纖維素、半纖維素分解菌MYB3和YB1菌株的生物學(xué)特性研究

白 冰， 李光春

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002)

纖維素、半纖維素分解菌MYB3和YB1菌株的生物學(xué)特性研究

白 冰， 李光春*

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002)

對(duì)纖維素、半纖維素分解菌MYB3和YB1菌株在不同溫度和pH值條件下的存活性、酶活性及對(duì)秸稈分解特性進(jìn)行初步研究。結(jié)果表明：MYB3菌株存活的最適條件為35 ℃，pH值8時(shí)；YB1菌株為30 ℃，pH值9。2種菌在發(fā)酵中生成的纖維素酶活性最高，分別達(dá)到19.28 U/mL(MYB3-玉米秸稈-3 d)和19.5 U/mL(YB1-稻草-3 d)；半纖維素酶最高分別達(dá)到6.66 U/mL(MYB3-玉米秸稈-2 d)和17.17 U/mL(YB1-稻草-4 d)；淀粉酶活性最高分別達(dá)到9.84 U/mL(MYB3-玉米秸稈-3 d)和10.65 U/mL(YB1-稻草-5 d)。MYB3菌株適合玉米秸稈發(fā)酵，纖維素、半纖維素分解率(5 d)分別為39.03%和14.67%；YB1菌株適合稻草發(fā)酵，纖維素、半纖維素分解率(5 d)分別為31.53%和37.44%。

玉米秸稈；稻草；纖維素分解菌；半纖維素分解菌；分解特性

我國(guó)是農(nóng)業(yè)大國(guó)，秸稈資源十分豐富，每年的秸稈資源量占生物質(zhì)能源的一半，作為可直接利用的自然資源，年產(chǎn)量約占農(nóng)作物產(chǎn)量的一半[1]。雖然秸稈的產(chǎn)生數(shù)量巨大，但是利用率較低，目前我國(guó)秸稈資源的處理方式完全處于高消耗、高污染、低利用的狀態(tài)。秸稈資源除了一少部分被應(yīng)用于沼氣發(fā)酵、養(yǎng)殖蘑菇等外[2]，全國(guó)每年約有60%以上的秸稈被焚燒或是廢棄[3]，這種處理方式很容易引發(fā)火災(zāi)，產(chǎn)生的煙霧等還影響交通安全，污染大氣環(huán)境，甚至破壞生態(tài)平衡，更是嚴(yán)重浪費(fèi)了寶貴的生物資源。吉林省在全省范圍內(nèi)，禁止露天焚燒農(nóng)作物秸稈，因此更加重視秸稈的合理化處理和資源利用。秸稈處理是社會(huì)和環(huán)境問(wèn)題，更是政府焦慮、社會(huì)關(guān)心、輿論關(guān)注的熱點(diǎn)和難點(diǎn)所在[4]。秸稈中的纖維素占植物干重的35%～50%，全球每年可產(chǎn)生纖維素類干物質(zhì)達(dá)1012t以上[5-6]，其中秸稈飼料是一種很常見的秸稈利用方式。但是秸稈中的纖維素、木質(zhì)素和半纖維素等均不易被家畜消化吸收，且適口性較差[7]，因此家畜利用秸稈的營(yíng)養(yǎng)轉(zhuǎn)化率較低。為了提高飼料轉(zhuǎn)化率，開始研究利用微生物對(duì)秸稈進(jìn)行發(fā)酵后飼喂動(dòng)物。秸稈被微生物發(fā)酵處理后，發(fā)酵產(chǎn)物富含粗糖、粗蛋白及其它微量元素，動(dòng)物適口性較好，易于被家畜、家禽消化，可有效緩解人畜爭(zhēng)糧和資源再利用的問(wèn)題。同時(shí)，促進(jìn)畜牧業(yè)的發(fā)展，具有較顯著的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益[8-10]。目前已有不少研究纖維素分解微生物的報(bào)道[11-14]，其中細(xì)菌是分解纖維素微生物中數(shù)量最多，分布最廣的一類。細(xì)菌具有生長(zhǎng)快、生物活性廣泛、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)[15]。本文主要研究纖維素、半纖維素分解菌的生物學(xué)和分解秸稈特性，為微生物秸稈發(fā)酵飼料提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

