螺旋桿菌的檢測以及它對小鼠肝臟的影響

趙莉媛 呂奇鵬

(1.青海畜牧獸醫(yī)職業(yè)技術學院,青海湟源 512100;2.西寧市野生動物園,青海西寧 510005)

螺旋桿菌的檢測以及它對小鼠肝臟的影響

趙莉媛1呂奇鵬2

(1.青海畜牧獸醫(yī)職業(yè)技術學院,青海湟源 512100;2.西寧市野生動物園,青海西寧 510005)

近年來,螺旋桿菌的感染有上升的趨勢,越來越引起臨床的重視,實驗室采取的鑒定方法尤為重要。目前用的比較多的有微生物分離培養(yǎng),血清學方法,形態(tài)學方法,PCR檢查。在過去的十幾年中,從小鼠體內能分離出來的螺旋桿菌大致有五種,本文主要涉及肝型和膽囊型螺旋桿菌的PCR鑒定。此外,由于感染螺旋桿菌的小鼠并不一定就患有疾病,通常在體外沒有明顯的臨床癥狀,研究人員目前還未深究它在體內是否帶來影響,因此本文也會討論螺旋桿菌對小鼠肝臟的影響。

螺旋桿菌;小鼠;鑒定;PCR;影響;肝臟

1 螺旋桿菌鑒定方法簡介

由于HP與人類常見病密切相關且在人群中感染率高，因而受到重視，各種檢測方法也應運而生，常用的檢測方法有微生物學方法，血清學方法，形態(tài)學方法和PCR法，但各種檢測方法都不盡理想，本文主要介紹PCR法。此方法原理就是基因診斷，利用PCR技術擴增DNA來判斷是否帶有螺旋桿菌。是目前靈敏度最高的，檢測速度最快的，使用最廣的檢測螺旋桿菌的方法。

2 螺旋桿菌感染對肝臟的影響

螺桿菌感染與肝腸疾病有關，大多數(shù)新螺桿菌屬成員都是先在動物及禽類等體內分離出來的，動物實驗還發(fā)現(xiàn)腸道螺桿菌能夠進入血液，易位至肝臟引起炎癥和腫瘤，這在免疫力低下機體內更為常見。

3 實驗部分

3.1 實驗步驟（感染螺旋桿菌的小鼠若干只）

3.1.1 病鼠外觀及剖檢變化：病鼠頸部、背部、大腿外側被毛脫落，脖頸部皮膚出現(xiàn)不規(guī)則潰爛；眼球突出，晶體渾濁，似失明；頜下淋巴結腫大并有針尖大小出血點；胃粘膜出現(xiàn)潰瘍，伴有針尖大小出血點；肝臟腫大，有灰白色大小不等壞死灶；脾臟腫大，色素沉著，有灰白色大小不等壞死灶；直腸脫落，腸粘膜出血；肛周潰爛，排便困難，糞便干燥帶血成顆粒狀。

3.1.2 細菌學培養(yǎng)：分別取病鼠肝臟、直腸、回盲部內容物，加入2號營養(yǎng)肉湯（已加相關抗生素，為選擇性培養(yǎng)基），用研磨器勻化后，1000r離心5 min，棄沉淀；上清經(jīng)0.45 m微孔濾膜過濾后，12000r離心2 min；棄上清，沉淀以100 uL的2號營養(yǎng)肉湯懸浮混勻；移取5Oμl樣本接種血平皿。血平皿中添加10μg/ml萬古霉素；2.5μg/ml多粘菌素B；5μg/ml甲氧芐氨嘧啶；2μg/ml兩性霉素。37℃ 微需氧環(huán)境（85%N，10%CO2，5%O2）培養(yǎng)4～6d。

3.1.3 細菌分離：螺旋桿菌的菌落形態(tài)很特殊，在培養(yǎng)平皿上菌落如針尖狀，折光呈紅色；經(jīng)革蘭染色呈陰性，油鏡下觀察呈月牙形或鳥翼狀的獨特形態(tài)。將分離菌株純化后做生化分析。

3.1.4 螺旋桿菌DNA提?。航?jīng)形態(tài)觀察診斷為螺旋桿菌，刮下其平皿中的菌落，用“小量細菌DNA抽提試劑盒”純化提取細菌DNA。

3.1.5 PCR擴增及序列測定：引物o508，o509的擴增條件：22μl反應體系中包括2μlDNA模版；10X PCR Buffer II2.2μl；20 mM forward o508 1.1μl；20 mM reverse o509 1.1μl；5 U/ml HOTSTAR Taq 0.12μl；orange dye 3.32μl；2.5 mM dNTP 1.76μl；25mM MgCl2 2.2μl；Q Buffer 2.2ul；H2O 6μl；擴增程序：95℃15 min；94℃ 30 sec；60℃ 30 sec；72℃ 1min；循環(huán)35次后72℃2min；擴增產(chǎn)物分析：反應結束后，取5μl擴增產(chǎn)物，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。在紫外燈下觀察，使用數(shù)字凝膠成像系統(tǒng)記錄實驗結果。將陽性PCR擴增產(chǎn)物回收純化后分別送去測序。

3.2 實驗結果

3.2.1 細菌學檢查：從病鼠的肝、腸樣本中均分離到疑似菌株。革蘭氏染色結果形狀為鳥翼狀。在哥倫比亞血瓊脂平板上，分離菌株為灰白色、半透明、微凸起、不溶血的小菌落。純培養(yǎng)物經(jīng)革蘭染色鏡檢，發(fā)現(xiàn)革蘭氏陰性細小螺旋桿狀細菌，直徑為0.2～1.5μm。各項生化反應結果經(jīng)鑒定完全符合肝螺桿菌的特性。

3.2.2 PCR檢測：如圖1。測序結果顯示：肝螺桿菌鼠源性分離菌株與Genbank中肝螺桿菌相應的基因序列核苷酸同源性高達99%。

圖1 PCR擴增螺旋桿菌屬16s rRNA與肝螺桿菌16S rRNA基因

3.2.3 病理組織學檢查：感染小鼠肝臟的肝細胞腫大，出現(xiàn)大小不等的空泡，部分胞核深染，局部壞死，肝小葉脂肪變性。淋巴細胞散在分布，脾巨噬細胞增多小葉間隔不清晰。

4 結論

本研究選用了適篩檢肝螺桿菌的分離培養(yǎng)的方法，建立了肝螺桿菌的多重PCR檢測方法，并結合病理學檢查方法，對該菌的生物學特性和分子生物學特性進行初步探討，這為進一步研究肝螺桿菌的致病機理及在我國開展流行病學調查提供了有效的科學依據(jù)。

[1]徐叔云主編.藥理實驗方法學[M.]人民衛(wèi)生出版社，1982.

[2]施新猷.大鼠各型放射病時心血管功能的變化[J].中華放射醫(yī)學與防護雜志，1985，5（3）：160.

[3]施新猷.現(xiàn)代實驗動物在醫(yī)學科學研究中的應用[J].第四軍醫(yī)大學學報，1982，3（2）：177.