豬附紅細(xì)胞體SYBR Green I熒光定量PCR檢測方法的建立

伍生軍, 倪婷婷, 張守發(fā), 許應(yīng)天, 孫興忠, 薛書江*

(1.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院,吉林 延吉 133002;2.白城市動物疫病預(yù)防控制中心,吉林 白城 137000)

豬附紅細(xì)胞體SYBRGreenI熒光定量PCR檢測方法的建立

伍生軍1, 倪婷婷1, 張守發(fā)1, 許應(yīng)天1, 孫興忠2, 薛書江1*

(1.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院,吉林 延吉 133002;2.白城市動物疫病預(yù)防控制中心,吉林 白城 137000)

為建一種快速、高效、靈敏的豬附紅細(xì)胞體(M.suis)檢測方法。本研究根據(jù)GenBank中的豬附紅細(xì)胞體α-烯醇化酶(Eno)基因(序列號:AB265823.1),設(shè)計并合成了1對引物P5和P6,通過常規(guī)PCR方法對Eno基因中的一段序列進(jìn)行擴(kuò)增，并將其純化后的PCR產(chǎn)物克隆入pMD-18T載體中,從而構(gòu)建重組質(zhì)粒。以陽性重組質(zhì)粒為模板,建立了豬附紅細(xì)胞體SYBR GreenⅠ熒光定量PCR檢測方法,并對其靈敏性、特異性進(jìn)行檢測。在1.44×106～1.44×102拷貝/μL范圍內(nèi)具有較好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2=0.965，檢測到的濃度下限為1.44拷貝/μL。特異性試驗中僅對豬附紅細(xì)胞體的檢測結(jié)果呈陽性,而對豬肺炎支原體、弓形蟲、豬鏈球菌、豬呼吸與繁殖綜合征病毒的檢測結(jié)果均呈陰性。重復(fù)性試驗結(jié)果表明，其組內(nèi)和組間變異系數(shù)均小于2.0%。用該檢測方法對49份豬附紅細(xì)胞體疑似血液樣品進(jìn)行檢測,所建立的熒光定量PCR方法檢測的陽性率為40.8%(20/49),高出常規(guī)PCR方法檢測的陽性率1.33倍。SYBR GreenⅠ熒光定量PCR檢測方法的成功建立,為豬附紅細(xì)胞體感染的早期診斷及定量分析提供了可靠依據(jù)。

豬附紅細(xì)胞體;SYBR Green Ⅰ;熒光定量PCR;Eno基因

豬附紅細(xì)胞體病是由寄生在動物紅細(xì)胞表面、血漿和骨髓等部位的病原體—附紅細(xì)胞體所引起的1種人獸共患傳染病。貧血、黃疸、發(fā)熱等是該病的主要致病癥狀，正常狀況下發(fā)病率和死亡率較低，隱性感染率較高，多伴隨其他疾病以混合感染形式出現(xiàn)。慢性病例能降低母豬的繁殖能力，同時導(dǎo)致育肥豬生長遲緩，增加呼吸性和腸道性疾病的發(fā)病率[1-3]。近年來，豬附紅細(xì)胞體病的流行給各地方畜牧產(chǎn)業(yè)帶來巨大的損失。目前，該病診斷的常規(guī)檢測方法主要有血液壓片鏡檢、血液涂片染色鏡檢、血清學(xué)方法和PCR等[4-6]。傳統(tǒng)的鏡檢法出于紅細(xì)胞變形、染料沉淀和非病原微生物染色干擾等因素常出現(xiàn)假陽性結(jié)果[7]，而Gwaltney S M等最早建立的M.suis的PCR診斷方法對動物傳染病只能進(jìn)行定性分析，而無法做到實時定量分析[8]。近年來國內(nèi)興起的熒光定量技術(shù)具有高度特異性、光譜技術(shù)的高敏感性和精確性等特點，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、藥物研究、病原菌的檢測等體外擴(kuò)增技術(shù)[9-10]。常用的熒光定量技術(shù)主要有SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR法和Taqman探針熒光定量PCR法。張長瑩、李丹丹等分別針對不同病原體建立了Taqman探針熒光定量PCR法，但該方法操作繁瑣，如Taqman探針的設(shè)計過程等；同時，對實驗經(jīng)費和儀器設(shè)備的要求較高[11-12]。而孫俊穎、曹貝貝、趙麗等和徐衛(wèi)松等建立的SYBR Green Ⅰ 熒光定量PCR法在實際應(yīng)用中更快捷，且經(jīng)濟(jì)實用[13-16]。故本試驗以Eno基因保守序列為靶基因，設(shè)計相應(yīng)引物，成功建立了快速檢測豬附紅細(xì)胞體的SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR法。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 主要試劑

pMD 18-T載體、凝膠回收試劑盒和SYBR Premix ExTaq酶均為寶生物(大連)生物工程公司產(chǎn)品。

1.1.2 樣品及菌株

豬附紅細(xì)胞體陽性血液樣本采自吉林省延邊某豬場；弓形蟲(T.gondii)、豬鏈球菌(S.suis)、豬肺炎支原體(M.hyopneumoniae)、豬呼吸與繁殖綜合征病毒(PRRSV)由延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實驗室保存。

