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    過氧化麥角甾醇衍生物對(duì)人三陰性乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

    2022-06-23 05:39:30張宏宇任文康鄒宇韓迎龍楊宏艷卜明都曉輝林宇
    中國(guó)藥房 2022年11期
    關(guān)鍵詞:懸液空白對(duì)照乳腺癌

    張宏宇 任文康 鄒宇 韓迎龍 楊宏艷 卜明 都曉輝 林宇

    關(guān)鍵詞過氧化麥角甾醇衍生物;乳腺癌細(xì)胞;EP-3P;三陰性乳腺癌;遷移;侵襲;凋亡

    全球最新癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)顯示,2020 年全球乳腺癌新發(fā)病例高達(dá)226 萬例,超過了肺癌的220 萬例,已成為全球第一大癌癥[1]。雖然隨著化療、內(nèi)分泌治療、靶向治療等綜合治療手段的運(yùn)用,癌癥患者的病死率已大幅度下降,但我國(guó)仍約有7.82%的女性因乳腺癌復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移而死亡[2]。因此,探尋治療乳腺癌的有效藥物仍然是亟待解決的問題。

    從天然產(chǎn)物中尋找抗腫瘤藥物或抗腫瘤輔助藥物,并對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造或修飾,已成為國(guó)內(nèi)外研究的重點(diǎn)內(nèi)容之一。過氧化麥角甾醇(ergosterol peroxide,EP)是一種過氧化甾體類天然產(chǎn)物,廣泛存在于多種真菌中[3-4]。已有大量文獻(xiàn)報(bào)道,EP可通過細(xì)胞毒性作用抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)[5-7]。研究發(fā)現(xiàn),EP 作為一種重要的活性先導(dǎo)化合物,其特有的5α,8α-過氧橋是關(guān)鍵藥效載體[8-10]。EP的C-3 位和C-17 位具有較大的結(jié)構(gòu)修飾空間,如Li 等[11]、Han 等[12]分別在EP 的C-17 位引入吲哚醌取代基和酰肼側(cè)鏈合成了新的化合物,并發(fā)現(xiàn)上述合成的化合物均可顯著抑制癌細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡;再如Bu 等[13]發(fā)現(xiàn),在EP的C-3 位引入氨基甲酸酯極性基團(tuán)對(duì)提升其抑制腫瘤細(xì)胞增殖的活性至關(guān)重要。

    紫杉醇是一種公認(rèn)的治療乳腺癌的藥物,其結(jié)構(gòu)中的C-13 側(cè)鏈與其抗腫瘤作用密切相關(guān)[14]。為進(jìn)一步推進(jìn)EP 結(jié)構(gòu)衍生化研究,篩選具有更強(qiáng)抗腫瘤活性的新化合物,本課題組前期以EP作為先導(dǎo)化合物,通過在其C-3 位羥基引入紫杉醇的側(cè)鏈(4S,5R)-3- 叔丁氧羰基-2,2-二甲基-4-苯基-1,3- 唑烷-5-甲酸,合成了全新的EP衍生物EP-3P(結(jié)構(gòu)見圖1)。本研究擬通過體外實(shí)驗(yàn)初步考察EP-3P 對(duì)人三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231 增殖、遷移和侵襲的影響,并探討其可能的作用機(jī)制,以期為乳腺癌治療相關(guān)藥物的開發(fā)研究提供參考。

    1 材料

    1.1 主要儀器

    本研究所用的主要儀器包括:Axio observer A1 型倒置顯微鏡(德國(guó)Zeiss 公司),SAFIRE2 型多功能酶標(biāo)儀(瑞士Tecan 公司),Power/PAC3000 型電泳儀、Chemi-Doc MP型凝膠成像儀、FACS Calibur 型流式細(xì)胞儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。

