EFS20/40和GP25玻璃化法冷凍保存小鼠體外受精2細(xì)胞期胚的效果

樸香麗，杜文敬，王春生，尹洪哲，樸善花*(.吉林省和龍市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，吉林 和龍 33500；.東北林業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 50040)

實(shí)驗(yàn)研究

EFS20/40和GP25玻璃化法冷凍保存小鼠體外受精2細(xì)胞期胚的效果

樸香麗1，杜文敬2，王春生2，尹洪哲1，樸善花2*
(1.吉林省和龍市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，吉林 和龍 133500；2.東北林業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

為了篩選適合用于冷凍保存小鼠體外受精2細(xì)胞期胚胎的方法，本研究采用EFS20/40法和GP25法對體外受精小鼠2細(xì)胞胚進(jìn)行冷凍保存，并經(jīng)解凍后進(jìn)行體外培養(yǎng)，觀察其胚胎發(fā)育至擴(kuò)張囊胚的能力。其結(jié)果，雖然兩種方法冷凍解凍后的正常胚胎回收率相近，但采用EFS20/40法冷凍解凍的胚胎在體外發(fā)育至擴(kuò)張囊胚比率(84.9%)顯著高于GP25法的54.8%(P<0.05)。表明EFS20/40法適合用于小鼠體外受精2細(xì)胞期胚胎的冷凍保存。

小鼠；體外受精；2細(xì)胞期胚；玻璃化冷凍

自Rall等[1]發(fā)明了簡便、快速和易于推廣的胚胎玻璃化冷凍保存法以來，已先后開發(fā)多種胚胎玻璃化冷凍方法，其中EFS20/40法[2]和GP25法[3]是常用兩種方法。為此，本研究分別利用EFS20/40法和GP25法對小鼠體外受精2細(xì)胞期胚胎進(jìn)行冷凍保存, 并觀察其在解凍后的體外發(fā)育能力, 以期篩選適用于小鼠不同發(fā)育時(shí)期胚胎的最佳冷凍保存方法。

1 材料與方法

1.1 小鼠體外受精和2細(xì)胞期胚胎獲得

利用改良的M16培養(yǎng)液[4]，在培養(yǎng)皿(35 mm×14 mm ) 中注入200 LL上述各培養(yǎng)液, 并用液體石蠟封蓋, 在CO2培養(yǎng)箱(37℃、5%CO2、95%空氣、加濕) 中平衡12 h以上。選擇性成熟的雄性ICR系小鼠, 采用頸椎脫臼法處死, 取附睪尾導(dǎo)入預(yù)平衡的培養(yǎng)液中, 參照常規(guī)法配制體外受精用精子液(精子密度約為50萬個(gè)/mL) , 并進(jìn)行1～1.5 h 的預(yù)培養(yǎng)；與其同時(shí), 選擇性成熟的ICR雌性小鼠, 間隔48 h注射PMSG和hCG進(jìn)行超排處理, 在注射hCG后的14～16 h , 從輸卵管中采取卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體, 導(dǎo)入預(yù)培養(yǎng)的精子液中進(jìn)行體外受精。經(jīng)24 h體外受精后, 將發(fā)育至正常的2細(xì)胞者判定為受精卵, 用于以下的玻璃化冷凍保存。

1.2 冷凍保存液和解凍液的制備

(1)EFS20液: 用PB1溶液[5]配制含20%乙二醇V/V)、18% Fico ll70(W/V)和3 mol/L蔗糖的溶液;

(2)EFS40液: 用PB1溶液配制含40%乙二醇(V/V)、18% Ficoll 70(W/V)和3 mol/L蔗糖的溶液；

(3)GP10液: 用PB1溶液配制含10%甘油(V/V)和20%丙二醇(V/V)的溶液；

(4)GP25液: 用PB1溶液配制含25% 甘油(V/V)和25% 丙二醇(V/V)的溶液；

(5)解凍液：用PB1液配制含有0.5 mol/L蔗糖的溶液。

將已配制的上述溶液, 用0.45μm微孔濾器過濾后, 在4%下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 胚胎的玻璃化冷凍和解凍

1.3.1 胚胎的冷凍

將上述獲得的2細(xì)胞期胚分別采用EFS20/40法和GP25法進(jìn)行冷凍保存。

(1)EFS20/40法：將上述的2細(xì)胞期胚胎用EFS20液預(yù)處理2 min，然后用EFS液處理30 s并裝入0.25 mL冷凍細(xì)管(參見下圖)后, 直接投入液氮中保存。

圖1 含有胚胎的冷凍細(xì)管

(2)GP25法：將上述的2細(xì)胞期胚胎，用GP10液預(yù)處理10 min后，參照上述圖法裝入含有GP25的0.25 mL冷凍細(xì)管并直接投入液氮中保存。

1.3.2 冷凍胚胎的解凍

將冷凍細(xì)管從液氮中取出, 在約35%溫水中快速解凍, 然后將管內(nèi)的胚胎導(dǎo)入0.5 mol/L蔗糖溶液中并保持5 min, 將胚胎移入PB1液并用其清洗3次后進(jìn)行下列體外培養(yǎng)。

1.4 胚胎的體外培養(yǎng)

將經(jīng)冷凍-解凍的2細(xì)胞期胚，導(dǎo)入在二氧化碳培養(yǎng)箱(37%, 5%CO2, 95%空氣,100% 濕度)預(yù)平衡12 h的35 mm培養(yǎng)皿內(nèi)的改良M16培養(yǎng)液[4]液滴(200 μL)中, 并置于二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng), 觀察發(fā)育至擴(kuò)張囊胚的能力。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用χ2檢驗(yàn)法對數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 EFS20/40和GP25法冷凍-解凍后胚胎回收率