供試菌MYB3菌株和YB1菌株是一種纖維素、半纖維素分解菌[16-17]，由延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院土壤環(huán)境技術(shù)研究所提供。2種菌經(jīng)16S rDNA測(cè)序分析(上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司北京分公司)分別為Bacillussp.和Enterobactersp.細(xì)菌。

玉米秸稈和稻草均采集自延邊朝鮮族自治州延吉市延邊大學(xué)校外的農(nóng)田。玉米秸稈的水分含量為7.32%，纖維素含量為34.17%，半纖維素含量為35.04%；稻草的水分含量為6.08%，纖維素含量為30.42%，半纖維素含量為34.91%。

用于分解實(shí)驗(yàn)的富集培養(yǎng)基組成成分為:K2HPO42.0 g，(NH4)2SO41.4 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，CoCl22.0 mg，CaCl20.3 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 5.0 mg, ZnSO41.7 mg，MnSO4·H2O 1.6 mg，溶于1 L蒸餾水中。接種菌液培養(yǎng)用LB培養(yǎng)基: 酵母膏 5.0 g,蛋白胨 10.0 g，瓊脂 15.0 g，NaCl 10.0 g，溶于1 L蒸餾水中。

1.2MYB3菌株和YB1菌株在不同溫度和pH值條件下的存活數(shù)

取0.1 mL 1.48 × 105(cfu/mL)待測(cè)菌液接種到0.9 mL滅菌蒸餾水的離心管中。重復(fù)上述流程，系列稀釋到108倍菌液。吸取不同稀釋倍數(shù)的0.1 mL菌液，注入到LB平板上涂布后，把培養(yǎng)皿分別在20、30、35、40和45 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，采用CFU平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)菌落數(shù)，評(píng)價(jià)不同溫度下的生存特性。

為評(píng)價(jià)不同pH值條件下菌的存活性，首先準(zhǔn)備好LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)1 d的接種液(30 ℃)，在配好的pH值2～12的10 mL磷酸鹽緩沖溶液中接種1%體積比的菌液,在30 ℃培養(yǎng)4 h后用CFU平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)菌落數(shù)。

1.3分解酶活性的測(cè)定

為檢測(cè)2種菌分解秸稈過(guò)程中各種分解酶的活性變化，利用裝入200 mL富集培養(yǎng)基的三角瓶中加入2.5%重量比的玉米秸稈或稻草，接種1%體積比的菌，在30 ℃，100 r/min恒溫?fù)u床中培養(yǎng)，每隔1 d取樣，利用劉小杰[18]、彭強(qiáng)[19]、宋宏[20]的實(shí)驗(yàn)方法分析纖維素酶、半纖維素酶和淀粉酶的活性。

1.4纖維素、半纖維素含量的測(cè)定

含有200 mL富集培養(yǎng)基的三角瓶中加入2.5%重量比的玉米秸稈或稻草，接種1%體積比的菌，在30 ℃，100 r/min恒溫?fù)u床中培養(yǎng),分別在培養(yǎng)3，5 d 時(shí)，取樣分析纖維素、半纖維素含量。利用王金主等[21]的硫酸與重鉻酸鉀氧化法測(cè)定秸稈中纖維素含量，準(zhǔn)確稱取80 ℃烘干4 h的粉碎秸稈樣品0.10 g進(jìn)行預(yù)處理，后加入硫酸與重鉻酸鉀將其氧化，再加入碘化鉀溶液，最后用0.2 mol/L的硫代硫酸鈉溶液滴定，待溶液剛好顯藍(lán)色且半分鐘不變色時(shí)停止滴定，記錄消耗硫代硫酸鈉體積。另外做一組空白對(duì)照。

利用鹽酸水解法[21]測(cè)量秸稈中的半纖維素含量，并在最后用DNS顯色法，在OD540 nm處測(cè)吸光度，對(duì)照葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線得出還原糖含量，然后再乘以0.9即得半纖維素含量，測(cè)定還原糖的含量，最終計(jì)算含量。