    1.2 主要藥品與試劑

    本研究所用的主要藥品與試劑包括:EP-3P(由齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院藥物化學(xué)研究室提供,批號(hào)20211020,經(jīng)高效液相色譜法和核磁共振法檢測(cè)其純度均在98%以上),L-15 培養(yǎng)基、胎牛血清(美國(guó)Hyclone 公司),重組胰蛋白酶消化液、二甲基亞砜(DMSO)、MTT細(xì)胞增殖與細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒(批號(hào)C0038)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度試劑盒(批號(hào)P0010)、RIPA裂解液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司),Annexin Ⅴ-FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Invitrogen 公司,批號(hào)1753025),細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司,批號(hào)KGA512),Matrigel 基質(zhì)膠(美國(guó)BD 公司,批號(hào)356234),鼠源B 淋巴細(xì)胞瘤2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)和兔源Bcl-2 相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)、細(xì)胞色素C(cytochrome C,Cyt-C)、胱天蛋白酶3(cysteinyl aspartate specific proteinase 3,caspase-3)、活化的caspase-3(cleaved-caspase-3)、基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)、MMP-9、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)8 種單克隆抗體以及辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔、山羊抗小鼠免疫球蛋白G(IgG)二抗(美國(guó)Cell Signaling Technology 公司),ECL發(fā)光試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技股份有限公司,批號(hào)CW0049),其余試劑均為分析純,水為超純水。

    1.3 細(xì)胞

    人三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231 購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

    2 方法

    2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

    將MDA-MB-231 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%雙抗(100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素)的L-15 培養(yǎng)基中,置于37 ℃、無CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。本研究選用傳代6~10代的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

    2.2 EP-3P對(duì)MDA-MB-231 細(xì)胞增殖的影響

    采用MTT 法進(jìn)行檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDAMB-231 細(xì)胞,胰酶消化后用L-15 完全培養(yǎng)基稀釋成2×104個(gè)/mL 的細(xì)胞懸液,將細(xì)胞懸液按100 μL/孔接種于96 孔板中。實(shí)驗(yàn)設(shè)置空白對(duì)照組(不加任何藥物處理培養(yǎng)的細(xì)胞,即0 μmol/L)、EP-3P 不同濃度組(1.25、2.5、5、10、20、40 μmol/L,藥物濃度根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)置),每組平行設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔;并設(shè)置空白調(diào)零孔(不加細(xì)胞,只加培養(yǎng)液)。分別在培養(yǎng)24、48、72 h 時(shí),每孔加入0.5mg/mL 的MTT 溶液10 μL,培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)4 h 后棄去MTT,再每孔加入150 μL DMSO振蕩30 min 溶解甲瓚結(jié)晶;然后采用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在490 nm波長(zhǎng)處的光密度值,并計(jì)算細(xì)胞的增殖抑制率:增殖抑制率(%)=[1-(給藥組光密度值-空白調(diào)零孔光密度值)/(空白對(duì)照組光密度值- 空白調(diào)零孔光密度值)]×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

    2.3 EP-3P對(duì)MDA-MB-231 細(xì)胞遷移能力的影響

    采用細(xì)胞劃痕法進(jìn)行檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231 細(xì)胞,以1×105個(gè)/孔的細(xì)胞密度接種于6孔板中,常規(guī)培養(yǎng)過夜,然后采用無菌槍頭在垂直于板的橫軸方向劃出等寬的直線劃痕,用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細(xì)胞3 次。將細(xì)胞分為空白對(duì)照組(0 μmol/L)和EP-3P不同濃度組(5、10、20 μmol/L,濃度根據(jù)“2.2”項(xiàng)下MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果和本課題組前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)置,下同),每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔。分別在培養(yǎng)0、24 h 后,用倒置顯微鏡觀察劃痕愈合情況,并拍照。利用Image J V1.8.0 軟件測(cè)定劃痕面積,計(jì)算細(xì)胞的遷移愈合率:遷移愈合率(%)=(0 h 時(shí)劃痕面積-24 h 時(shí)劃痕面積)/0 h 時(shí)劃痕面積×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

