魚鰾膠原肽抗氧化穩(wěn)定性研究

鄭婷婷 - 涂宗財, -, 唐平平 - 張 露 沙小梅 - 王 輝

(1. 江西師范大學(xué)功能有機小分子教育部重點實驗室，江西 南昌 330022；2. 江西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江西 南昌 330022；3. 南昌大學(xué)食品與科學(xué)技術(shù)國家重點實驗室，江西 南昌 330047) (1. Key Laboratory of Functional Small Organic Molecule, Jiangxi Normal University, Nanchang, Jiangxi 330022, China; 2. Ministry of Education, College of Life Science, Jiangxi Normal University, Nanchang, Jiangxi 330022, China; 3. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang, Jiangxi 330047, China)

魚鰾膠原肽抗氧化穩(wěn)定性研究

鄭婷婷1,2ZHENGTing-ting1,2涂宗財1,2,3TUZong-cai1,2,3唐平平1,2TANGPing-ping1,2張 露1,2ZHANGLu1,2沙小梅1,2SHAXiao-mei1,2王 輝3WANGHui3

(1. 江西師范大學(xué)功能有機小分子教育部重點實驗室，江西 南昌 330022；2. 江西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江西 南昌 330022；3. 南昌大學(xué)食品與科學(xué)技術(shù)國家重點實驗室，江西 南昌 330047) (1.KeyLaboratoryofFunctionalSmallOrganicMolecule,JiangxiNormalUniversity,Nanchang,Jiangxi330022,China; 2.MinistryofEducation,CollegeofLifeScience,JiangxiNormalUniversity,Nanchang,Jiangxi330022,China; 3.StateKeyLaboratoryofFoodScienceandTechnology,NanchangUniversity,Nanchang,Jiangxi330047,China)

以DPPH自由基、OH自由基清除能力和還原力為評價指標，探究pH、溫度、食品配料、金屬離子、防腐劑以及體外模擬胃、腸道消化對魚鰾膠原肽抗氧化穩(wěn)定性的影響。結(jié)果表明：魚鰾膠原肽在酸性環(huán)境中抗氧化活性保持得較好，在堿性條件下喪失較快；魚鰾膠原肽具有較強的耐熱性，高溫不會降低其抗氧化活性；蔗糖、葡萄糖以及防腐劑(苯甲酸鈉和山梨酸鉀)對魚鰾膠原肽的活性影響不明顯，但添加高濃度的食鹽會降低魚鰾膠原肽的抗氧化活性；金屬離子Zn2+、Cu2+對魚鰾膠原肽抗氧化活性的影響較大，Ca2+的影響較小，K+、Mg2+無顯著影響；模擬胃腸道消化對魚鰾膠原肽抗氧化活性無顯著影響。

魚鰾；膠原肽；抗氧化活性；穩(wěn)定性

肽類物質(zhì)是安全性較高的一類抗氧化劑，目前有關(guān)抗氧化肽的研究也越來越多，但多集中于抗氧化肽的制備[1-2]、分離純化和多肽序列鑒定方面[3-4]，而關(guān)于多肽在加工、貯藏過程中抗氧化穩(wěn)定性的研究相對較少。目前，已有少部分生物活性肽作為保健食品與藥物實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)[5]。多肽類物質(zhì)在不同的加工貯藏條件下，如高溫、酸堿、金屬離子、食品配料、防腐劑等易發(fā)生水解、氧化、脫酰胺、環(huán)化等化學(xué)反應(yīng)，導(dǎo)致多肽結(jié)構(gòu)和性質(zhì)變化，造成活性降低甚至缺失[6-7]。You等[8]研究發(fā)現(xiàn)，多肽與糖發(fā)生美拉德反應(yīng)可以增強其抗氧化活性。另外，多肽被加工成功能食品或藥物后，最后還是要在人體環(huán)境中發(fā)揮作用，人體消化環(huán)境較為復(fù)雜，消化過程中多肽活性的穩(wěn)定性對其能否發(fā)揮作用至關(guān)重要。已有研究[9-10]報道，多肽在模擬胃腸道消化過程中，抗氧化活性會發(fā)生改變。因此研究其在胃液和腸液的抗氧化穩(wěn)定性具有重要意義。

