應(yīng)用于微型PCR熒光檢測(cè)儀的光學(xué)系統(tǒng)設(shè)計(jì)

李潤(rùn)芝，楊 波，郭彩虹，袁旭軍

(1.上海理工大學(xué) 光電信息與計(jì)算機(jī)工程學(xué)院，上海 200093；2.上海科源電子科技有限公司，上海 201101)

應(yīng)用于微型PCR熒光檢測(cè)儀的光學(xué)系統(tǒng)設(shè)計(jì)

李潤(rùn)芝1，楊 波1，郭彩虹2，袁旭軍2

(1.上海理工大學(xué) 光電信息與計(jì)算機(jī)工程學(xué)院，上海 200093；2.上?？圃措娮涌萍加邢薰?，上海 201101)

針對(duì)實(shí)時(shí)微型PCR熒光檢測(cè)儀系統(tǒng)的核心-光學(xué)模塊目前仍然存在系統(tǒng)靈敏度低、能量利用率低、聚焦光斑大等問題。文中采用在原共聚焦型光路系統(tǒng)基礎(chǔ)上改進(jìn)元器件的方法，利用全反射透鏡收集準(zhǔn)直光線，采用非球面透鏡進(jìn)行光線會(huì)聚，優(yōu)化材料選擇。搭建實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，此系統(tǒng)解決了原系統(tǒng)存在的問題，檢測(cè)靈敏度達(dá)到0.01 ng/mL(熒光素)，比原系統(tǒng)提高了10倍，可在實(shí)際檢測(cè)中使用。

非成像光學(xué)；PCR熒光檢測(cè)儀；全反射準(zhǔn)直透鏡；非球面；光學(xué)系統(tǒng)設(shè)計(jì)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerize Chain Reaction,PCR)是一種在體外特異性擴(kuò)增已知序列的核酸片段的技術(shù)[1]，具有快速方便、特異性高等優(yōu)點(diǎn)，目前已在生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)工程、遺傳工程等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用，成為傳染病和遺傳病的主要檢測(cè)手段[2-3]。與傳統(tǒng)的PCR儀相比，本文所述PCR微芯片具有體積小、反應(yīng)速度快、操作簡(jiǎn)便、便于集成化等特點(diǎn)[4]。由于微型PCR儀采樣樣品少，需進(jìn)一步提高其靈敏度；為滿足其便攜性，儀器需更微型化、集成化。本文針對(duì)上述問題，采用自由曲面折反射系統(tǒng)與非球面聚焦透鏡，優(yōu)化設(shè)計(jì)光學(xué)系統(tǒng)。

1 光學(xué)系統(tǒng)設(shè)計(jì)

目前，通常用于熒光檢測(cè)的光路系統(tǒng)有：共聚焦型光路、正交型光路[5]、斜入射式和平行式光路。共聚焦型光路系統(tǒng)的激發(fā)光會(huì)聚系統(tǒng)和熒光收集準(zhǔn)直系統(tǒng)都由同一個(gè)透鏡完成，其聚焦光斑和光闌分別位于此透鏡的共軛焦點(diǎn)[6]，只有聚焦光斑處樣品發(fā)出的熒光才能到達(dá)檢測(cè)窗，其它部位非特異信號(hào)被選擇性地屏蔽，受外界雜散光影響較小，結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單。因此，本文基于共聚焦型光路進(jìn)行光學(xué)系統(tǒng)設(shè)計(jì)，提高光能利用率以獲得優(yōu)良的熒光激發(fā)效果。具體光路如圖1所示。

圖1 光學(xué)系統(tǒng)的光路結(jié)構(gòu)示意圖

圖1為光路的正視圖和樣品端的左視圖，上述熒光檢測(cè)系統(tǒng)光路設(shè)計(jì)重點(diǎn)在于光線收集準(zhǔn)直系統(tǒng)的光能收集率與準(zhǔn)直效果、光線會(huì)聚系統(tǒng)的光斑聚焦大小以及熒光發(fā)射光束的再次收集與準(zhǔn)直系統(tǒng)設(shè)計(jì)。

1.1 光線收集準(zhǔn)直系統(tǒng)設(shè)計(jì)

傳統(tǒng)的光線收集準(zhǔn)直系統(tǒng)采用折射式結(jié)構(gòu)，但是由于系統(tǒng)尺寸限制，對(duì)于大角度光線收集能力較弱，光能利用率很低。本文采用全反射透鏡，小角度光線采用二次曲面透鏡準(zhǔn)直，大角度光線通過全反射透鏡準(zhǔn)直[7-8]。全反射透鏡整體結(jié)構(gòu)如圖2所示。

圖2 全反射透鏡結(jié)構(gòu)

圖2中1為小角度光線會(huì)聚透鏡；3為收集大角度光線的全反射面。其中面1可設(shè)計(jì)為球面或者二次曲面；面2可為平面，球面，二次曲面，自由曲面[9]；面3可為二次曲面或自由曲面。本文設(shè)計(jì)第1面設(shè)計(jì)為二次曲面；第2為平面，為滿足注塑加工的工藝要求，面2需要有>2°傾斜角；面3為自由曲面。