    2.4 EP-3P對(duì)MDA-MB-231 細(xì)胞侵襲能力的影響

    采用Transwell 小室法進(jìn)行檢測(cè)。將Matrigel 基質(zhì)膠與無血清培養(yǎng)基按照體積比1 ∶8 混勻后,按50 μL/孔的量加入到Transwell 小室上層。將細(xì)胞侵襲小室置于培養(yǎng)箱中,將Matrigel 烘干,然后棄掉多余的培養(yǎng)基。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231 細(xì)胞,制成1.5×105 個(gè)/mL的細(xì)胞懸液,分別給予0(空白對(duì)照組)、5、10、20 μmol/L的EP-3P(EP-3P不同濃度組)刺激,每個(gè)濃度組設(shè)置3 個(gè)平行組。然后分別取上述給藥后的細(xì)胞懸液100 μL 加入到Transwell 小室上層,下層中加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基700 μL。將細(xì)胞侵襲小室置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,然后以4%多聚甲醛固定30 min,再用1%結(jié)晶紫染色30 min 后,于倒置顯微鏡下觀察穿過基底膜的侵襲細(xì)胞。每個(gè)樣本計(jì)數(shù)5 個(gè)視野,取平均值作為檢測(cè)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

    2.5 EP-3P對(duì)MDA-MB-231 細(xì)胞凋亡的影響

    采用Annexin Ⅴ-FITC/PI 雙染色法進(jìn)行檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231 細(xì)胞,常規(guī)制備細(xì)胞懸液后,將細(xì)胞以1×105個(gè)/孔的密度接種于6 孔板中,培養(yǎng)24 h后,按照“2.3”項(xiàng)下方法分組與給藥。繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后,收集、洗滌細(xì)胞,先后加入Annexin Ⅴ-FITC、PI 試劑各5μL,混勻,于室溫下避光反應(yīng)15 min后,采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況,并通過Flow jo 10 軟件分析各組細(xì)胞的凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    2.6 EP-3P對(duì)MDA-MB-231 細(xì)胞周期分布的影響

    采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDAMB-231 細(xì)胞,按照“2.5”項(xiàng)下方法接種、分組、給藥、培養(yǎng)并收集。制備細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL的單細(xì)胞懸液,離心(2 000 r/min,5 min)去除上清,加入70%冷乙醇500 μL,4 ℃固定過夜;用預(yù)冷的PBS洗細(xì)胞3 遍,除去殘留的乙醇;加入500 μL 提前配制好的PI/RNase A染色液(臨用前PI 與RNase A染色液按9 ∶1 的體積比配制),37 ℃避光孵育30 min 進(jìn)行染色,采用流式細(xì)胞儀檢測(cè),并通過Flow jo 10軟件分析細(xì)胞周期分布。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    2.7 EP-3P對(duì)MDA-MB-231 細(xì)胞中凋亡和侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

    采用Western blot 法進(jìn)行檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231 細(xì)胞,制成單細(xì)胞懸液后,以8×105個(gè)/皿的細(xì)胞密度接種于直徑為60 mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中,待細(xì)胞培養(yǎng)至貼壁后,將細(xì)胞分為空白對(duì)照組(0 μmol/L)和EP-3P 不同濃度組(5、10、20 μmol/L)。藥物作用24 h后,每個(gè)培養(yǎng)皿加入PMSF 和RIPA 裂解液的混合液(PMSF 和RIPA裂解液的體積比為1 ∶100)500 μL,于冰上裂解細(xì)胞30 min,提取細(xì)胞中總蛋白,采用BCA法進(jìn)行蛋白定量,并將蛋白高溫變性。取變性后的蛋白樣品30 μg,在80 V電壓下進(jìn)行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,在300 mA恒流下將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上,用5%的脫脂奶粉在室溫下封閉2 h;加入內(nèi)參蛋白GAPDH一抗(稀釋比例1 ∶5 000)和目標(biāo)蛋白Bcl-2、Bax、Cyt-C、caspase-3、cleaved-caspase-3、MMP-2、MMP-9 一抗(稀釋比例均為1 ∶1 000),4 ℃孵育過夜;以TBST 緩沖液漂洗10 min×3 次,加入相應(yīng)二抗(稀釋比例均為1 ∶3 000),室溫孵育2 h;以TBST緩沖液漂洗10 min×3 次,加ECL發(fā)光液,然后于凝膠成像儀中成像。用Image J V1.8.0 軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行分析,以目標(biāo)蛋白條帶灰度值與內(nèi)參蛋白(GAPDH)條帶灰度值的比值表示目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    采用SPSS 19.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用x±s 表示,多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