魚鰾富含膠原蛋白，含量高達80%以上，是膠原蛋白肽制備的良好原料[11]。課題組[12]前期研究表明魚鰾膠原肽具有較強的抗氧化活性，但目前還沒有關(guān)于加工貯藏條件對魚鰾膠原肽抗氧化活性影響的相關(guān)研究報道。本試驗以DPPH自由基清除活性、OH自由基清除活性、還原力3種為評價指標，研究pH、溫度、食品配料、金屬離子、防腐劑和體外模擬胃腸道消化對魚鰾膠原肽抗氧化穩(wěn)定性的影響，為魚鰾膠原肽功能性食品或者抗氧化劑的開發(fā)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

草魚魚鰾：平均長度(20.3±1.4) cm、質(zhì)量(15.29±2.50) g，南昌市鄱陽湖農(nóng)牧漁產(chǎn)業(yè)發(fā)展股份有限公司；

胰蛋白酶(2.67×105U/g )、胃蛋白酶：(3 000 U/g )：江蘇銳陽生物技術(shù)有限公司；

DPPH：分析純，美國Sigma公司；

葡萄糖、NaCl、蔗糖、KCl、無水CaCl2、MgSO4、ZnSO4、苯甲酸鈉、山梨酸鉀、95%乙醇、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、FeSO4、水楊酸、H2O2、K3FeCN6、FeCl3：分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器和設(shè)備

酶標儀：synergH1型，美國伯騰儀器有限公司；

電子天平：ESJ200-4型，沈陽龍騰電子有限公司；

冷凍干燥機：LGJ-1D-80型，北京亞泰科隆儀器技術(shù)有限公司；

紫外可分光光度計：UV-3200型，上海美譜達儀器有限公司；

數(shù)顯恒溫水浴鍋：HH-8型，國華電器有限公司；

pH計：DELTA 320型，梅特勒-托利多儀器有限公司；

離心機：5430R型，艾本德中國有限公司。

1.2 方法

1.2.1 魚鰾膠原肽的制備工藝

草魚魚鰾→解凍清洗→剪碎(1 cm×1 cm)→0.15% NaOH浸泡1 h→0.15%硫酸浸泡1 h→中性80 ℃熱水浸提2 h→冷凍干燥(樣品溫度-5 ℃，冷阱溫度-80 ℃，真空度1.0 Pa)得魚鰾明膠→調(diào)節(jié)底物(濃度3.09%、溫度50 ℃和pH 6.0)→加風(fēng)味蛋白酶酶解79.34 min→沸水浴滅酶10 min→7 500 r/min離心10 min→上清液過45 μm水相膜后冷凍干燥(樣品溫度-5 ℃，冷阱溫度-80 ℃，真空度1.0 Pa)→魚鰾膠原肽粉

1.2.2 pH對魚鰾膠原肽抗氧化穩(wěn)定性的影響 將魚鰾膠原肽配制成20 mg/mL的溶液，用適宜濃度的HCl和NaOH溶液將魚鰾膠原肽溶液pH分別調(diào)至2.0，4.0，6.0，8.0，10.0，12.0，室溫下放置2 h后將溶液pH調(diào)回中性7.0。分別測定魚鰾膠原肽的DPPH自由基清除能力、OH自由基清除能力和還原力。

1.2.3 溫度對魚鰾膠原肽抗氧化穩(wěn)定性的影響 將魚鰾膠原肽配制成20 mg/mL的溶液，分別在20，40，60，80，100 ℃水浴條件下保持2 h，再用冰水快速冷卻至室溫[(25±2) ℃]。分別測定魚鰾膠原肽的DPPH自由基清除能力、OH自由基清除能力和還原力。

1.2.4 食品配料對魚鰾膠原肽抗氧化穩(wěn)定性的影響 將魚鰾膠原肽配制成20 mg/mL的溶液，分別單獨添加不同溶度(2%，4%，6%，8%，10%)的 NaCl、葡萄糖、蔗糖，混合均勻后室溫放置2 h。分別以相應(yīng)濃度的 NaCl、葡萄糖、蔗糖的去離子水溶液為對照，排除NaCl、葡萄糖、蔗糖對魚鰾膠原肽抗氧化檢測的干擾。分別測定魚鰾膠原肽的DPPH自由基清除能力、OH自由基清除能力和還原力。