2 結(jié)果與分析

2.1分解菌的生物學(xué)特性

2.1.1 不同溫度下2種菌的存活特性

MYB3菌株在20 ℃下處理的活菌數(shù)為2.23 × 106cfu/mL，在35 ℃培養(yǎng)達(dá)到最高活菌數(shù)6.3 × 106cfu/mL,隨著溫度繼續(xù)升高，菌體的活菌數(shù)逐漸下降，在40 ℃處理的活菌數(shù)為5.3 × 106cfu/mL，在45 ℃下活菌數(shù)僅為4.1×106cfu/mL(圖1)。

圖1 不同溫度下MYB3菌株的存活數(shù)

YB1菌株在20 ℃下處理的活菌數(shù)為3.08 × 109cfu/mL，在30 ℃下達(dá)到最高活菌數(shù)為4.62 × 109cfu/mL，隨著溫度升高，YB1菌株的活菌數(shù)逐漸下降，在45 ℃時(shí)，處理的活菌數(shù)為2.75 × 109cfu/mL(圖2)。

圖2 不同溫度下YB1菌株的存活數(shù)

2.1.2 不同pH值條件下MYB3菌株和YB1菌株的存活特性

在pH值為2時(shí)，無(wú)菌生存，隨著pH值的增加，MYB3菌株的活菌數(shù)有明顯增加的趨勢(shì)，在pH值為8時(shí)，活菌數(shù)達(dá)到了高峰，為25.1 × 103cfu/mL，之后隨著pH值的升高活菌數(shù)開始下降，在pH值為12時(shí)，活菌數(shù)僅為2.43 × 103cfu/mL (圖3)。

圖3 不同pH條件下MYB3菌株的存活數(shù)

YB1菌株在不同pH值條件下生存特性不同于MYB3菌株。在pH值為5時(shí)，活菌數(shù)為0.006 × 109cfu/mL，隨著pH值的增加，YB1菌株的存活數(shù)有增加趨勢(shì)，pH值為8時(shí)，急劇增加存活數(shù)，在pH值為9時(shí)存活數(shù)達(dá)到了高峰，為314 × 109cfu/mL，之后隨著pH值的升高，存活數(shù)開始下降，在pH值為12時(shí)，活菌數(shù)僅為0.163 × 109cfu/mL(圖4)。

圖4 不同pH條件下YB1菌株的存活數(shù)

2.2MYB3菌株和YB1菌株對(duì)發(fā)酵中纖維素酶、半纖維素酶以及淀粉酶活性的影響

2.2.1 MYB3菌株對(duì)秸稈發(fā)酵中酶活性變化的影響

MYB3菌株分解玉米秸稈過(guò)程中，酶活性總體呈倒U型曲線狀態(tài)(圖5)。培養(yǎng)1 d后纖維素分解酶的酶活性達(dá)到4.67 U/mL，之后逐步上升，在第3 天達(dá)到最高，酶活性為19.28 U/mL，比1 d后的纖維素酶活性高4.1倍。之后，酶活性逐步下降，在第5天時(shí)酶活性下降到5.82 U/mL。半纖維素酶也表現(xiàn)出與纖維素酶類似的變化趨勢(shì)，酶活性呈倒U型曲線狀態(tài)，但是與纖維素酶活性相比變化幅度不大。1 d后半纖維素酶的酶活性值達(dá)到3.95 U/mL，之后逐步升高，在第3天達(dá)到頂峰，酶活性為5.84 U/mL，比1 d后高1.5倍。之后，酶活性逐步下降，在第5天酶活性僅為4.04 U/mL。淀粉酶的活性變化規(guī)律表現(xiàn)出與纖維素酶類似的趨勢(shì)，但淀粉酶的活性一直處于較低水平，1 d后淀粉酶的酶活性值達(dá)到4.1 U/mL，之后逐漸升高，在第2天達(dá)到最高酶活性6.67 U/mL，僅增加1.6倍。之后逐步下降，第5天下降到4.65 U/mL。