小角度二次曲面[10]準(zhǔn)直透鏡面1根據(jù)等光程原理設(shè)計(jì)，如圖3所示。

圖3 準(zhǔn)直透鏡光路

光源位于透鏡焦點(diǎn)F處，設(shè)材料折射率為n；FA長(zhǎng)度為a；AB長(zhǎng)度為b；設(shè)B為坐標(biāo)原點(diǎn)；C點(diǎn)坐標(biāo)為(-x，-y)；F點(diǎn)出射C點(diǎn)光線經(jīng)透鏡由D點(diǎn)準(zhǔn)直出射，需滿足等光程條件，根據(jù)各點(diǎn)坐標(biāo)，可得

(1)

該曲線為二次曲線，即為準(zhǔn)直透鏡小角度折射透鏡面型截面曲線。

圖2中大角度光線全反射面3常用方法為以點(diǎn)光源為基本光源，通過斯涅爾定律以及數(shù)學(xué)方法，采用離散點(diǎn)計(jì)算法求解自由曲面面型。也可以將面2和面3組成的全反射準(zhǔn)直光路在LightTools軟件中建模，視為折反照明系統(tǒng)，優(yōu)化光路準(zhǔn)直，這樣的設(shè)計(jì)過程更為簡(jiǎn)化，充分利用軟件自動(dòng)優(yōu)化功能。

圖4 自由曲面透鏡、優(yōu)化評(píng)價(jià)函數(shù)

自由曲面全反射透鏡旋轉(zhuǎn)對(duì)稱，自由曲面母線建模采用單向貝塞爾曲線，采用布爾運(yùn)算將1、2、3面連接為整體結(jié)構(gòu)。優(yōu)化首先對(duì)NS光線準(zhǔn)直優(yōu)化，評(píng)價(jià)函數(shù)如圖4(b)所示。后對(duì)面光源，利用Light Tools光強(qiáng)切片優(yōu)化方法進(jìn)行優(yōu)化[8]。最終得到有效全反射透鏡，如圖4(a)所示。

1.2 光線會(huì)聚系統(tǒng)設(shè)計(jì)

此系統(tǒng)樣品端聚焦光斑越小其熒光激發(fā)效果越好，為矯正主要像差球差，本文采用非球面透鏡作為樣品端會(huì)聚鏡。根據(jù)其機(jī)械結(jié)構(gòu)的要求，工作距離為12 mm，受激發(fā)熒光進(jìn)入系統(tǒng)出光角度為52°。大數(shù)值孔徑的物鏡可有效提高熒光的收集效率[11]，為最大限度地接收熒光，本文將透鏡口徑設(shè)為被允許的最大尺寸12 mm。為了節(jié)省成本，降低加工難度，本文采用平凸透鏡[12]，材料為PMMA。

數(shù)值孔徑NA的計(jì)算公式如下

NA=nsinθ

(2)

其中，n表示介質(zhì)的折射率；θ表示物鏡半孔徑角[13]。

根據(jù)多項(xiàng)式非球面式(3)

(3)

其中，r2=x2+y2，c為表面極位置的曲率；K為曲面常數(shù)；A～D是第4到第10階變形項(xiàng)[13]。根據(jù)上述設(shè)計(jì)要求與思路，采用偶次非球面，消除系統(tǒng)球差，通過CODEV軟件進(jìn)行優(yōu)化可得其面型系數(shù)。

1.3 光源的選取

檢測(cè)物質(zhì)吸收激發(fā)光，受激發(fā)出特定波段熒光[13]，本文針對(duì)樣品中添加FAM熒光染料選取光源。FAM熒光素激發(fā)光波段的最大波長(zhǎng)為490 nm，發(fā)射波段的最大波長(zhǎng)為520 nm。本文采用1 mm×1 mm中心波長(zhǎng)為470 nm，波譜范圍為460 ～480 nm的LED作為激發(fā)光光源。

1.4 濾光片的選取

由于此光學(xué)系統(tǒng)的成像信號(hào)微弱，以及很多光學(xué)元件的多次散射的影響，對(duì)雜散光進(jìn)行抑制、提高系統(tǒng)的信噪比顯得尤為重要[14-15]。激發(fā)波段和發(fā)射波段具有光譜重疊區(qū)[4]，為解決光譜重疊問題，防止系統(tǒng)受到雜散光的影響，本文采用截止深度為OD6的濾光片。在激發(fā)光路中采用中心波長(zhǎng)為470 nm，帶寬20 nm的濾光片，在探測(cè)器的接收端采用中心波長(zhǎng)為525 nm、帶寬20 nm的發(fā)射濾光片，減少雜散光對(duì)系統(tǒng)的影響。