    3 結(jié)果

    3.1 EP-3P對(duì)MDA-MB-231 細(xì)胞增殖的影響結(jié)果

    與空白對(duì)照組比較,不同濃度EP-3P 作用于MDA-MB-231 細(xì)胞24、48、72 h 后,細(xì)胞的增殖抑制率均不同程度地升高,并呈一定的濃度和時(shí)間依賴趨勢(shì)。其中,除EP-3P 1.25 μmol/L組細(xì)胞在培養(yǎng)24 h 時(shí)的增殖抑制率外,其余各濃度EP-3P組細(xì)胞在藥物作用24、48、72 h后的增殖抑制率均顯著升高(P<0.05 或P<0.01)。各組細(xì)胞的增殖抑制率測(cè)定結(jié)果見表1。

    3.2 EP-3P對(duì)MDA-MB-231 細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響結(jié)果

    與空白對(duì)照組比較,EP-3P 10、20 μmol/L 組細(xì)胞的遷移愈合率顯著降低(P<0.01),EP-3P 5、10、20 μmol/L組穿過基底膜的侵襲細(xì)胞數(shù)顯著減少(P<0.01),且均呈一定的濃度依賴趨勢(shì)。結(jié)果見圖2、圖3和表2。

    3.3 EP-3P對(duì)MDA-MB-231 細(xì)胞凋亡的影響結(jié)果

    與空白對(duì)照組比較,EP-3P 5、10、20 μmol/L 組細(xì)胞的凋亡率顯著升高(P<0.05),且呈一定的濃度依賴趨勢(shì)。結(jié)果見圖4、表3。

    3.4 EP-3P對(duì)MDA-MB-231 細(xì)胞周期分布的影響結(jié)果

    與空白對(duì)照組比較,EP-3P 5、10、20 μmol/L組G0/G1期細(xì)胞占比顯著降低(P<0.05 或P<0.01),G2/M期細(xì)胞占比顯著升高(P<0.05 或P<0.01),且呈一定的濃度依賴趨勢(shì)。結(jié)果見圖5、表3。

    3.5 EP-3P對(duì)MDA-MB-231 細(xì)胞中凋亡和侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的影響結(jié)果

    與空白對(duì)照組比較,EP-3P 5、10、20 μmol/L 組細(xì)胞中Bcl-2、MMP-9 蛋白的表達(dá)水平顯著降低(P<0.01),而Bax 蛋白的表達(dá)水平顯著升高(P<0.01);EP-3P 10、20 μmol/L 組細(xì)胞中caspase-3、MMP-2 蛋白的表達(dá)水平顯著降低(P<0.01),而Cyt-C、cleaved-caspase-3 蛋白的表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)。結(jié)果見圖6、表4。