圖5 MYB3菌株玉米秸稈發(fā)酵后分解酶的活性變化

MYB3菌株分解稻草過(guò)程中，酶活性呈倒U型曲線狀態(tài)(圖6)。培養(yǎng)1 d后纖維素分解酶活性為2.67 U/mL，之后逐步上升，在第3天達(dá)到最高，酶活性為5.63 U/mL ，比1 d后的纖維素酶活性高2.1倍。之后，酶活性逐步下降，第5天酶活性下降

到1.90 U/mL。半纖維素酶活性是1 d后達(dá)到5.56 U/mL，之后逐步上升，在第2天達(dá)到最高，酶活性為6.41 U/mL，比1 d后高1.2倍。之后，半纖維素酶活性逐步下降，第5天時(shí)降到4.81 U/mL。不同于纖維素酶和淀粉酶，半纖維素活性一直處于比較高的水平。淀粉酶的活性變化與纖維素酶活性變化基本相同，培養(yǎng)1 d后培養(yǎng)液中淀粉酶活性為3.35 U/mL，之后逐漸上升，在第3天達(dá)到最高，酶活性為5.41 U/mL，比1 d后高1.6倍。之后逐步下降，第5天下降到2.88 U/mL。

圖6 MYB3菌株稻草發(fā)酵后分解酶的活性變化

2.2.2 YB1菌株對(duì)秸稈發(fā)酵過(guò)程中酶活性變化的影響

YB1菌株分解玉米秸稈過(guò)程中，纖維素酶和半纖維素酶活性變化曲線呈倒U型(圖7)。培養(yǎng)1 d后，纖維素分解酶活性為0.92 U/mL，之后逐步升高，第3天達(dá)到最高，酶活性為7.09 U/mL，比1 d后高7.7倍。之后，酶活性逐步下降，第5天酶活性下降到1.04 U/mL。半纖維素酶活性是培養(yǎng)1 d后達(dá)到4.06 U/mL，第3天酶活性急劇上升，達(dá)到最高峰，酶活性為10.58 U/mL，比1 d后高2.6倍。之后逐步下降，第5天酶活性下降到5.41 U/mL。玉米秸稈發(fā)酵液中淀粉酶的活性一開始處于高水平，培養(yǎng)1 d后淀粉酶的酶活性為3.18 U/mL，之后酶活性一直處于下降趨勢(shì)，第5天超出了檢測(cè)限，視為0。

圖7 YB1菌株玉米秸稈發(fā)酵后分解酶的活性變化

YB1菌株分解稻草過(guò)程中，纖維素酶和半纖維素酶活性變化曲線呈倒U型(圖8)。培養(yǎng)1 d后纖維素酶活性達(dá)到3.59 U/mL，之后逐步上升，第3天酶活性急劇上升，達(dá)到最高值19.5 U/mL，比1 d后高9.4倍。之后逐步下降，第5天酶活性下降為3.92 U/mL。半纖維素酶是1 d后酶活性達(dá)到3.23 U/mL，之后逐步升高，在第4天酶活性達(dá)到最高17.17 U/mL，比1 d后高5.3倍。之后逐步下降，第5天酶活性下降到4.30 U/mL。淀粉酶活性是一直處于上升狀態(tài)，從培養(yǎng)1 d時(shí)的2.03 U/mL到第5天的10.65 U/mL，上升了5.2倍。

圖8 YB1菌株稻草發(fā)酵后分解酶的活性變化

MYB3菌株接種于玉米秸稈發(fā)酵后，生成的纖維素酶、半纖維素酶和淀粉酶活性均高于稻草發(fā)酵。說(shuō)明MYB3菌株對(duì)玉米秸稈中的纖維素、半纖維素和淀粉分解能力均高于稻草。利用YB1菌株進(jìn)行玉米秸稈和稻草發(fā)酵，在玉米秸稈發(fā)酵中半纖維素酶活性高于纖維素酶活性，稻草發(fā)酵中生成的纖維素酶，半纖維素酶和淀粉酶活性均為最高，說(shuō)明YB1菌株對(duì)稻草的分解能力高于玉米秸稈。