1.2.5 金屬離子對魚鰾膠原肽抗氧化穩(wěn)定性的影響 將魚鰾膠原肽配制成20 mg/mL的溶液，分別添加不同濃度(1，2，3，4，5 mmol/L)的K+、Ca2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+離子，室溫放置2 h。以相應(yīng)濃度K+、Ca2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+離子的去離子水溶液為對照，排除金屬離子本身對魚鰾膠原肽抗氧化檢測的干擾。分別測定魚鰾膠原肽的DPPH自由基清除能力、OH自由基清除能力和還原力。

1.2.6 防腐劑對魚鰾膠原肽抗氧化穩(wěn)定性的影響 將魚鰾膠原肽配制成20 mg/mL的溶液，分別添加0.05%，0.10%，0.15%，0.20%，0.25%的苯甲酸鈉和山梨酸鉀，混合均勻后室溫放置2 h，以相應(yīng)濃度的苯甲酸鈉和山梨酸鉀的去離子水溶液為對照，排除防腐劑對魚鰾膠原肽抗氧化檢測的干擾。分別測定魚鰾膠原肽的DPPH自由基清除能力、OH自由基清除能力和還原力。

1.2.7 模擬胃、腸道消化對魚鰾膠原肽抗氧化穩(wěn)定性的影響

在37 ℃用胃蛋白酶酶解模擬胃部消化，再用胰液素酶解模擬腸道消化。配制20 mg/mL的魚鰾膠原肽溶液用1 mol/L的HCl調(diào)pH至 2.0，按酶與底物比([E]/[S])為1%加入胃蛋白酶，震蕩酶解2 h。酶解結(jié)束后，沸水浴10 min滅酶，快速冷卻至室溫后，7 500 r/min離心15 min，取上清液分為2份，一份用于抗氧化活性測定，一份用于模擬腸道消化。用0.9 mol/L的NaHCO3溶液將pH調(diào)為5.3，再用NaOH進一步將pH調(diào)至7.5，按[E]/[S]為1%加入胰液素，震蕩酶解2 h，沸水浴10 min滅酶，測定抗氧化活性。分別以相同條件未加魚鰾膠原肽的胃蛋白酶、胰液素滅活溶液為對照，排除滅活后胃蛋白酶、胰液素的干擾[13-14]。

1.2.8 DPPH自由基清除能力的測定 根據(jù)文獻[15]修改如下：用95%乙醇配制0.2 mmol/L DPPH溶液，各取100 μL魚鰾膠原肽溶液與DPPH溶液于96孔酶標板混合均勻，常溫避光反應(yīng)30 min，于517 nm處測定吸光值(A1)。以100 μL 95%乙醇代替DPPH溶液與100 μL去離子水反應(yīng)為空白組(A0)，以100 μL DPPH溶液與100 μL去離子水反應(yīng)為對照組(A2)。按式(1)計算DPPH自由基清除率。

(1)

式中：

E——DPPH自由基清除率，%；

A2——DPPH與去離子水反應(yīng)的吸光值；

A1——DPPH與樣品反應(yīng)的吸光值；

A0——95%乙醇與樣品反應(yīng)的吸光值。

1.2.9 OH自由基清除能力的測定 根據(jù)文獻[16]修改如下：取1.0 mL魚鰾膠原肽溶液依次加入2 mL 1.8 mmol/L FeSO4、1.5 mL 1.8 mmol/L 水楊酸—乙醇和0.1 mL 8.8 mmol/L H2O2，37 ℃水浴30 min。反應(yīng)結(jié)束后取200 μL混合液于96孔酶標板，于510 nm處測定樣品吸光值(Ai)，以去離子代替樣品液的吸光值(A0)。按式(2)計算OH自由基清除率。

(2)

