氣腫疽延邊株FliA基因真核表達載體的構(gòu)建

張永佳， 張 皓， 李成輝， 金 鑫

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002)

氣腫疽延邊株FliA基因真核表達載體的構(gòu)建

張永佳， 張 皓， 李成輝， 金 鑫*

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002)

為構(gòu)建氣腫疽延邊株FliA基因的真核表達載體PVAX1-FliA，根據(jù)Genbank氣腫疽鞭毛基因(登錄號：AB058932)的參考序列，利用Primer 5.0設(shè)計1對引物，通過PCR擴增出完整的氣腫疽延邊株FliA基因。將目的基因與pMD-19T載體連接轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α，進行測序、PCR、雙酶切鑒定陽性克隆質(zhì)粒。用回收后的基因與真核表達載體PVAX-1連接，并經(jīng)雙酶切、測序鑒定。本試驗成功構(gòu)建了鞭毛基因的重組真核表達載體PVAX1-FliA,為探討氣腫疽延邊株FliA基因的分子生物學(xué)特性和功能及免疫新途徑提供依據(jù)。

氣腫疽延邊株；FliA基因；真核表達載體；構(gòu)建

氣腫疽梭菌(Clostridiumchauvoei)是專性厭氧菌，屬細菌綱，芽孢桿菌科，梭菌屬,為反芻動物細菌性傳染病黑腿病的病原菌[1]。病料及幼齡培養(yǎng)菌革蘭氏染色一般為陽性，老齡培養(yǎng)菌呈陰性。主要感染途徑為消化道和外傷感染，病畜往往在治療前就會死亡[2]。牛是該病的主要易感動物，感染癥狀為肌肉豐滿部位，如股部、臀部、腰部、肩部、頸部及胸部等，發(fā)生氣性水腫，呈暗紅棕色到黑色，按壓有捻發(fā)音，剖檢局部呈黑色，肌肉干燥呈海綿狀，病變肌肉與正常肌肉相間，局部骨骼肌、皮下和肌間結(jié)締組織發(fā)生出血或壞死性炎癥，并產(chǎn)生氣體。病原菌可以芽胞形式存活于土壤中數(shù)十年，所以不易消滅[3]。氣腫疽梭菌曾被認為只感染牲畜，卻于2007年開始，在美國和日本出現(xiàn)人感染死亡的報道，這使得該病迅速成為諸多國家工作人員共同關(guān)注的焦點和研究熱點[4]。

吉林省延邊朝鮮族自治州敦化市、延吉市依蘭鎮(zhèn)、三道鎮(zhèn)在2006年相繼發(fā)生牛氣腫疽，而延邊地區(qū)一直是延邊黃牛飼養(yǎng)比較多的地區(qū)，一旦爆發(fā)感染氣腫疽，將會對延邊地區(qū)乃至全國畜牧業(yè)的發(fā)展造成很大的損失[5]。延邊地處長白山地區(qū)，山地面積占全州總面積的54.8%，潮濕的山谷牧場、天氣炎熱的多雨季節(jié)，都是氣腫疽病多發(fā)的環(huán)境，所以在放牧條件下的牛很容易感染氣腫疽[6]。因此,對延邊地區(qū)本地流行病株的研究有重要價值。

氣腫疽梭菌鞭毛的生長狀態(tài)為周生，主要成分為蛋白質(zhì)，由鞭毛蛋白(flagella)的亞單位組成，作為該病的重要抗原稱為鞭毛抗原或H抗原，Mayumi等在1994年發(fā)表的論文結(jié)果顯示，鞭毛抗原最少含有3個抗原決定簇，F(xiàn)liA全長1 239bp，共編碼413個氨基酸。經(jīng)三級結(jié)構(gòu)分析得知，羧基端活性區(qū)域在第960～1 188 bp；胺基端活性區(qū)域在第81～486 bp[7-10]。

1 材料與方法

1.1材料

氣腫疽延邊株，由延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實驗室完成分離并保存；DL 2 000 DNA Marker購自Newbio industry公司；Ex Taq DNA聚合酶、pMD19-T Simple 載體、DNA純化回收試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒等均購自大連寶生物工程有限公司；其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2方法