2.3纖維素、半纖維素分解特性

利用MYB3菌株發(fā)酵玉米秸稈和稻草時(shí)，第5天的纖維素分解率分別是39.03%和15.52%，利用YB1菌株進(jìn)行發(fā)酵時(shí)，第5天纖維素分解率是21.9%和31.53%(圖9)。說(shuō)明MYB3菌株更適合于玉米秸稈發(fā)酵，而YB1菌株對(duì)稻草的纖維素分解能力更大。結(jié)合上述酶活性變化，分析出2種菌對(duì)玉米秸稈和稻草中纖維素分解率的變化與發(fā)酵過(guò)程中生成的纖維素酶活性變化規(guī)律相一致。

圖9 不同處理3 d、5 d 后的纖維素分解率

半纖維素分解規(guī)律與纖維素分解不同，由圖10可知，發(fā)酵5 d后接種MYB3菌株的玉米秸稈和稻草中的半纖維素分解率分別為14.67%和17.61%；接種YB1菌株的玉米秸稈和稻草中半纖維素分解率為26.37%和37.44%。總的來(lái)說(shuō)，YB1菌株對(duì)秸稈中半纖維素分解能力高于MYB3菌株。這與發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的半纖維素酶活性變化規(guī)律相一致。

圖10 不同處理組3和5 d 后的半纖維素分解率

3 討論與結(jié)論

不同的溫度和pH值條件對(duì)微生物的生存起到重要的作用。該試驗(yàn)中，MYB3菌株在20 ～ 45 ℃范圍內(nèi)均可生存，其最適生存溫度為35 ℃；YB1菌株在20～45 ℃時(shí)也均可生存，其最適合生存溫度為30 ℃。MYB3菌株在pH值為3～12的范圍內(nèi)均可生存，最適生存酸堿度為pH值8時(shí)；YB1菌株在pH值為5～12范圍內(nèi)均可生存， 最適生存酸堿度為pH值為9。根據(jù)不同溫度和pH值條件下菌的生存能力分析，MYB3菌株更適合在動(dòng)物腸道內(nèi)環(huán)境下生存。

本文通過(guò)培養(yǎng)液中的纖維素、半纖維素和淀粉酶活性變化來(lái)分析MYB3菌株和YB1菌株對(duì)玉米秸稈和稻草的發(fā)酵效果。一般情況下具有生成纖維素酶的微生物對(duì)淀粉也有較好的降解作用。根據(jù)淀粉酶的活性變化可知，利用MYB3菌株進(jìn)行秸稈發(fā)酵過(guò)程中淀粉酶活性在發(fā)酵前期(1～2 d)較高，之后呈下降趨勢(shì)，這與宋宏[20]所研究的結(jié)果相一致。說(shuō)明淀粉類的非纖維素物質(zhì)在玉米秸稈發(fā)酵過(guò)程中最先被分解和利用，其代謝產(chǎn)物成為微生物在前期生長(zhǎng)所需的能量物質(zhì)。YB1菌株秸稈發(fā)酵中，淀粉酶活性的變化與MYB3菌株的變化不同，在發(fā)酵玉米秸稈中，發(fā)酵1 d時(shí)最高，之后逐步下降，在發(fā)酵稻草中，培養(yǎng)1 d時(shí)最低，之后逐步上升。這可能是2種菌的秸稈分解機(jī)制不同，玉米秸稈和稻草中淀粉的含量不同產(chǎn)生的。

