HIV感染無癥狀者外周血中HIV特異性T細胞及其亞群表達CD160情況的研究

黃磊 涂波 金磊 李豐衣 張昕 王淑青 張政 聶為民

100039 北京，解放軍第三○二醫(yī)院感染性疾病診療與研究中心(黃磊、涂波、金磊、李豐衣、王淑青、聶為民)，臨床研究醫(yī)學(xué)轉(zhuǎn)化中心(張政)

·論著·

HIV感染無癥狀者外周血中HIV特異性T細胞及其亞群表達CD160情況的研究

黃磊 涂波 金磊 李豐衣 張昕 王淑青 張政 聶為民

100039 北京，解放軍第三○二醫(yī)院感染性疾病診療與研究中心(黃磊、涂波、金磊、李豐衣、王淑青、聶為民)，臨床研究醫(yī)學(xué)轉(zhuǎn)化中心(張政)

目的探討HIV感染無癥狀者外周血中CD160在HIV特異性T細胞及其各亞群中的表達情況。方法采集2014年6月至2015年11月于解放軍第302醫(yī)院就診的43例未經(jīng)抗病毒治療的HIV感染無癥狀者和18例健康者的外周血，分離外周血單個核細胞，用免疫熒光染色法標記CD160后，以流式細胞儀檢測其在HIV特異性T細胞及其各亞群(Tn、Tcm、Tem和Teff)細胞上的表達情況。結(jié)果HIV感染無癥狀者外周血中，CD160在總體HIV特異性CD4+T細胞和CD8+T細胞中表達的頻數(shù)和MFI均較健康對照組高(P<0.01)；HIV特異性CD4+T細胞的各亞群中，CD160在CD4+Tn細胞中MFI，CD4+Teff細胞中頻數(shù)和MFI顯著升高(P<0.01)；HIV特異性CD8+T細胞的各亞群中，CD8+Tn細胞、CD8+Tcm細胞及CD8+Tem細胞表達CD160的頻數(shù)和MFI均顯著升高(P<0.01)。結(jié)論慢性HIV感染可導(dǎo)致HIV特異性T細胞及其不同亞群中CD160高表達，引起細胞免疫功能紊亂，可能進而損傷了對HIV病毒的控制能力。

病毒特異性T細胞在控制病毒感染的過程中發(fā)揮著關(guān)鍵性作用，其功能是否正常直接影響著感染最終的轉(zhuǎn)歸。人類免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus, HIV)的主要靶細胞是CD4+T細胞。HIV的感染不但導(dǎo)致CD4+T細胞數(shù)量的進行性減少，更重要的是，導(dǎo)致了包括CD4+T細胞和CD8+T細胞在內(nèi)的T細胞的功能異常。特別是HIV特異性CD4+T細胞和CD8+T細胞功能異常，直接導(dǎo)致了HIV感染的慢性化[1]。研究表明，共抑制分子介導(dǎo)的抑制信號對T細胞的活化、分化和效應(yīng)功能起決定性的調(diào)控作用，尤其是共抑制分子PD-1(Programmed death-1)、CTLA-4(Cytotoxic T-lymphocyte antigen-4)、Tim-3(T-cell immunoglobulin and mucin-domain containing-3)、BTLA(B and T lymphocyte attenuator)[2]。研究證實，這些共抑制分子不僅可作為病毒(包括HIV)慢性感染疾病進展的重要標志，更是導(dǎo)致HIV特異性T細胞功能缺陷和疾病進展的重要原因[3]。CD160是近期發(fā)現(xiàn)的一種對T細胞有抑制功能的免疫分子，它是否也參與了HIV慢性感染期的HIV特異性T細胞功能衰竭尚未完全闡明。因此，探討CD160在HIV感染無癥狀者HIV特異性T細胞上表達的改變，對進一步闡明HIV感染后，T細胞功能衰竭的機制有十分重要的意義，也將為今后治療HIV感染提供新的治療靶點。

表1 臨床基本信息表

注：HIV病毒載量為非正態(tài)分布，以中位數(shù)(范圍)表示

Note： HIV load which is non-normal distribution is presented as median and range

1 材料與方法

1.1研究對象分組和入選標準選擇2014年6月至2015年11月于解放軍第302醫(yī)院就診的43例HIV確診實驗陽性，未經(jīng)抗病毒治療的HIV感染無癥狀者，及健康志愿者18例作為研究對象，留取研究對象外周血。HIV感染無癥狀者診斷標準參照艾滋病診療指南第三版(2015)，同時排除合并腫瘤、共感染HBV和/或HCV，自身免疫性疾病等。所有研究對象均簽署知情同意書，實驗經(jīng)解放軍第302醫(yī)院倫理委員會批準進行。研究對象基本資料詳見表1。