    4 討論

    EP 具有抗病毒、抗癌、抗真菌等藥理作用[15-16]。近年來,EP的抗腫瘤作用也逐漸受到研究者的關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn),EP 可抑制17β-雌二醇誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞MCF-7的增殖活性[17]。El-Sherif 等[5]首次從埃及樹脂靈芝菌絲體中分離得到EP,并發(fā)現(xiàn)其在體外可顯著抑制乳腺癌細(xì)胞MCF-7 的增殖。據(jù)文獻(xiàn)[18]報(bào)道,EP可抑制乳腺癌細(xì)胞SUM-149、MDA-MB-231 的增殖,誘導(dǎo)其凋亡,并可抑制細(xì)胞中蛋白激酶B、細(xì)胞周期蛋白D1 和原癌基因c-Myc 調(diào)控蛋白的表達(dá),從而抑制細(xì)胞的遷移和侵襲。然而EP的抗腫瘤作用及機(jī)制尚不清楚。本課題組在前期藥物篩選時(shí)發(fā)現(xiàn),EP的衍生物EP-3P對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)為(11.29±3.13)μmol/L,對(duì)正常人乳腺細(xì)胞CCD-1095Sk 的IC50 為(54.73±2.48)μmol/L;而EP 對(duì)MDA-MB-231 細(xì)胞的IC50 為(20.54±1.98)μmol/L。上述結(jié)果表明,EP-3P 對(duì)MDA- MB-231細(xì)胞增殖的抑制作用明顯強(qiáng)于EP,且其對(duì)正常乳腺細(xì)胞的毒性作用較弱。本研究中MTT實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示,EP-3P 作用后對(duì)MDA-MB-231 細(xì)胞的增殖有一定抑制作用,可將細(xì)胞周期阻滯于G2/M期,還可有效抑制細(xì)胞的遷移和侵襲,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,并具有一定的濃度依賴趨勢(shì)。

    Bcl-2 家族是細(xì)胞凋亡研究中最重要的癌基因之一,其在線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡通路中起著重要作用[19]。該家族中的Bcl-2 和Bax 蛋白分別具有抑制和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用,可通過調(diào)節(jié)線粒體膜的通透性來調(diào)控線粒體凋亡途徑[20]。在正常狀態(tài)下,Cyt-C 位于線粒體外膜,當(dāng)外膜通透性增加時(shí),Cyt-C 進(jìn)入細(xì)胞質(zhì),引起caspase 級(jí)聯(lián)放大反應(yīng),導(dǎo)致caspase-3 進(jìn)入活化狀態(tài)(即cleaved-caspase-3);活化的caspase-3 可裂解細(xì)胞內(nèi)生物酶結(jié)構(gòu)中的天冬氨酸殘基肽鍵,使酶失活,從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[21]。本研究結(jié)果顯示,EP-3P作用于MDA-MB-231細(xì)胞后,可以誘導(dǎo)細(xì)胞中Bcl-2、caspase-3 蛋白表達(dá)下調(diào)和Bax、Cyt-C、cleaved-caspase-3 蛋白表達(dá)上調(diào)。該結(jié)果提示,EP-3P可能通過上調(diào)細(xì)胞中Bax 蛋白表達(dá)、下調(diào)細(xì)胞中Bcl-2 蛋白表達(dá),介導(dǎo)線粒體的內(nèi)源性途徑來誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡。

    MMP-2 和MMP-9 是MMPs 家族的重要成員,可參與腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的調(diào)控。已有相關(guān)報(bào)道證實(shí),MMP-2 和MMP-9 的高表達(dá)可能與乳腺癌的高轉(zhuǎn)移潛能有關(guān)[22-23]。本研究發(fā)現(xiàn),EP-3P 可以有效抑制MDA-MB-231 細(xì)胞中MMP-2 和MMP-9 的蛋白表達(dá),表明EP-3P 可能是通過抑制MMP-2 和MMP-9 表達(dá)從而影響MDA-MB-231 細(xì)胞的遷移和侵襲。

    綜上所述,EP-3P 可通過線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性caspase途徑抑制乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231 的增殖、遷移和侵襲,并可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。本研究結(jié)果為后續(xù)研究EP-3P 抗乳腺癌作用機(jī)制提供了一定參考,但本研究?jī)H采用單一的乳腺癌細(xì)胞系進(jìn)行了實(shí)驗(yàn),有關(guān)EP-3P 對(duì)其他腫瘤細(xì)胞及其抗乳腺癌的相關(guān)機(jī)制有待進(jìn)一步探討。同時(shí),衍生物EP-3P 抑制乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和凋亡的作用是否優(yōu)于其先導(dǎo)化合物EP,尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。

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