式中：

E——OH自由基清除率，%；

Ai——樣品反應(yīng)的吸光值；

A0——去離子水代替樣品反應(yīng)的吸光值。

1.2.10 還原力的測定 根據(jù)文獻[17]修改如下：取魚鰾膠原肽溶液2 mL、磷酸鹽緩沖液(0.2 mol/L，pH 6.6)2 mL、1% K3FeCN6溶液2 mL，混合均勻后50 ℃水浴20 min，反應(yīng)結(jié)束后加入10%三氯乙酸2 mL，3 000 r/min離心10 min，溶液由黃色變?yōu)樗{色，于700 nm處測定吸光值。

1.2.11 活性保持率的測定 分別測定魚鰾膠原肽處理前抗氧化活性和處理后的抗氧化活性，按式(3)計算活性保持率。

(3)

式中：

R——活性保持率，%；

A0——處理前抗氧化活性；

A1——處理后的抗氧化活性。

2 結(jié)果與討論

2.1 pH對魚鰾膠原肽抗氧化穩(wěn)定性的影響

由圖1可知，在pH為2～6時，魚鰾膠原肽的DPPH、OH自由基清除活性保持率較高，但在pH為8～12時，活性保持率下降迅速，pH為12時最低，DPPH自由基、OH自由基清除活性保持率均低于10%，失去大部分活性，可能是堿性條件下，多肽易發(fā)生消旋作用，造成一些L-型氨基酸變成D-型氨基酸，進而引起極性和空間位阻等結(jié)構(gòu)性質(zhì)變化，降低生物活性[18]。因此，酸性條件有利于魚鰾膠原肽DPPH自由基、 OH自由基清除活性保持，強堿環(huán)境容易造成活性損失。Zhang等[19]研究大黃魚肉多肽的抗氧化穩(wěn)定性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)多肽在酸性條件活性較高，堿性環(huán)境活性易損失，與本研究結(jié)果一致。當pH為2～12時，魚鰾膠原肽還原力活性保持率較高，并且pH對其無顯著影響(P>0.05)，可能是還原力主要反映的是得失電子和還原能力，與酸堿環(huán)境無關(guān)[20]。此結(jié)果與吳靜等[21]的研究結(jié)果一致。綜上所述，在加工利用過程中，建議魚鰾膠原肽在偏酸性中使用，避免處于強堿性環(huán)境下。

圖1 pH對魚鰾膠原肽抗氧化活性的影響Figure 1 Effect of pH on antioxidantactivity of collagen peptides from swimming bladders

2.2 溫度對魚鰾膠原肽抗氧化穩(wěn)定性的影響

高溫和熱處理是食品加工常用的手段之一，在溫度較高的條件下，功能性食品是否能保持高活性，是評價其能否作為具有商業(yè)潛力產(chǎn)品的重要因素之一[22]。由圖2可知，在20～80 ℃時，DPPH自由基清除活性保持率和還原力保持率基本無明顯變化(P>0.05)，且100 ℃時，2種活性保持率均有顯著提高(P>0.05)。這可能是高溫可以在一定程度改變多肽的空間構(gòu)象，進而使活性發(fā)生一定的變化[23]。而溫度對魚鰾膠原肽OH自由基清除活性保持率無顯著影響(P>0.05)，活性保持率均在97.73%以上。綜上所述，魚鰾膠原肽具有很好的耐熱性，高溫不會降低其抗氧化活性，100 ℃高溫時，DPPH自由基清除活性和還原力反而有所升高。

圖2 溫度對魚鰾膠原肽抗氧化活性的影響Figure 2 Effect of temperature onantioxidant activity of collagen peptides from swimming bladders