表1結(jié)果顯示, 當(dāng)用EFS20/40和GP25 兩種方法冷凍保存小鼠2細(xì)胞期胚胎。對其進(jìn)行解凍后，分別可回收96.1%和92.5%的正常2細(xì)胞期胚胎，兩者差異不顯著。

表1 用EFS法和GP25法冷凍-解凍后的胚胎回收率

2.2 EFS20/40和GP25法冷凍保存的小鼠2細(xì)胞期胚的體外發(fā)育

表2結(jié)果顯示, 用EFS20/40法和GP25法冷凍保存的小鼠體外受精2細(xì)胞期胚胎，經(jīng)體外培養(yǎng)后，發(fā)育至擴(kuò)張囊胚的比率分別為84.9%和54.8%，EFS20/40法顯著高于GP25法(P<0.05)。

表2 用EFS法和GP25法冷凍-解凍的2細(xì)胞期胚胎的體外發(fā)育能力

與GP25法相比差異顯著*(P<0.05) 。

3 討論

自玻璃化冷凍保存小鼠胚胎獲得成功[1]以來, 胚胎冷凍保存技術(shù)獲得了不斷改良和完善,已相繼開發(fā)了Kasai等的EFS20/40法[2]和EFS40法[6][乙二醇(ethylene glyco,l EG)、聚蔗糖70(Fico ll70)、和蔗糖(sucrose)制備冷凍]、Nakagata等[7]的DAP213法[用DMSO、乙酰胺(acetamide)和丙二醇(propy leneg lycol)制備冷凍保護(hù)劑]和Schefen等[3]的GP25法[用甘油和丙三醇制備冷凍保護(hù)液]等，并相應(yīng)獲得良好的小鼠胚胎冷凍保存效果。

據(jù)梁洋等[8]采用EFS40法、EFS20/40法、DAP213法和GP25對小鼠不同發(fā)育時(shí)期的體內(nèi)受精胚胎進(jìn)行冷凍保存效果進(jìn)行比較的結(jié)果，EFS20/40法適合用于小鼠的2細(xì)胞期冷凍保存, 而EFS20/40和EFS40法均適合用于4～8細(xì)胞期胚和桑椹胚的冷凍。表明獲得良好的冷凍效果與所采取的冷凍方法密切相關(guān)。

目前尚未見到玻璃化冷凍方法對體外受精胚胎冷凍效果影響的報(bào)道。為此，本研究分別利用EFS20/40法和GP25法對小鼠體外受精2細(xì)胞期胚胎進(jìn)行冷凍保存, 并觀察其在解凍后的體外發(fā)育能力。其結(jié)果，雖然兩種方法冷凍解凍后的正常胚胎回收率相近，但采用EFS20/40法冷凍解凍的胚胎在體外發(fā)育至擴(kuò)張囊胚比率(84.9%)顯著高于GP25法(54.8%)(P<0.05)。結(jié)果表明，與GP25法相比EFS20/40法更適合用于小鼠體外受精2細(xì)胞期胚胎的冷凍保存。采用EFS40法和DAP213法是否可以提高小鼠體外受精2細(xì)胞期胚胎的冷凍效率有待于進(jìn)一步探討。

[1] Rall W F, Fahy G M. Ice-free cryopreservation of mouse embryos at-196℃ by vitrification[J]. Nature, 1985, 313: 573- 575.

[2] Mukaida T W, Takahashi K, et al. Vitrification of human embryos based on the assessment of suitable conditions for cell mouse embryos[J]. Human Reproductions, 1998, 13(10): 2874- 2879.

[3] Scheffen B, Zwalmen P M assip A. A simple and efficient procedure for preservation of mouse embryos by vitrification[J].Cryoletters,1986,7: 260- 269.

[4] 安鐵洙,譚建華,岳占碰,等.小鼠體外受精及胚胎發(fā)育的影響因素[J]. 中國獸醫(yī)學(xué)報(bào),2002,22(2):191-103.

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[7] Nakagata N. High survival rate of unfertilized mouse oocytes after vitrification[J]. Reproduction, 1989, 87: 479- 483.

[8] 梁洋， 杜文敬， 王春生，等. 小鼠早期胚胎的EFS20/40、EFS40、DAP213和GP25玻璃化法冷凍保存[J].江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2010, 32(6) : 1248- 1252.

TheEffectionofEarlyMouseEmbryoson2CellStageinVitroFertilizationbyVitrificationUsingEFS20/40andGP25Methods

PIAO Xiang-li1, DU Wen-jing2, WANG Chun-sheng2，YIN Hong-zhe1, PIAO Shan-hua2
(1.Helong City Animal Health Institute，Helong 133500, Jilin Province, China;2.College of Life Science, Northeast Forestry University, Harbin 150040, Heilongjiang Province, China)

2 cell stage embryos in vitro fertilization from mouse were vitrified using EFS20/40, and Schefen-GP25 methods followed by thawing the embryos to evaluate the ability of expanded blastocysts to filter the better suitable vitrification scheme. The results showed that the blastocyst formation rate by EFS20/40 method (84.9%) was significantly higher than those by Schefen-GP25 methods (P<0.05) after vitrication-thawing 2-cell embryos, though the recovery rate of normal embryos is similar. These results indicated that EFS20/40 method was the better suitable for the 2-cell stage embryos in vitro fertilization from mice cryopreservation.

mouse; in vitro fertilization; 2-cell-stage-embryo; vitrification

S814.3

A

1005-2739(2017)06-0003-03

2017-09-17

黑龍江自然基金項(xiàng)目(C2016012)

樸香麗(1975-)，女，高級獸醫(yī)師。

E-mail:hljd4220144@163.com

*通信作者： 樸善花，女，高級畜牧師。

E-mail:antiezhu@qq.com