1.2主要試劑鼠抗人CD3-FITC、CD8-PB、CD27-PEcy7、CD45RO-APCcy7、pentamer-APC、HLA-A2-PE抗體，CD3-PerCP/CD4-FITC/CD8-PE三色抗體、溶血素及TruCount管購自美國BD公司。 鼠抗人CD160-PE及其同型對照IgG-PE抗體購自美國Bioscience公司。 HIV-1核酸PCR熒光定量檢測試劑盒購自深圳匹基生物工程有限公司。

1.3全血CD4+T淋巴細胞計數(shù)測定取50 μl抗凝血加入TruCount管中，隨后加入10 μl CD3-PerCP/CD4-FITC/CD8-PE三色抗體，室溫避光染色20 min。加入10倍稀釋的溶血素450 μl，混勻避光15 min，上機檢測。

1.4病毒載量測定按照說明書，使用RT-PCR儀檢測HIV感染無癥狀者血漿中HIV-1的病毒載量。

1.5HIV特異的抗原刺激取研究對象100 μl全血，加入10 μl HLA-A2-PE抗體，并以相應(yīng)同型作為對照，按操作說明，通過流式細胞儀進行HLA-A2 的分型，如果HLA-A2 陽性加入p17 gag 蛋白上的HLA-A0201 (SL9,SLYNTVAL)表位進行刺激，如果HLA-A2陰性加入nef 多肽上的 HLA-A1101 表位(QK10, QVPLRPMTYK)及nef 多肽上的 HLA-A2402 表位(RL9, RYLKDQQLL) 刺激。

1.6FACS分析留取研究對象外周血10 ml，按常規(guī)分離單個核細胞。根據(jù)HLA-A2分析結(jié)果，對分離的細胞進行相應(yīng)HIV多肽刺激，并將細胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基中。在37℃的5% CO2孵箱中培養(yǎng)72 h后收集細胞，洗滌并重新懸浮于PBS中，進行細胞計數(shù)，保證細胞濃度>2.5×106/ml，取200 μl細胞懸液置于流式管中，加入鼠抗人CD3-FITC、CD8-PB、CD27-PEcy7、CD45RO-APCcy7、pentamer-APC和CD160-PE抗體各10 μl，輕輕混勻，室溫避光染色30 min，加入1 ml PBS混勻，1 200 r/min離心洗滌2次，棄去上清，加入200 μl PBS重懸。立即上流式細胞儀(美國BD公司FACS Aria型)檢測。pentamer五聚體和CD160以相應(yīng)克隆熒光標記作為同型對照進。采用FlowJo7.6.1流式分析軟件分析流式結(jié)果。因HIV-1感染會導(dǎo)致CD4下調(diào)， 故以CD3+CD8-代表CD4+T細胞[4]。

表2 兩組CD4+T細胞和CD8+T細胞CD160的表達情況

注：MFI為平均熒光強度

Note： MFI means median flourscence indensity

圖1 CD160在HIV感染無癥狀者外周血HIV特異性CD4+T細胞和CD8+T細胞上的表達，HC為健康對照組， a表示P<0.01Fig.1 The expression of CD160 on HIV-specific CD4+ T cells and CD8+ Tcells from peripheral blood of asymptomatic HIV-infected individuals. HC means heathy controls. a indicate P<0.01

2 結(jié)果

2.1HIV感染無癥狀者HIV特異性CD4+T細胞和CD8+T細胞上CD160的表達情況結(jié)果顯示，HIV感染無癥狀者外周血中CD160陽性的HIV特異性CD4+T細胞和CD8+T細胞的頻數(shù)和平均熒光強度(Mean fluorescence intensity，MFI)，與對照組相比均顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(如表2、圖1所示)。