1.2.1 FliA基因引物的設(shè)計與合成

應(yīng)用Premier5.0軟件，根據(jù)氣腫疽FliA基因

序列(登錄號：AB058932)，設(shè)計1對特異性引物，預(yù)期的擴增全長為1 267 bp。上游引物5' 端加入BamHⅠ酶切位點(下劃線部分)，下游引物5' 端加入XhoⅠ酶切位點(下劃線部分)，由上海生工生物工程有限公司合成。

上游引物P1：5′-3′：CGGGATCCACCATGGCCATGATTATCAATCACAATATG；

下游引物P2：5′-3′：CCCTCGAGTTATCTTAATAATTGAAGAACA。

1.2.2 FliA基因的擴增與克隆

用細菌DNA抽提試劑盒對氣腫疽延邊株菌體DNA進行抽提。以氣腫疽延邊株DNA為模板進行FliA基因PCR擴增，PCR反應(yīng)在50 μL體系中進行：95 ℃、5 min，95 ℃、30 s，52 ℃、30 s，72 ℃、2 min，35個循環(huán)；72 ℃、10 min。將PCR產(chǎn)物純化后與pMD 19-T Simple連接，經(jīng)過PCR鑒定和酶切鑒定后將正確的陽性克隆質(zhì)粒送往上海生工生物技術(shù)有限公司測序。

1.2.3 重組表達載體

PVAX1-FliA的構(gòu)建分別用BamHⅠ、XhoⅠ對pMD-19-T-FliA和PVAX1進行雙酶切，在37 ℃環(huán)境中酶切4 h。酶切后進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測片段大小是否符合預(yù)期。用凝膠純化回收試劑盒進行目的基因的回收?；厥蘸笥肨4連接酶進行目的片段和真核表達載體的連接。將過夜連接液轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH 5α感受態(tài)細胞(100～200 μL)中，在不含Kan的LB液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)45 min，后涂布在含100 mg/L硫酸卡那霉素的LB平板上，過夜培養(yǎng)。經(jīng)小量提取的質(zhì)粒用BamHⅠ、XhoⅠ進行雙酶切，將鑒定陽性的質(zhì)粒送上海生工生物有限公司測定序列，質(zhì)粒命名為PVAX1-FliA。

2 結(jié)果與分析

2.1FliA基因擴增

以氣腫疽延邊株的基因組為模板，P1、P2為引物，擴增出片段為1 267 bp的特異性產(chǎn)物，與預(yù)期目的條帶相符(圖1)。

M：DL 2 000 DNA Marker；1～4：FliA基因的PCR擴增產(chǎn)物；5：水對照

2.2重組質(zhì)粒的PCR及酶切鑒定

重組后的pMD 19-T-FliA質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定，電泳發(fā)現(xiàn)在1 kb左右的單一目的條帶與目的基因大小一致(圖2)。PCR初步鑒定陽性，用BamHⅠ、XhoⅠ進行雙酶切，質(zhì)粒切出2 692 bp和1 267 bp 的2條目的條帶，酶切產(chǎn)物大小與預(yù)期相符(圖3)。

M：DL 2 000 DNA Marker；1：pMD 19-T-FliA PCR鑒定產(chǎn)物

M:DL 5 000 DNA Marker；1：pMD 19-T-FliA 雙酶切鑒定產(chǎn)物

2.3重組質(zhì)粒的測序

將PCR及酶切鑒定呈陽性的質(zhì)粒送上海生工生物有限公司測序，測序結(jié)果與預(yù)期相符，獲得了陽性克隆質(zhì)粒。

2.4重組表達載體的酶切鑒定

重組表達載體PVAX1-FliA用BamHⅠ、XhoⅠ限制性內(nèi)切酶酶切結(jié)果顯示，有1 267 bp和2 999 bp 2條帶，與預(yù)期產(chǎn)物片段大小相符合，初步說明載體構(gòu)建成功(圖4)。

M:DL 5 000 DNA Marker；1：PVAX1-FliA 雙酶切鑒定產(chǎn)物

2.5重組表達載體的測序

將酶切鑒定為陽性的表達載體送往上海生工有限公司進行測序，測序結(jié)果表明，成功獲得陽性重組表達質(zhì)粒PVAX1-FliA。測序結(jié)果與GenBank中的氣腫疽梭菌ATCC 10092株中FliA基因序列進行同源性分析，一致性達97%(圖5)。表明氣腫疽延邊株鞭毛蛋白基因真核表達載體PVAX1-FliA構(gòu)建成功。