2.3 食品配料對魚鰾膠原肽抗氧化穩(wěn)定性的影響

由圖3(a)、(b)可知，添加2%～10%的葡萄糖和蔗糖對魚鰾膠原肽的DPPH、OH自由基清除活性保持率沒有顯著影響(P>0.05)，可能是在室溫、短時(2 h)條件下，葡萄糖和蔗糖與多肽相互作用較弱，發(fā)生美拉德反應(yīng)程度也非常低。此結(jié)果與李致瑜等[24]的研究一致。由圖3(c)可知，隨著葡萄糖濃度的增大，還原力保持率也逐漸升高，當葡萄糖濃度10%時，還原力相比未添加葡萄糖的樣品增加了15%；蔗糖的添加對魚鰾膠原肽還原力無顯著影響(P>0.05)。NaCl濃度低于4%，魚鰾膠原肽的抗氧化活性保持率依然較高，損失較少，但隨著NaCl濃度的提高，魚鰾膠原肽的DPPH、OH自由基清除活性保持率和還原力保持率均逐漸下降，而且NaCl濃度對OH自由基清除活性保持率的影響最大。當NaCl濃度10%時，活性保持率降低為62.61%；DPPH自由基清除活性保持率次之，降低為72.10%；還原力保持率最小，活性保持率為81.02%。這可能是鹽離子電荷屏蔽效應(yīng)中和肽的靜電排斥力，進而導(dǎo)致其聚集凝結(jié)，降低了魚鰾膠原肽的作用濃度及抗氧化活性[19]。綜上所述，在利用魚鰾膠原肽作功能食品加工時，蔗糖和葡萄糖的添加，對魚鰾膠原肽的抗氧化活性沒有影響，而應(yīng)避免添加高濃度的食鹽。

圖3 食品配料對魚鰾膠原肽DPPH自由基清除活性、OH自由基清除活性、還原能力的影響

Figure 3 Effect of food auxiliary on DPPH radical scavening activity, OH radical scavening activity, reducing power of collagen peptides from swimming bladders

2.4 金屬離子對魚鰾膠原肽抗氧化穩(wěn)定性的影響

一些金屬離子(如Ca2+，K+，Cu2+，Mg2+，Zn2+等)廣泛存在食品體系中，適量攝入金屬離子有利于維持機體的生理平衡，但是過量的金屬離子易損害機體健康。因此，研究金屬離子對魚鰾膠原肽的抗氧化穩(wěn)定性具有重要意義。由圖4可知，K+和Mg2+對魚鰾膠原肽的DPPH自由基清除活性無顯著影響(P>0.05)，隨著濃度增大，Ca2+對DPPH自由基清除活性保持率有小幅降低，但活性仍然保持在91.78%以上。Ca2+，K+，Mg2+對魚鰾膠原肽OH自由基清除活性和還原力保持率無顯著影響。Cu2+和Zn2+會顯著降低魚鰾膠原肽的抗氧化活性，其DPPH、OH自由基清除能力和還原力保護率均有不同程度的降低，還原力保持率降低最多，DPPH 自由基清除活性次之。當Cu2+和Zn2+濃度為5 mmol/L 時，還原力分別降低至28.67%和18.92%，可能是Cu2+和Zn2+能和魚鰾膠原肽發(fā)生螯合作用，形成螯合物，導(dǎo)致抗氧活性降低[25]。此結(jié)果與胡曉等[26]研究的金屬離子對鳶烏賊肽的抗氧化穩(wěn)定性結(jié)果一致。綜上所述，金屬離子Zn2+、Cu2+對魚鰾膠原肽抗氧化穩(wěn)定性的影響較大，Ca2+的影響較小，K+、Mg2+無顯著影響，加工過程中應(yīng)避免魚鰾膠原肽與銅和鋅制器皿接觸，防止抗氧化活性損失。

圖4 金屬離子對魚鰾膠原肽DPPH自由基清除能力、OH自由基清除活性、還原能力的影響

Figure 4 Effect of metal ions on DPPH radical scavening activity, OH radical scavening activity, reducing power of collagen peptides from swimming bladders

2.5 防腐劑對魚鰾膠原肽抗氧化穩(wěn)定性的影響

防腐劑被廣泛用于食品加工以防止產(chǎn)品發(fā)生腐敗，延長產(chǎn)品的貨架期。因此，研究防腐劑對魚鰾膠原肽抗氧化穩(wěn)定性的影響十分有必要。苯甲酸鈉、山梨酸鉀對魚鰾膠原肽抗氧化活性保持率的變化規(guī)律見圖5。苯甲酸鈉和山梨酸鉀對魚鰾膠原肽DPPH自由基清除活性保持率有一定的升高，但各濃度之間無顯著差異(P>0.05)，而對OH自由基清除活性和還原力保持率無顯著影響(P>0.05)。趙明謀等[27]發(fā)現(xiàn)苯甲酸鈉對藍圓鲹多肽抗氧化穩(wěn)定性的影響較小，而且隨著濃度增加，變化也不明顯。因此，在加工魚鰾膠原肽時，合理范圍使用防腐劑山梨酸鉀和苯甲酸鈉對其抗氧化活性無顯著影響。

