯減少且在HIV感染的腸道黏膜病理中發(fā)揮重要作用[7]。在急性HIV感染早期腸道黏膜相關(guān)淋巴組織(MALT)即遭受病毒感染，造成其結(jié)構(gòu)破壞及免疫損傷，各種細(xì)菌及細(xì)菌易位產(chǎn)物釋放入血，引起持續(xù)性的全身免疫激活。因此定植于淋巴組織中分泌IL-17的 Tfh17，其數(shù)量功能的異?？赡苁荋IV感染中細(xì)菌異位及免疫激活的重要原因。慢性感染對(duì)不成熟B細(xì)胞亞群的持續(xù)激活會(huì)造成高水平的非特異多克隆抗體的分泌，從而造成高丙種球蛋白血癥[8]。而我們的研究發(fā)現(xiàn)，HIV感染者外周血中Tfh17頻率的減少與血漿丙種免疫球蛋白呈正相關(guān)，進(jìn)一步提示HIV感染中Tfh17的減少可能促進(jìn)了腸道細(xì)菌異位，并造成了免疫系統(tǒng)的激活及疾病的進(jìn)展。新近還有研究發(fā)現(xiàn)，腸道細(xì)菌異位會(huì)對(duì)HIV導(dǎo)致的Tfh功能異常起到協(xié)同增效作用[9]，這意味著Tfh功能異常和腸道細(xì)菌異位可能會(huì)形成惡性循環(huán)，導(dǎo)致疾病的進(jìn)一步進(jìn)展。

Tfh2可分泌IL-4，能夠增強(qiáng)B細(xì)胞提呈抗原的能力，促進(jìn)休止期B細(xì)胞的早期活化，使免疫系統(tǒng)對(duì)小量抗原刺激即可發(fā)生免疫應(yīng)答[10]。本研究發(fā)現(xiàn)在HIV未治療組中Tfh2頻率與外周血CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)呈負(fù)相關(guān)，與血漿丙種免疫球蛋白濃度呈正相關(guān)，提示HIV感染中，Tfh2與疾病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)且可能在異常免疫激活、高丙種球蛋白血癥的形成中發(fā)揮了促進(jìn)作用。這可能是因?yàn)門fh2放大了HIV感染時(shí)異位細(xì)菌及細(xì)菌產(chǎn)物對(duì)B細(xì)胞的刺激作用，但具體機(jī)制仍需要進(jìn)一步的研究予以揭示。

Tfh1分泌具有抗病毒作用的IFN-r。本研究發(fā)現(xiàn)HIV感染患者治療組及未治療組，Tfh1頻率均較健康對(duì)照組明顯升高。且在未治療組中，Tfh1頻率與病毒載量呈負(fù)相關(guān)，與外周血CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)呈正相關(guān)，提示Tfh1上調(diào)發(fā)揮抗病毒作用，且在促進(jìn)免疫重建中發(fā)揮積極作用。另外，未治療組中，Tfh1頻率與血漿丙種球蛋白濃度呈負(fù)相關(guān)，提示Tfh1可能通過抗病毒作用，間接抑制了HIV感染中的異常免疫激活。

本研究首次探討了Tfh亞群在HIV感染中的變化及其與疾病進(jìn)展的關(guān)系，并首次研究了其與HIV感染特征性異常免疫激活的關(guān)系。 基于異常免疫激活在艾滋病的發(fā)病、抗病毒治療后免疫重建中均發(fā)揮重要作用，近年研究者們已將免疫激活作為艾滋病的潛在治療靶點(diǎn)進(jìn)行研究。本研究提出了HIV感染異常免疫激活可能的新機(jī)制，即HIV感染中Tfh不同功能的亞群的分布失衡，可能參與了HIV感染異常免疫激活的發(fā)生發(fā)展，進(jìn)而在疾病的進(jìn)展中發(fā)揮了重要的作用，這可能為HIV感染的治療提供了新的靶點(diǎn)。因此進(jìn)一步深入研究Tfh及其亞群在HIV感染中的變化及其機(jī)制，可能具有十分重要的意義。

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2017-07-10)

(本文編輯：陳培莉)

ChangesofperipheralfollicularhelperTcellsubsetsinHIVinfectedpatients

ZhaoShuang,ChenWeiwei,ZhaoMin

PekingUniversityNo. 302ClinicalMedicalSchool,Beijing100039,China(ZhaoS);TreatmentandResearchCenterforInfectiousDiseases,theNo. 302MilitaryHospital,Beijing, 100039,China(ZhaoM;ChenWW)

ZhaoMin,Email：drzhaomin@sina.com;ChenWeiwei，Email：cww302@126.com

ObjectiveTo investigate the changes of the frequencies of follicular helper T (Tfh) cell subsets in peripheral blood of HIV-1 infected patients and its relevance to the disease severity.MethodsTwenty untreated HIV+ patients, 20 HAART-suppressed patients and 15 health controllers are enrolled in this study. The frequencies of Tfh and its subsets were examined by flow cytometry.ResultsThe frequency of Tfh17 subset in peripheral blood decreased significantly in untreated HIV-1+ patients as compared with those of healthy controls and HAART-suppressed patients (P<0.05). In addition, the frequency of this subset were positively correlated with CD4+T cell counts in both untreated and treated HIV+ patients，and were inversely correlated with viral load and plasma-immunoglobulin in untreated HIV+ patients. The frequency of Tfh2 subset, however, were inversely correlated with CD4+T cell counts and positively correlated with viral load and plasma-immunoglobulin in untreated HIV+ patients. The frequency of Tfh1 subset in peripheral blood increased significantly in untreated and treated HIV-1+ patients as compared with those of healthy controls (P<0.05) and were inversely correlated with viral load and plasma-immunoglobulin in untreated HIV+ patients and positively correlated with CD4+T cell counts.ConclusionsThe abnormal distribution of Tfh subests may play a role in the progression of HIV infection and its characteristic immune activation.

HIV infection；Follicular helper T cells；Tfh17；Tfh2；Tfh1

趙敏,Email：drzhaomin@sina.com；陳威巍,Email：cww302@126.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2017.05.003

HIV感染；濾泡輔助性T細(xì)胞；濾泡輔助性T細(xì)胞17；濾泡輔助性T細(xì)胞2；濾泡輔助T細(xì)胞1

國(guó)家自然科學(xué)基金(81470097,81471577)

FundprogramsNational Natural Science Foundation of China(81470097,81471577)