2.2CD160在HIV感染無癥狀者HIV特異性CD4+T細胞各亞群上的表達情況根據(jù)CD27和CD45的表達情況， T細胞可分為四個亞群，分別是：初始T細胞(Tn，CD27+CD45RO-), 中心記憶T細胞(Tcm, CD27+CD45RO+), 效應(yīng)記憶T細胞 (Tem, CD27-CD45RO+) 和效應(yīng)T細胞 (Teff, CD27-CD45RO-)。為了分析HIV感染對T細胞的影響，本研究首先分析了CD160在不同的HIV特異性CD4+T細胞亞群上的表達情況。結(jié)果顯示，HIV感染無癥狀者的HIV特異性CD4+T細胞各亞群中，CD160陽性細胞無論頻數(shù)還是MFI均較對照組升高。但與對照組相比，僅有CD160+CD4+Tn細胞的MFI，CD160+CD4+Teff細胞的頻數(shù)和MFI的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(如表3、圖2所示)。

2.3CD160在HIV感染無癥狀者HIV特異性CD8+T細胞各亞群上的表達情況為了探討HIV慢性感染階段，HIV特異性CD8+T細胞功能的改變，我們進一步分析了CD160在HIV特異性CD8+T細胞各亞群中的表達情況。結(jié)果顯示，在HIV感染無癥狀者HIV特異性CD8+T細胞各亞群中，CD160陽性細胞無論頻數(shù)還是MFI均較對照組升高。并且與對照組相比，CD160+CD8+Tn細胞、CD160+CD8+Tcm細胞及CD160+CD8+Tem細胞的頻數(shù)和MFI差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(如表4、圖3所示)。

表3 兩組的HIV特異性CD4+T細胞各亞群中CD160表達情況

注：MFI為中位熒光強度

Note： MFI means median flourscence indensity

圖2 CD160在兩組中的HIV特異性CD4+T細胞各亞群上的表達情況，HC為健康對照組，a表示P<0.01Fig.2 The expression of CD160 on different subsets of HIV-specific CD4+ T cells in two groups. HC means heathy controls. a indicate P<0.01

表4 兩組HIV特異性CD8+T細胞各亞群中CD160表達情況

注：MFI為中位 熒光強度

Note： MFI means median flourscence indensity

圖3 CD160在兩組的HIV特異性CD8+T細胞各亞群上的表達情況，HC為健康對照組，a表示P<0.01Fig.3 The expression of CD160 on different subsets of HIV-specific CD8+ T cells in two groups. HC means heathy controls. a indicate P<0.01

3 討論

近年來研究表明，HIV感染后疾病進展的速度與機體能否產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答密切相關(guān)，特別是與HIV特異性T細胞介導(dǎo)的細胞免疫反應(yīng)強弱有關(guān)。HIV特異性CD4+T細胞主要通過三種途徑控制HIV感染：①活化HIV特異性CD8+T細胞，并維持其正常功能；②一些具有細胞毒性的HIV特異性CD4+T細胞可以直接清除HIV感染；③HIV特異性CD4+T細胞可輔助B細胞產(chǎn)生針對HIV的中和性抗體；而HIV特異性CD8+T細胞更是控制HIV感染的直接執(zhí)行者，它的出現(xiàn)是HIV急性感染期迅速抑制了病毒復(fù)制的關(guān)鍵因素和重要標志[5-7]。

但是，在HIV感染過程中，HIV特異性細胞免疫的出現(xiàn)，并未徹底清除HIV感染，其中一個重要原因是HIV感染后導(dǎo)致T細胞上調(diào)了共抑制分子的表達。近期的研究報道，共抑制分子 PD-1、CTLA-4、Tim-3及BTLA等與包括HIV在內(nèi)的慢性病毒感染時T細胞功能的受損和疾病的進展密切相關(guān)[2-5]。作為共抑制分子，CD160是新近發(fā)現(xiàn)的一種對T細胞有抑制功能的免疫分子。研究顯示，CD160對CD4+T細胞有顯著的抑制功能[8]，并可抑制CD4+T細胞和CD8+T細胞的增生[9]。對HIV感染者的淋巴組織中CDl60在基因水平上表達上調(diào)[10]。這些結(jié)果提示CD160作為一種新的共抑制分子可能參與了HIV感染過程中T細胞的功能衰竭。但是，目前對CD160在HIV特異性T細胞及其各亞群上的表達情況仍不完全清楚。