圖5 FliA基因核苷酸同源性比對

3 討論與結(jié)論

鞭毛是負責大多數(shù)細菌物種運動的細胞器。一個細菌鞭毛的基本結(jié)構(gòu)可分為3部分：基體、吊鉤和鞭毛絲。鞭毛絲由鞭毛蛋白重復(fù)亞基組成的。Yoshimasa Sasaki等人在氣腫疽梭菌的染色體中發(fā)現(xiàn)至少有2個拷貝的FliA基因，發(fā)現(xiàn)C.chauvoeiFliA基因的上游和下游的序列(序列登錄號d89073)是相同的，C.chauvoei染色體上可能存在FliA基因串聯(lián)拷貝，其他梭菌屬梭菌16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育集群，如溶血梭菌，諾維梭菌，腐敗梭菌也可能隱藏著FliA基因串聯(lián)拷貝[11-13]。

唾液酸酶、鞭毛蛋白和細胞毒素是主要的氣腫疽梭菌抗原。唾液酸酶(NanA)，也被稱為神經(jīng)氨酸酶，它的分子質(zhì)量大小約為81 kD，能夠編碼氨基酸722個，屬于分子質(zhì)量為50～80 kD的多肽[14-15]。此酶在細菌、真菌、病毒、原生和后生動物被發(fā)現(xiàn)，可以通過裂解唾液酸過程中被發(fā)現(xiàn)，它的活化能最低值為13.40 kJ/mol，其中，體內(nèi)剩余物質(zhì)在40 ℃溫度下最容易被唾液酸酶裂解，該酶可作為防治黑腿病感染和反芻動物抵制病原體入侵的候選基因。鞭毛蛋白屬于非常重要的保護性抗原之一，也是引起氣腫疽發(fā)生和生物體感染的最重要的毒力因子之一，其分子質(zhì)量為46 kD，含有多量的蘇氨酸、天冬氨酸和谷氨酸，缺乏色氨酸和半胱氨酸[16-17]。氣腫疽細胞毒素A是由Joachim Frey等人經(jīng)全基因序列分析而得出的蛋白質(zhì)毒素，其中，分子質(zhì)量為33 ku的細胞毒素A蛋白都可以從氣腫疽菌株分泌而來，并且只在氣腫疽菌株中存在[18-19]。

本試驗選用最具有代表性的抗原基因成功建立了PVAX1-FliA真核重組表達載體，為后續(xù)的真核表達及免疫原性分析奠定基礎(chǔ)，以本地分離株作為研究對象，對延邊州當?shù)貧饽[疽預(yù)防工作有一定意義，為分子生物學(xué)水平上的進一步研究提供條件。

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ConstructionofeukaryoticexpressionvectorsoftheFliAgenefromClostridiumChauvoeiofYanbianStrain

ZHANG Youjia, ZHANG Hao, LI Chenghui, JIN Xin*

(AgriculturalCollegeofYanbianUniversity,YanjiJilin133002,China)

In order to construct the eukaryotic expression vector PVAX1-FliA, the complete FliA gene fromC.Chauvoeiof Yanbian Strain were amplified by PCR. A pair of primers designed by Primer 5.0 according to reference sequence standards (the accession number:AB058932) ofC.Chaucoeiflagella. The purpose gene was connected with pMD19-T vector, and then transformed intoE.coliDH5α. The positive clones were confirmed by sequencing, PCR and restriction enzyme digestion. The FliA gene was connected with PVAX1 vector, and then the recombination plasma DNA was identified by restriction enzyme digestion and sequencing. The PVAX1-FliA recombinant eukaryotic expression vector was constructed in this study. The reseach can provide evidence for features, functions of molecular biology and new ways of immunization for the study the FliA gene fromC.Chauvoeiof Yanbian Strain.

ClostridiumChauvoeiof Yanbian Strain；flagellin gene；eukaryotic expression vector；construction

2017-03-02

吉林省教育廳資助項目(吉教科合字[2014]第6號)

張永佳(1992—)，女，吉林延吉人，在讀碩士，研究方向為動物傳染病學(xué)。金鑫為通信作者，

E-mail:jinxin@ybu.edu.cn

1004-7999(2017)03-0050-05

10.13478/j.cnki.jasyu.2017.03.009

S858

A