1.2方法

1.2.1 引物設(shè)計與合成

根據(jù)豬附紅細(xì)胞體基因組(登錄號：NC_015153)中的Eno基因序列，設(shè)計1對引物如下，由上海生工生物工程有限公司合成。預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小約為170 bp。

P5：5′-AGGTAACCCAACCGTAGCAT-3′；

P6：5′TCTTAACTCCCTTTCCTCCAA-3′。

1.2.2 熒光定量PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化

優(yōu)化后的擴(kuò)增循環(huán)參數(shù)設(shè)置如下：95 ℃，5 min；95 ℃ 10 s、95 ℃ 30 s，共40個循環(huán)數(shù)；延伸時采集熒光信號；采用優(yōu)化后的Taq酶及引物添加濃度。

1.2.3 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備

用常規(guī)PCR擴(kuò)增目的基因片段，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后將所需目的片段回收，克隆至pMD 18-T載體，最后轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞中，37 ℃搖均直至菌液混濁后提取質(zhì)粒。根據(jù)拷貝數(shù)=[質(zhì)量(g)/分子質(zhì)量(Da)]×6.0×1023，阿伏伽德羅常數(shù)6.02×1023轉(zhuǎn)換成該核酸片段拷貝數(shù)/μL。將質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍梯度稀釋(1.44×107～1.44×100拷貝/μL)。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將標(biāo)準(zhǔn)重組質(zhì)粒用滅菌去離子水作1.44×106～1.44×102拷貝/μL梯度稀釋，各取1 μL進(jìn)行擴(kuò)增。以起始模板拷貝數(shù)的對數(shù)為X軸，Ct值為Y軸建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，分析測得Ct值，確定檢測范圍。

1.2.5 特異性試驗

用本試驗建立的SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR方法對M.suis DNA檢測分析，并以弓形蟲、豬鏈球菌、豬肺炎支原體和豬繁殖與呼吸綜合癥病毒等的DNA樣本作為對照組，驗證該方法的特異性。

1.2.6 敏感性試驗

對選取的8個稀釋梯度1.44×107～1.44×100拷貝/μL的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，確定該方法的濃度檢測下限。

1.2.7 重復(fù)性試驗

選取稀釋濃度為2.26×105、2.26×104和2.26×103拷貝/μL的重組質(zhì)粒，分別以此為模板進(jìn)行熒光定量PCR分析，每個樣品進(jìn)行3次重復(fù)性實驗，根據(jù)所得標(biāo)準(zhǔn)曲線計算初始模板DNA含量，最后與實際測得模板量對比，得以鑒定此方法的重復(fù)性。

1.2.8 臨床樣本檢測

用常規(guī)PCR方法和SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR方法，對采自吉林省延邊共49份豬血液樣品進(jìn)行檢測，并對2者的檢出率進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1熒光定量PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化

優(yōu)化后的反應(yīng)體系中，各組分含量為：上下游引物各1.2 μL，重組質(zhì)粒模板2 μL，SYBR Premix ExTaq10.4 μL，ddH2O 5.2 μL,擴(kuò)增參數(shù)為95 ℃，5 min；95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s，共40個循環(huán)數(shù)，該條件下Ct至最小，擴(kuò)增效果最好。

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以獲得的Ct值為Y軸，標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)為X軸，制作出標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品初始拷貝數(shù)與Ct值之間的線性關(guān)系為：Ct=-3.138 x+39.65，標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率為-3.138，相關(guān)系數(shù)為0.965，軸截距為39.65，結(jié)果顯示，模板濃度在1.44×106～1.44×102拷貝/μL范圍內(nèi)具有較好的線性關(guān)系。此外，得到的溶解曲線只有目的基因擴(kuò)增片段產(chǎn)生的單一特異峰，無非特異擴(kuò)增峰或引物二聚體，陰性對照也為水平線，且熔解溫度Tm為(81.5±0.5) ℃(圖1)。

圖1 M.suis熒光定量PCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線及溶解曲線

2.3特異性試驗

以4種參考菌株為模板作為對照組，熒光定量PCR進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示只有M.suis能擴(kuò)增出特異性熒光“S”型曲線，而對照組則未能擴(kuò)增出特異性“S”型曲線(圖2)。

1～3:豬附紅細(xì)胞體；4：弓形蟲；5：豬鏈球菌；6：豬肺炎支原體；7：豬呼吸與繁殖綜合征病毒

2.4敏感性試驗

以1.44×107～1.44×100拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)品為模板進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，檢測結(jié)果顯示該方法檢測的靈敏度為1.4拷貝/μL(圖3)。