2.6 模擬胃、腸道消化對魚鰾膠原肽抗氧化穩(wěn)定性的影響

由圖6可知，胃蛋白酶消化2 h后，魚鰾膠原肽的DPPH、OH自由基清除活性和還原力保持率變化均不顯著(P>0.05)。經(jīng)腸道酶胰蛋白酶消化2 h后，魚鰾膠原肽的抗氧化活性保持率無明顯變化(P>0.05)，說明魚鰾膠原肽具有很好的消化穩(wěn)定性，胃腸道酶對其沒有影響。

圖5 防腐劑對魚鰾膠原肽DPPH自由基清除能力、OH自由基清除活性、還原能力的影響

Figure 5 Effect of preservatives on DPPH radicalscavening activity, OH radical scavening activity, reducing power of collagen peptides from swimming bladders

圖6 體外模擬胃腸道消化對魚鰾膠原肽抗氧化活性的影響

Figure 6 Effect ofsimulated gastrointestinal digestion in vitro on antioxidant activity of collagen peptide from swimming bladder

3 結(jié)論

本試驗以DPPH自由基清除活性、OH自由基清除活性和還原力3種抗氧化模型為評價體系，研究多種加工貯藏條件和模擬胃腸道消化對魚鰾膠原肽抗氧化穩(wěn)定性的影響。結(jié)果表明，魚鰾膠原肽對堿的耐受性差，中性偏酸性條件有利于其抗氧化活性的保持；耐熱性好，高溫不會降低其活性；金屬離子Zn2+、Cu2+對魚鰾膠原肽抗氧化穩(wěn)定性的影響較大，Ca2+的影響較小，K+、Mg2+無顯著影響。蔗糖和葡萄糖的添加對魚鰾膠原肽的抗氧化活性影響不顯著，而食鹽會降低其活性；防腐劑苯甲酸鈉、山梨酸鉀對魚鰾膠原肽抗氧化活性的影響較小；魚鰾膠原肽具有較好的耐消化性，胃腸道酶對其抗氧化活性無顯著影響。因此，魚鰾膠原肽具有較好的抗氧化穩(wěn)定性，本研究可為魚鰾膠原肽合理加工利用提供一定的理論依據(jù)。后續(xù)可對魚鰾膠原肽進行分離純化，深入研究魚鰾膠原肽的抗氧化組分。

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Studyonantioxidationstabilityofcollagenpeptidespreparedfromswimmingbladders

The change of scavenging activity on DPPH radical, hydroxyl free radical, and reducing power capacity was selected as the index to investigate the effects of pH, temperature, sucrose, preservatives, metal ions and gastrointestinal digestion in vitro on the antioxidant stability of collagen peptides from swimming bladders. The results showed that collagen peptides from swimming bladders kept high activity in acidity environment but lose it in alkaline condition; however, the strong heat-resistance was found; sucrose, NaCl and preservatives (sodium Benzoate and Sodium sorbate) had little effects on its antioxidation stability, but high levels of salt made it lost antioxidation stability partially. Metal ions Cu2+and Zn2+had a larger effect on the antioxidant stability of collagen peptides from swimming bladders than Ca2+, and Mg2+and K+showed no significant effect. collagen peptides from swimming bladders had a good digestibility, and gastrointestinal enzymes had no effects on its activity.

swimming bladders; collagen peptides; antioxidant activity; stability

江西省重大生態(tài)安全問題協(xié)同創(chuàng)新中心項目(編號：JXS-EW-00)；江西省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(編號：JXARS-03)

鄭婷婷，女，江西師范大學(xué)在讀碩士研究生。

涂宗財(1965—)，男，江西師范大學(xué)教授，博士。

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2017—05—02

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.09.003