任佐華[22]通過(guò)將篩選出的菌與秸稈培養(yǎng)，得出半纖維素分解酶最高值為11.03 U/mL，周亞飛[23]通過(guò)將篩選的菌種與秸稈培養(yǎng)，得出的纖維素酶和淀粉酶活性最高值為2.63和6.17 U/mL，王小娟等[24]篩選出的纖維素分解菌纖維素酶活性最高值為4.35 U/mL。本試驗(yàn)得出的纖維素酶活性最高值分別為19.28 U/mL(MYB3-玉米秸稈-3 d)和19.5 U/mL(YB1-稻草-3 d)，而半纖維素酶活性最高值為17.17 U/mL(YB1-稻草-4 d)，均高于王小娟等試驗(yàn)的結(jié)果，說(shuō)明該試驗(yàn)中可生成高效分解酶。MYB3菌株在玉米秸稈發(fā)酵中對(duì)纖維素分解起到重要作用；YB1菌株在玉米秸稈和稻草發(fā)酵中對(duì)半纖維素分解起到重要作用。纖維素酶、半纖維素酶、淀粉酶活性的變化與李偉平、潘迎捷等的[25-26]營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)胞外酶活性的影響研究中的結(jié)果相一致。MYB3菌株和YB1菌株均可生成高效纖維素、半纖維素和淀粉酶。玉米秸稈發(fā)酵中，呈倒U型曲線變化趨勢(shì)。

秸稈發(fā)酵試驗(yàn)中，結(jié)合3種分解酶活性變化，分析了纖維素和半纖維素含量。MYB3菌株和YB1菌株對(duì)秸稈發(fā)酵，纖維素分解率最高可達(dá)到39.03%(MYB3-5 d-玉米秸稈)，半纖維素分解率可達(dá)到37.44%(YB1-5 d-稻草)。一些相關(guān)報(bào)道，如李靜等[27]復(fù)合菌系的纖維素分解率為31.8%；李軼等[28]不同的預(yù)處理工藝試驗(yàn)中半纖維素分解率32.98%。對(duì)比下，MYB3菌株和YB1菌株均表現(xiàn)出高效分解纖維素、半纖維素的能力，在較廣范圍的溫度，pH值條件下可生存。MYB3菌株適合玉米秸稈發(fā)酵，YB1菌株適合稻草發(fā)酵，且MYB3菌株纖維素分解能力較好，YB1菌株半纖維素分解能力相對(duì)于MYB3菌株更優(yōu)秀。MYB3菌株可作為秸稈發(fā)酵飼料用候補(bǔ)菌劑，值得進(jìn)一步研究。

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StudyonthebiologicalcharacteristicsoftwokindsofcellulolyticandhemicellulolyticmicrobesMYB3stainandYB1stain

BAI Bing， LI Guangchun*

(AgriculturalCollegeofYanbianUniversity,YanjiJilin133002，China)

The biological characteristics of the cellulolytic and hemicellulolytic microbes MYB3 strain and YB1 stain were studied in this research, including the decomposition characteristics for the straw and the survivability in different temperature and pH value. The results showed that the optimum survival conditions is 35 ℃, pH 8 for the MYB3 stain, and 30 ℃ and pH 9 for the YB1 strain. The highest cellulase activity of the two kinds of bacteria was acquired under the fermentation condition, and the level was 19.28 U/mL (MYB3 corn stover 3 d) and 19.5 U/mL (YB1 rice straw 3 d). The highest hemicellulase activity reached 6.66 (MYB3 corn stover 2 d), 17.17 U/mL (YB1 rice straw 4 d). The highest amylase activity reached 9.84 U/mL (MYB3 corn stover 3 d), 10.65 U/mL(YB1 rice straw 5 d). The MYB3 strain was suitable for corn stover fermentation, which the cellulose and hemicellulose decomposition rate (5 d) was 39.03% and 14.67%. The YB1 strain was suitable for rice straw fermentation, which the cellulose and hemicellulose decomposition rate (5 d) were 31.53% and 37.44%.

corn stover; rice straw; cellulolytic microbe; hemicellulolytic microbe; decomposition characteristics

2017-04-15

吉林省重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目(20150204068NY)。

白冰(1992—)，女，吉林遼源人，在讀碩士，研究方向?yàn)檗r(nóng)業(yè)環(huán)境與生物質(zhì)資源綜合利用。李光春為通信作者，

E-mail：gcli@ybu.edu.cn

1004-7999(2017)03-0055-07

10.13478/j.cnki.jasyu.2017.03.010

S154.2

A