2 基于Light Tools軟件的模擬仿真

根據(jù)上述理論與尺寸需求，具體搭建PCR熒光檢測(cè)儀光路，建立透鏡模型，設(shè)置合理菲涅爾損耗屬性，在樣品處添加1 mm×1 mm接收器。透鏡口徑均<20 mm，熒光激發(fā)光路總長(zhǎng)60 mm，優(yōu)化后整個(gè)光學(xué)模組的尺寸為：60 mm×50 mm×25 mm。最后進(jìn)行光線追跡。

圖5 優(yōu)化后模擬光路的正視圖和左視圖

圖6 原系統(tǒng)模擬光路的正視圖和左視圖

圖7 樣品端光斑圖

圖5為本文設(shè)計(jì)PCR熒光檢測(cè)器模擬光路圖，圖6為原系統(tǒng)光路圖。圖6中容易發(fā)現(xiàn)大角度光線通過折射系統(tǒng)，收集準(zhǔn)直能力較弱，光能利用率低且雜光干擾較多，降低系統(tǒng)靈敏度。圖5中優(yōu)化后系統(tǒng)準(zhǔn)直度顯著提高且大角度光線通過全反射透鏡被收集。圖7(a)為優(yōu)化后系統(tǒng)樣品光斑，明顯小于圖7(b)原系統(tǒng)樣品光斑。證明自由曲面與非球面配合準(zhǔn)直的光路系統(tǒng)有效優(yōu)化系統(tǒng)由于光源尺寸造成的慧差等軸外像差，同時(shí)進(jìn)一步矯正球差，聚焦光斑縮小，聚焦效果顯著改善。設(shè)置系統(tǒng)的光源光通量為100 lm，樣品端接收的能量為92.74 lm，光能利用率>92%，較原系統(tǒng)提高2倍。

3 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證與數(shù)據(jù)分析

校準(zhǔn)光路使光斑居于透鏡中心，如圖11所示，確保光路準(zhǔn)直。將光學(xué)模塊放到PCR檢測(cè)儀中，設(shè)置零位固定安裝，進(jìn)行發(fā)光測(cè)試。將光強(qiáng)統(tǒng)一設(shè)置為200，樣品分為高中低3種濃度，實(shí)驗(yàn)時(shí)間設(shè)置為60 min，本文設(shè)計(jì)方案與傳統(tǒng)方案的結(jié)果如圖8所示。

圖8 熒光檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由圖8的實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖可以看出：在相同光強(qiáng)200的設(shè)置下，傳統(tǒng)熒光檢測(cè)器低濃度值熒光AD[5]值為6 600，本文設(shè)計(jì)的光學(xué)系統(tǒng)低濃度熒光AD值為17 000，中濃度和高濃度的數(shù)值已經(jīng)飽和到達(dá)72 000。通過實(shí)驗(yàn)證明：整個(gè)系統(tǒng)的靈敏度提高了10倍，達(dá)到0.01 ng/mL，充分說明本系統(tǒng)的靈敏度顯著提高，光能利用率高、激發(fā)熒光效果好，系統(tǒng)穩(wěn)定性較強(qiáng)。

4 結(jié)束語

光學(xué)設(shè)計(jì)模塊是PCR熒光檢測(cè)儀重要研究方向之一。本文基于共聚焦型光路系統(tǒng)，設(shè)計(jì)折反系統(tǒng)(全反射透鏡)收集準(zhǔn)直光線，比傳統(tǒng)折射系統(tǒng)提高光能利用率2倍以上；利用非球面透鏡消除球差、慧差等像差影響，有效縮小聚焦光斑。解決傳統(tǒng)系統(tǒng)靈敏度低、能量利用率低、聚焦光斑大等問題，可用于實(shí)際檢測(cè)。

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Optical System Design of Miniature PCR Fluorescence Detector

LI Runzhi1,YANG Bo1,GUO Caihong2,YUAN Xujun2

(1.School of Optical-Electrical and Computer Engineering,University of Shanghai for Science and Technology,Shanghai 200093,China;2.Shanghai Cohere Electronics Technology Co.,Ltd,Shanghai 201101,China)

There are still some problems in the core optical module of real time miniature PCR fluorescent detector system such as: low sensitivity of the system,low energy utilization rate,and big focal spot etc. Confocal optical system is still used in this paper and optimization designs of the original optical path system are adopted based on the fact of production; for instance,replacing the traditional lens with TIR Collimating Lens; focusing the optical path by using the aspheric lens,and improving the selection of lens materials. Finally,the test platform is built,experimental results verify that the sensitivity of the new system is increased by 10 times than before,it reaches 0.01ng/ml(fluorescein) and the new system can be used in practical production.

non imaging optics; PCR fluorescence detector; TIR collimating lens; aspheric surface; optical system design

TN247

A

1007-7820(2017)11-034-04

2016- 12- 22

國(guó)家重大科學(xué)儀器設(shè)備開發(fā)專項(xiàng)基金(2013YQ470765)

李潤(rùn)芝(1991-)，女，碩士研究生。研究方向：光學(xué)設(shè)計(jì)等。楊波(1977-)，男，博士，副教授。研究方向：光學(xué)設(shè)計(jì)。

10.16180/j.cnki.issn1007-7820.2017.11.010