為了闡明CD160對HIV感染的影響，并避免機會性感染對患者免疫系統(tǒng)的影響，本研究檢測了CD160在HIV感染無癥狀者外周血HIV特異性CD4+T細胞、CD8+T細胞及其各亞群上的表達情況。結(jié)果顯示，雖然CD160在總體HIV特異性CD4+T細胞和CD8+T細胞上的表達頻數(shù)和MFI均顯著高于對照組，但對各亞群的影響有差異，且對HIV特異性CD8+T細胞影響更大。前期有研究表明，PD-1和Tim-3在HIV特異性CD4+T細胞和CD8+T細胞表達均上調(diào)，CTLA-4和CD160的表達則分別傾向于在HIV特異性CD4+T細胞或HIV特異性CD8+T細胞上調(diào)[11]。這與我們的實驗結(jié)果一致。

不同亞群的細胞扮演著不同的角色。在T細胞的不同亞群中，初始T細胞主要作用為受到特異性抗原刺激后，分化、增生為記憶性細胞和效應(yīng)細胞，中樞記憶性T細胞和效應(yīng)記憶性T細胞在再次遇到相應(yīng)抗原刺激時會迅速分化為效應(yīng)T細胞，而效應(yīng)T細胞則是具體功能的執(zhí)行者。我們的結(jié)果顯示，作為輔助CD8+T細胞產(chǎn)生HIV特異性的直接參與者，CD160在HIV特異性CD4+Teff細胞上的表達上調(diào)，可能意味著HIV特異性CD8+T細胞在分化之初即缺乏了正確的引導(dǎo)，而CD8陽性的Tn細胞、Tcm細胞和Tem細胞上CD160表達上調(diào)，可能直接導(dǎo)致了HIV特異性CD8+T細胞在受到HIV抗原刺激時分化、增生和功能的異常。

正常的免疫功能需要機體免疫組份的相互協(xié)調(diào)、輔助，任何一個環(huán)節(jié)異常，都可能使免疫功能受損。我們的研究結(jié)果提示，HIV感染的慢性化，并不僅僅是HIV特異性CD8+T細胞功能的異常，而是一個涉及輔助、分化和功能上的多個環(huán)節(jié)的異常。我們的結(jié)果也將對深入理解HIV慢性感染過程中T細胞功能衰竭的機制和共抑制因子在其中發(fā)揮的作用有重要意義。

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2017-06-06)

(本文編輯：陳培莉)

DetectionofHIV-specificTcellsandtheirsubsetsexpressingCD160inperipheralbloodofasymptomaticHIV-infectedpatients

HuangLei,TuBo,JinLei,LiFengyi,Zhangxin,WangShuqing,ZhangZheng,NieWeimin

TreatmentandResearchCenterforInfectiousDiseases,TheNo. 302HospitalofthePeople’sLiberationArmy(PLA),Beijing100039,China;ZhangZheng.ClinicalResearchCenterforTranslationalMedcine,TheNo. 302HospitalofPLA,Beijing100039,China

NieWeimin,Email:niewm302@126.com

ObjectiveTo investigate the expression of CD160 in HIV-specific T cells and their subsets in peripheral blood of asymptomatic human immunodeficiency virus (HIV) infected individuals.MethodsA total of 43 asymptomatic HIV-infected individuals without antiretroviral therapy (ART) and 18 healthy controls were recruited from the No. 302 Hospital of PLA between June 2014 and November 2015. Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were isolated from peripheral bloods of these subjects. CD160 was stained with fluorescent antibody. Expression of CD160 in HIV-specific T cells and their subsets was detected by flow cytometry.ResultsThe frequency and median fluorescence intensity (MFI) of CD160 on the whole HIV-specific CD4+ T cells and CD8+ T cells were higher than those in the healthy controls(P<0.01). In subsets of HIV-specific CD4+ T cells, the MFI of CD160 in CD4+ Tn cells and CD4+ Teff cells，and the frequency of CD160 in CD4+ Teff cells were significantly increased (P<0.01). CD8+ Tn fine, CD8+ Tcm cells and CD8+ Tem cells showed a significant upregulation in the frequency and MFI of CD160 (P<0.01).ConclusionsChronic HIV infection can lead to high expression of CD160 in HIV-specific T cells and their different subsets, causing cellular immune dysfunction, which may further impair the ability to control the HIV virus.

Human immunodeficiency virus; CD160; CD4+ T cells; CD8+ T cells

聶為民，Email：niewm302@126.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2017.05.002

人獲得性免疫缺陷病毒；CD160；CD4+T細胞；CD8+T細胞

全軍醫(yī)學(xué)科技“十二五”科研面上項目(CWS12J137)

FundprogramsThe 12th Five-Year Research Project of People's Liberation Army(CWS12J137)