1～8:1.44×107～1.44×100拷貝/μL;NTC:陰性對照組

2.5重復(fù)性試驗

以1.44×105、1.44×104、1.44×103拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行組內(nèi)、組間重復(fù)性試驗，其變異系數(shù)CV值均小于2%，表明該方法具有較好的重復(fù)性(表1)。

表1 SYBR Green I熒光定量PCR的組內(nèi)和組間重復(fù)性試驗結(jié)果

2.6臨床樣品檢測結(jié)果

分別用熒光定量PCR和常規(guī)PCR方法對采集到的49份疑似M.suis血液樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，本試驗建立的熒光定量PCR方法對M.suis的陽性檢出率較常規(guī)PCR更高(表2)。

表2 臨床樣品檢測結(jié)果

3 討論與結(jié)論

Oehlerking和Messick等于2011年分別發(fā)布了KI_3806型和Illinois型豬附紅細(xì)胞體的基因組序列(非體外培養(yǎng))，2者都包含了編碼Eno蛋白的基因[17-18]。Eno蛋白普遍存在于多種細(xì)菌表面，并能夠加強(qiáng)細(xì)菌對宿主的黏附能力。經(jīng)鑒定，豬附紅細(xì)胞體Eno不僅是一種表面蛋白，并且發(fā)現(xiàn)Eno是結(jié)合纖維蛋白溶酶原的表面蛋白，在細(xì)胞黏附和侵襲方面起著重要的作用[19]。因此，為了更準(zhǔn)確地對豬附紅細(xì)胞體進(jìn)行定量檢測，本研究選擇豬附紅細(xì)胞體Eno基因為靶基因，建立了SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR方法。該方法主要通過SYBR Green Ⅰ熒光染料在靶基因延伸的階段，非特異性地結(jié)合到DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中的小溝，進(jìn)而收集熒光信號。根據(jù)所檢測到的熒光強(qiáng)度，可以實時檢測到PCR 產(chǎn)物量[20]。此外,整個反應(yīng)過程是由儀器自動控制并進(jìn)行結(jié)果分析，避免了后續(xù)電泳的步驟，減少污染。雖然該方法容易受到引物二聚體的影響，特異性不如探針法，但是通過設(shè)計精確的特異性引物和試驗條件的優(yōu)化，可以提高該方法的特異性，進(jìn)而滿足臨床試驗的需要[21]。故本試驗選擇豬附紅細(xì)胞體相對保守的Eno基因為靶基因，建立了熒光定量PCR方法。

結(jié)果表明，本研究所建立的SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR方法不僅特異性強(qiáng)，靈敏度高，而且操作簡便，經(jīng)濟(jì)實用。該方法的建立將為豬附紅細(xì)胞體病的檢測和防控提供新的技術(shù)手段。

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DevelopmentofarealtimePCRbasedonSYBRGreenIassayfordetectionofMycoplasmasuis

WU Shengjun1, NI Tingting1, ZHANG Shoufa1, XU Yingtian1, SUN Xingzhong2， XUE Shujiang1*

(1.AgriculturalCollegeofYanbianUniversity,YanjiJilin133002,China;2.BaichengAnimalDiseaseControlCenter,BaichengJilin137000,China)

The experiment was conducted to establish a rapid, efficient and sensitive method for the detection of Mycoplasma disease. A pair of primers P5 and P6 were designed and synthesized according to the Eno gene of M. suis in GenBank (the accession number:AB265823.1). The sequence of α-enolase (Eno) gene was amplified with conventional PCR method, and the purified PCR product was cloned into the pMD-18T vector and sequenced. The real time PCR assay based on SYBR Green I were established with the positive recombinant plasmid DNA as template, and the sensitivity and specificity were also determined. The results showed that the standard curve of the real time PCR displayed a linear correlations in a range from 1.44×106copies/μL to 1.44×102copies/μL of recombinant plasmid. The correlation coefficient was 0.965. The assay was highly sensitive forM.suisdetection with a limit detection concentration of 1.44 copies/μL. The specificity assay showed that no amplification was found for other microbes exceptM.suis. The coefficient of variations was less than 2% in the replicate test.Total 49 blood samples were detected using the established real time PCR and conventional PCR methods. The positive rate using real time PCR method was 40.8% (20/49), which was 1.33 times than that of conventional PCR. The real time PCR based on SYBR Green I method was successfully established, which provided reliable method for the earlyMycoplasmadisease diagnosis and quantitative analysis ofM.suisinfection.

Mycoplasmasuis; SYBR Green I; real time PCR; Eno gene

2017-05-12

國家自然科學(xué)基金(31460657)；吉林省科技廳青年科研基金(20150520129JH)

伍生軍(1993—)，男，湖南常德人，在讀碩士，研究方向為動物疫病分子免疫學(xué)研究。薛書江為通信作者，

E-mail:200103061@ybu.edu.cn

1004-7999(2017)03-0074-05

10.13478/j.cnki.jasyu.2017.03.013

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